ГОСТ Р 54653-2011. Национальный стандарт Российской Федерации. Удобрения органические. Методы микробиологического анализа
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 13.12.2011 № 802-ст)
Примечание
Документ введен в действие с 01.01.2013.
Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. № 802-ст
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Organic fertilizers. Methods of microbiological analysis
Дата введения 1 января 2013 года
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт органических удобрений и торфа» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИИОУ» Россельхозакадемии) и Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИИСХМ» Россельхозакадемии)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 025 «Качество почв, грунтов и органических удобрений»
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. № 802-ст
Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. № 162-ФЗ «О стандартизации в Российской Федерации». Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на органические удобрения и устанавливает методы микробиологического анализа.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 61 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 83 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия
ГОСТ 171 Дрожжи хлебопекарные прессованные. Технические условия <1>
<1> Действует ГОСТ Р 54731-2011.
ГОСТ 245 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия
ГОСТ 427 Линейки измерительные металлические. Технические условия
ГОСТ 435 Реактивы. Марганец (II) сернокислый 5-водный. Технические условия
ГОСТ 450 Кальций хлористый технический. Технические условия
ГОСТ 480 Пластины асбестоцеллюлозные фильтрующие и стерилизующие. Технические условия
ГОСТ 490 Кислота молочная пищевая. Технические условия
ГОСТ 828 Натрий азотнокислый технический. Технические условия
ГОСТ 1341 Пергамент растительный. Технические условия
ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 1820 Спички. Технические условия
ГОСТ 2156 Натрий двууглекислый. Технические условия
ГОСТ 2493 Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия
ГОСТ 3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3145 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия
ГОСТ 3652 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия
ГОСТ 3758 Реактивы. Алюминий сернокислый 18-водный. Технические условия
ГОСТ 3760 Реактивы. Аммиак водный. Технические условия
ГОСТ 3769 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия
ГОСТ 3773 Реактивы. Аммоний хлористый. Технические условия
ГОСТ 4144 Реактивы. Калий азотистокислый. Технические условия
ГОСТ 4145 Реактивы. Калий сернокислый. Технические условия
ГОСТ 4147 Реактивы. Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия
ГОСТ 4148 Реактивы. Железо (II) сернокислое 7-водное. Технические условия
ГОСТ 4165 Реактивы. Медь (II) сернокислая 5-водная. Технические условия
ГОСТ 4174 Реактивы. Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия
ГОСТ 4198 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия
ГОСТ 4217 Реактивы. Калий азотнокислый. Технические условия
ГОСТ 4232 Реактивы. Калий йодистый. Технические условия
ГОСТ 4233 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4234 Реактивы. Калий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 4517 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе
ГОСТ 4523 Реактивы. Магний сернокислый 7-водный. Технические условия
ГОСТ 4529 Реактивы. Цинк хлористый. Технические условия
ГОСТ 4530 Реактивы. Кальций углекислый. Технические условия
ГОСТ 4919.1 Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления растворов индикаторов
ГОСТ 5538 Реактивы. Калий лимоннокислый 1-водный. Технические условия
ГОСТ 5556 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия
ГОСТ 5821 Реактивы. Кислота сульфаниловая. Технические условия
ГОСТ 5833 Реактивы. Сахароза. Технические условия
ГОСТ 5845 Реактивы. Калий-натрий виннокислый 4-водный. Технические условия
ГОСТ 6038 Реактивы. D-глюкоза. Технические условия
ГОСТ 6259 Реактивы. Глицерин. Технические условия
ГОСТ 6419 Реактивы. Магний углекислый основной водный. Технические условия
ГОСТ 6672 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 6691 Реактивы. Карбамид. Технические условия
ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ ISO 7218 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 8253 Мел химический осажденный. Технические условия
ГОСТ 9147 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 9284 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 9412 Марля медицинская. Общие технические условия
ГОСТ 9656 Реактивы. Кислота борная. Технические условия
ГОСТ 9871 Термометры стеклянные ртутные электроконтактные и терморегуляторы. Технические условия
ГОСТ 10163 Реактивы. Крахмал растворимый. Технические условия
ГОСТ 10354 Пленка полиэтиленовая. Технические условия
ГОСТ 10444.1 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе
ГОСТ 10929 Реактивы. Водорода пероксид. Технические условия
ГОСТ 10931 Реактивы. Натрий молибденовокислый 2-водный. Технические условия
ГОСТ ISO 11133-1 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории <1>
ГОСТ ISO 11133-2 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред <1>
<1> Действует ГОСТ ISO 11133-2016 «Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред».
ГОСТ 12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13805 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия
ГОСТ 14919 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 15530 Парусины и двунитки. Общие технические условия
ГОСТ 16317 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 17151 Посуда хозяйственная из листового алюминия. Общие технические условия
ГОСТ 17206 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 17308 Шпагаты. Технические условия
ГОСТ 17626 Казеин технический. Технические условия <1>
<1> Действует ГОСТ Р 51463-99 «Казеины сычужные и казеинаты. Метод определения массовой доли золы».
ГОСТ 17811 Мешки полиэтиленовые для химической продукции. Технические условия
ГОСТ 18963 Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа <2>
<2> Действует ГОСТ 31942-2012 (ISO 19458:2006) «Вода. Отбор проб для микробиологического анализа».
ГОСТ 19126 Инструменты медицинские металлические. Общие технические условия
ГОСТ 19808 Стекло медицинское. Марки
ГОСТ 19881 Анализаторы потенциометрические для контроля pH молока и молочных продуктов. Общие технические условия
ГОСТ 19906 Нитрит натрия технический. Технические условия
ГОСТ 20083 Дрожжи кормовые. Технические условия <3>
<3> Действует ГОСТ Р 55301-2012 «Дрожжи кормовые из зерновой барды. Технические условия».
ГОСТ 20730 Питательные среды. Бульон мясо-пептонный (для ветеринарных целей). Технические условия
ГОСТ 21239 (ИСО 7741-86) Инструменты хирургические. Ножницы. Общие требования и методы испытаний
ГОСТ 21241 Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 22280 Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия
ГОСТ 22649 Стерилизаторы воздушные медицинские. Общие технические условия
ГОСТ 23932 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия
ГОСТ 24363 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25706 Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования
ГОСТ 27068 Реактивы. Натрий серноватистокислый (натрия тиосульфат) 5-водный. Технические условия
ГОСТ 28498 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29112 Среды питательные плотные (для ветеринарных целей). Общие технические условия
ГОСТ 29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 29251 (ИСО 385-1-84) Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования
ГОСТ Р 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты <4>
<4> Действует ГОСТ 12.1.019-2017.
ГОСТ Р ИСО 10576-1 Статистические методы. Руководство по оценке соответствия установленным требованиям. Часть 1. Общие принципы
ГОСТ Р 50962 Посуда и изделия хозяйственного назначения из пластмасс. Общие технические условия
ГОСТ Р 51564 Аппараты и установки сушильные и выпарные. Требования безопасности. Методы испытаний <5>
<5> Действует ГОСТ 31828-2012.
ГОСТ Р 51652 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия <6>
<6> Действует ГОСТ 5962-2013.
ГОСТ Р 51935 (ЕН 285-96) Стерилизаторы паровые большие. Общие технические требования и методы испытаний <7>
<7> Действует ГОСТ 31598-2012 (EN 285:1996).
ГОСТ Р 52361 Контроль объекта аналитический. Термины и определения
ГОСТ Р 53042 Удобрения органические. Термины и определения <8>
<8> Действует ГОСТ 34103-2017.
ГОСТ Р 53228 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ Р 54519 Удобрения органические. Методы отбора проб
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 52361, ГОСТ Р 53042, ГОСТ Р 54519, а также следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 бактерии рода Cytophaga: Клетки слегка извитые, палочки с заостренными концами длиной 3 — 8 мкм.
Примечание - Разные виды образуют на клетчатке колонии в виде желтых, розовых и коричневых пятен.
3.2 бактерии рода Cellvibrio: Мелкие, слегка изогнутые в виде полумесяца, неспорообразующие палочки с закругленными концами, длиной 3 — 4 мкм, шириной 0,4 — 0,5 мкм.
Примечание - На поверхности фильтровальной бумаги распространяются очень быстро, окрашивая ее в охряно-желтый цвет.
3.3 бактерии рода Cellfalcicula: Палочковидные клетки, утолщенные в центре, с заостренными концами.
Примечание - Образуют слизистые зеленые колонии, пигмент легко диффундирует в среду, окрашивая ее в зеленый цвет.
3.4 бактерии рода Polyangium и Sorangium: Клетки палочковидные, при старении укорачиваются и образуют микроцисты, которые собраны по 12 — 40 клеток в цисту.
Примечание - На клетчатке образуют колонии в виде слизистого налета желтого, оранжевого или темно-коричневого цвета.
3.5 грибы рода Dematium: Грибы, образующие одноклеточные бесцветные конидии округлой и овальной формы; вегетативные клетки темные, цилиндрические собраны в цепочки.
Примечание - На целлюлозе имеют вид черных пятен.
3.6 грибы рода Stachybotris: Колонии черные, бархатистые, спорангии покрыты темноокрашенными спорами.
3.7 грибы рода Cladosporium: Конидиеносцы длинные, многоклеточные, от них отпочковываются неправильной формы конидии, колонии окрашены в светлый оливково-зеленый цвет.
3.8 грибы рода Chaetomium: Образуют перитеции серого или зеленоватого цвета.
3.9 грибы рода Fumago: Колонии на целлюлозе темные и состоят из скоплений в виде узелков темных овальных и округлых хламидоспор.
3.10 бактерии рода Nocardia: Колонии пастообразные, слизистые, сухие, по периферии образуется мицелиальная зона или ободок, состоящий из субстратного и надсубстратного мицелия, в центре колонии чаще преобладают фрагментированные гифы, состоящие из палочковидных кокковидных клеток, колонии бесцветные, лимонно-желтые, розовые, красные.
3.11 актиномицеты рода Micromonospora: Компактный мицелий полностью погружен в субстрат и едва заметен под микроскопом.
Примечание - На поверхности агара кольцеобразно или радиально располагаются бесцветные или темноокрашенные комочки слизи, содержащие споры.
3.12 бактерии рода Bactoderma: Колонии мелкие в виде розовой или белой бархатистой пленки, в центре она складчатая, а по периферии — стекловидная, край колонии волнистый.
3.13 бактерии рода Arthrobacter: Колонии мелкие, плоские или слегка приподнятые, бесцветные, по периферии образуется кружевной или складчатый ободок, у отдельных представителей края колоний зазубренные, молодая культура состоит из мелких искривленных палочек, затем они довольно быстро распадаются, чаще на кокковидные клетки.
3.14 азотфиксирующие бактерии рода Clostridium pasteurianum: Облигатный анаэроб, имеет форму палочек с перитрихально расположенными жгутиками, образует овальные споры, окруженные капсулой, клетки накапливают гранулезу, которая окрашивается при воздействии раствора Люголя в сине-фиолетовый цвет.
Примечание - Энергию для всех процессов жизнедеятельности, в том числе и ассимиляции атмосферного азота, бактерии этого вида получают за счет маслянокислого брожения.
3.15 азотфиксирующие бактерии рода Azotobacter chroococcum: Колонии темно-коричневого, почти черного цвета, в жидких культурах бактерии образуют пленку, а на агаре слизистые колонии, молодые клетки имеют вид попарно соединенных крупных, коротких палочек с закругленными концами, по мере развития они становятся эллипсоидными, а затем круглыми.
4 Общие положения
4.1 Общие требования проведения микробиологического анализа — по ГОСТ ISO 7218.
4.2 Требования безопасности
Требования безопасности при работе с микроорганизмами — по [1], [2]; с химическими реактивами — по ГОСТ 12.1.007; с электрооборудованием — по ГОСТ Р 12.1.019.
Требования пожарной безопасности — по ГОСТ 12.1.004.
4.3 Требования к персоналу — по ГОСТ ISO 7218.
5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы, культуральные среды, посуда, материалы
5.1 При проведении микробиологических анализов органических удобрений используют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование, посуду и материалы:
- анализатор потенциометрический для контроля pH, обеспечивающий измерение с погрешностью до +/- 0,01 по ГОСТ 19881;
- баню водяную с терморегулятором, позволяющую поддерживать температуру от 20 °C до 100 °C с отклонением 1 °C от заданной;
- весы по ГОСТ Р 53228 с максимальным пределом взвешивания 1000 г (типа ВЛР-1), с пределом допускаемой абсолютной погрешности взвешивания +/- 10 мг;
- весы по ГОСТ Р 53228 с максимальным пределом взвешивания 160 г (типа ВЛКТ-160), с пределом допускаемой абсолютной погрешности взвешивания +/- 5 мг;
- встряхиватель;
- гомогенизатор или смеситель лабораторный;
- дистиллятор электрический;
- шкаф ламинарный;
- микроскоп световой биологический с бинокулярной насадкой с увеличением 40 — 1000x;
- прибор нагревательный для варки сред из сухих препаратов, кипячения мембранных фильтров, расплавления питательного агара;
- плитку электрическую по ГОСТ 14919;
- прибор для счета колоний микроорганизмов типа СКМ-1;
- стерилизаторы паровые медицинские, соответствующие требованиям ГОСТ Р 51935;
- термометры ртутные электроконтактные ТПК по ГОСТ 9871;
- термометры жидкостные стеклянные с диапазоном температуры от 0 °C до 50 °C и от 50 °C до 100 °C по ГОСТ 28498;
- стерилизатор электрический суховоздушный типа серии АТ, позволяющий поддерживать температуру от 20 °C до 50 °C с отклонением до 0,5 °C от заданной по ГОСТ 22649;
- холодильник портативный (типа ХАТЭ-12) или термоконтейнер с емкостями для горячей воды или льда;
- холодильник электрический бытовой, любого класса (SN, N, ST/T), позволяющий поддерживать температуру не более 5 °C, по техническим характеристикам и условиям эксплуатации соответствующий требованиям ГОСТ 16317;
- шкаф сушильный, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C по ГОСТ Р 51564;
- колбы широкогорлые специальные для стерилизации и хранения питательных сред из термостойкого стекла вместимостью 500 см3 с герметично завинчивающимися крышками;
- банки стеклянные с притертыми пробками разной вместимости до 1000 см3;
- бюретки по ГОСТ 29251;
- кастрюли разной вместимости по ГОСТ 17151;
- пипетки градуированные по ГОСТ 29227;
- посуду лабораторную стеклянную (стаканы, воронки, стеклянные палочки, чашки Петри, цилиндры, колбы, чашки лабораторные, спиртовки, пробирки) по ГОСТ 23932, ГОСТ 25336;
- посуду мерную лабораторную стеклянную (цилиндры с носиком, мензурки, колбы, пробирки и пр.) различной вместимости по ГОСТ 1770;
- промывалки;
- флаконы вместимостью 100 — 200 см3;
- чашки, стаканы фарфоровые, ступки и пестики фарфоровые разных размеров по ГОСТ 9147;
- бюксы металлические, стеклянные;
- брезент по ГОСТ 15530;
- бумагу пергаментную по ГОСТ 1341;
- бумагу индикаторную;
- бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;
- вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556;
- груши резиновые разных размеров;
- карандаши по стеклу (стеклографы);
- маркеры по стеклу;
- тушь черную;
- лампу ультрафиолетовую с длиной волны 254 нм, типа БУФ-15, БУФ-30;
- линейки измерительные металлические по ГОСТ 427;
- лупы складные карманные по ГОСТ 25706;
- марлю по ГОСТ 9412;
- мешки полиэтиленовые по ГОСТ 17811;
- ножницы анатомические по ГОСТ 19126;
- ножницы хирургические по ГОСТ 21239;
- пакеты полиэтиленовые по ГОСТ Р 50962;
- перчатки резиновые;
- петли бактериологические;
- пинцеты, скальпели анатомические по ГОСТ 21241;
- пластины асбестоцеллюлозные фильтрующие и стерилизующие по ГОСТ 480;
- полиэтиленовую пленку по ГОСТ 10354;
- прибор для окраски предметных стекол или ванночку эмалированную с мостиком;
- пробки (силиконовые, ватно-марлевые, резиновые) конусные, выдерживающие стерилизацию сухим жаром;
- сита почвенные с размером диаметра ячеек 0,5; 0,25 и 0,3 мм2;
- спички по ГОСТ 1820;
- стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672;
- стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284;
- стекло медицинское по ГОСТ 19808;
- фартук клеенчатый;
- фильтры мембранные со средним размером диаметра пор 0,5 мкм и планктонные с размером диаметра пор 3 — 5 мкм, диска — 35 мм;
- фильтры обеззоленные;
- часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145;
- шпагат по ГОСТ 17308;
- шпатели пластмассовые и металлические по ГОСТ 19126;
- штатив для пробирок.
5.2 При проведении микробиологических анализов органических удобрений используют следующие реактивы:
- \alpha - \text{Нафтиламин} ;
- алюминий сернокислый 18-водный по ГОСТ 3758;
- аммиак водный по ГОСТ 3760;
- аммоний сернокислый по ГОСТ 3769;
- аммоний хлористый по ГОСТ 3773;
- аргинин гидрохлорид;
- аспарагин;
- бенгальский розовый;
- бромтимоловый синий по ГОСТ 4919.1;
- вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
- вода питьевая по [3], [4];
- глицерин по ГОСТ 6259;
- D-глюкоза по ГОСТ 6038;
- дрожжи кормовые по ГОСТ 20083;
- дрожжи хлебопекарные прессованные по ГОСТ 171;
- железо (II) сернокислое 7-водное по ГОСТ 4148;
- железо (III) хлорид 6-водный по ГОСТ 4147;
- калий хлористый по ГОСТ 4234;
- калия гидроокись по ГОСТ 24363;
- казеин технический по ГОСТ 17626;
- калий азотистокислый по ГОСТ 4144;
- калий азотнокислый по ГОСТ 4217;
- калий йодистый по ГОСТ 4232;
- калий лимоннокислый 1-водный по ГОСТ 5538;
- калий сернокислый по ГОСТ 4145;
- калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198;
- калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493;
- калий-натрий виннокислый по ГОСТ 5845;
- кальций лимоннокислый;
- кальций углекислый по ГОСТ 4530;
- кальций хлористый технический по ГОСТ 450;
- карбамид по ГОСТ 6691;
- кислоту борную по ГОСТ 9656;
- кислоту молочную пищевую по ГОСТ 490;
- кислоту лимонную по ГОСТ 3652;
- кислоту соляную по ГОСТ 3118;
- кислоту сульфаниловую по ГОСТ 5821;
- кислоту уксусную по ГОСТ 61;
- крахмал растворимый по ГОСТ 10163;
- магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523;
- магний углекислый основной водный по ГОСТ 6419;
- Д (-) маннит, ч.д.а.;
- марганец (II) сернокислый 5-водный по ГОСТ 435;
- медь (II) сернокислую 5-водную по ГОСТ 4165;
- мел химический осажденный по ГОСТ 8253;
- натрий азотнокислый технический по ГОСТ 828;
- натрия бромид;
- натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
- натрий двууглекислый по ГОСТ 2156;
- натрий лимоннокислый 5,5-водный по ГОСТ 22280;
- натрий молибденовокислый 2-водный по ГОСТ 10931;
- натрий серноватистокислый (натрия тиосульфат) 5-водный по ГОСТ 27068;
- натрий углекислый по ГОСТ 83;
- натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный по ГОСТ 245;
- натрий хлористый по ГОСТ 4233;
- натрий яблочнокислый (малат натрия 1-замещенный);
- нитрит натрия технический по ГОСТ 19906;
- пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805;
- перекись водорода по ГОСТ 10929;
- реактив Грисса;
- реактив Несслера по ГОСТ 4517;
- сахарозу по ГОСТ 5833;
- сусло семибаллинговое;
- спирт этиловый ректификованный пищевой по ГОСТ Р 51652;
- стрептомицин;
- цинк сернокислый 7-водный по ГОСТ 4174;
- цинк хлористый по ГОСТ 4529;
- цинка йодид.
5.3 При проведении микробиологических анализов органических удобрений используют следующие культуральные среды:
- автолизат кормовых дрожжей;
- агар микробиологический по ГОСТ 17206;
- агар питательный сухой;
- бульон мясо-пептонный по ГОСТ 20730.
5.4 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и вспомогательного оборудования с техническими характеристиками, а также материалов, реактивов, культуральных сред, по качеству не ниже вышеуказанных.
6 Приготовление сред и реактивов
6.1 Питательные среды приготавливают и стерилизуют в соответствии с требованиями ГОСТ ISO 11133-1, ГОСТ ISO 11133-2.
6.2 Питательный агар из сухого препарата промышленного производства по ГОСТ 17206 готовят по способу, указанному на этикетке в соответствии с ГОСТ 10444.1.
6.3 Мясо-пептонный агар (МПА) готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1.
6.4 Мясо-пептонный бульон (МПБ) по ГОСТ 20730, ГОСТ 29112 готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1.
6.5 Вода пептонная
Состав (в граммах на 1 дм3 водопроводной воды): пептон — 5,0; K2HPO4 - 1,0; KH2PO4 - 1,0; MgSO4·7H2O — 0,5; NaCl — 0,5.
В термостойкую плоскодонную либо коническую колбу по ГОСТ 25336 помещают 1 дм3 водопроводной воды, вносят 5 г пептона и кипятят в течение 15 мин. В горячую жидкость вносят соли. Доводят pH до 7,0 по ГОСТ 10444.1. После растворения солей раствор тщательно взбалтывают и фильтруют до полной прозрачности. Фильтрат собирают в коническую колбу, химический стакан по ГОСТ 25336.
Среду разливают в пробирки по 6 см3 и стерилизуют в автоклаве в течение 25 мин при давлении 101,3 кПа.
Срок хранения среды — не более 2 мес; в холодильнике — не более 5 дней.
6.6 Среда Федорова
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): K или Na — виннокислый или Na яблочнокислый — 5,0; мочевина — 50,0; K2HPO4 - 0,5; MgSO4·7H2O — 0,2.
В термостойкую плоскодонную либо коническую колбу по ГОСТ 25336 помещают 1 дм3 водопроводной воды. Вносят соли, кроме мочевины. Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °C, давлении 101,3 кПа в течение 20 мин. В стерильную среду добавляют раствор мочевины, предварительно пропущенный через бактериальный фильтр. Среду разливают по 30 см3 в конические колбы.
Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 7 дней.
6.7 Среда Зенгена
Состав (в граммах на 1 дм3 водопроводной воды): мочевина — 30; K2HPO4 - 0,5; лимоннокислый кальций — 10. pH среды — около 7,0.
Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °C, давлении 101,3 кПа в течение 20 мин. Мочевину стерилизуют отдельно сухим жаром при температуре 106 °C в течение 30 мин и затем вводят в стерильную среду.
Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 7 дней.
6.8 Агар крахмало-аммиачный (КАА)
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): (NH4)2SO4 - 2,0; K2HPO4 - 1,0; MgSO4·7H2O — 1,0; NaCl — 1,0; CaCO3 - 3,0; крахмал растворимый — 10,0; агар — 20,0.
Крахмал предварительно растворяют в 50 см3 дистиллированной воды и приливают к основной среде до стерилизации. Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °C, давлении 101,3 кПа в течение 30 мин.
Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 7 дней.
6.9 Среда крахмало-казеиновая
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): крахмал растворимый — 10,0; казеин — 0,3; KNO3 - 2,0; K2HPO4 - 2,0; MgSO4·7H2O — 0,05; NaCl — 2,0; CaCO3 — 0,02; FeSO4·7H2O — 0,01; агар — 20,0.
Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 111 °C, давлении 50,7 кПа в течение 20 мин.
Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 7 дней.
6.10 Агар глицерино-аргининовый
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): глицерин — 12,5; аргинин — 1,0; K2HPO4 - 1,0; MgSO4·7H2O — 0,05; NaCl — 1,0; FeSO4·7H2O — 0,01; CuSO4·5H2O — 0,001; ZnSO4·7H2O — 0,001; MnSO4·4H2O — 0,001; агар — 20,0.
Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 111 °C, давлении 50,7 кПа в течение 20 мин.
Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 7 дней.
6.11 Сусло-агар
Семибаллинговое сусло разводят дистиллированной водой в соотношении 1:3 и добавляют 2%-ный агар. Среду стерилизуют при давлении 50,7 кПа в течение 30 мин. Перед посевом в 1 дм3 среды добавляют 2 см3 стерильной молочной кислоты или 0,5 г стерильной лимонной кислоты.
Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 5 дней.
6.12 Среда Чапека
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): NaNO3 - 2,0; K2HPO4 - 1,0; MgSO4·7H2O — 0,5; KCl — 0,5; FeSO4 - следы; сахароза — 20,0; агар — 20,0.
Среду стерилизуют при давлении 101,3 кПа в течение 30 мин. Перед посевом в 1 дм3 среды добавляют 4 см3 стерильной молочной кислоты.
Срок хранения среды — не более 6 мес; в холодильнике — не более 5 дней.
6.13 Среда Мартина
Состав (в граммах на 1 дм3 водопроводной воды): K2HPO4 - 1,0; MgSO4·7H2O — 0,5; пептон — 5,0; глюкоза — 10,0; бенгальский розовый — 0,15 мг; агар — 20,0.
Среду стерилизуют при давлении 50,7 кПа в течение 30 мин.
После стерилизации перед разливом в расплавленную среду вносят стрептомицин 0,5 г/дм3.
Срок хранения среды — не более 6 мес; в холодильнике — не более 5 дней.
6.14 Среда Гетчинсона
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): K2HPO4 - 1,0; MgSO4 - 0,3; CaCl2 - 0,1; NaCl — 0,1; FeCl3 - 0,01; NaNO3 - 2,5; агар — 20,0. pH среды — 7,2 — 7,3.
Среду стерилизуют при давлении 101,3 кПа при температуре 120 °C в течение 30 мин.
Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 7 дней.
6.15 Среда Виноградского
Состав (в граммах на 1 дм3 водопроводной воды): K2HPO4 - 1,0; (NH4)2SO4 - 1,0; MgSO4·7H2O — 0,5; NaCl — 0,5; агар — 20,0.
Среду стерилизуют при давлении 101,3 кПа при температуре 120 °C в течение 30 мин.
Срок хранения среды — не более 2 мес; в холодильнике — не более 5 дней.
6.16 Среда Омелянского
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): K2HPO4 — 1,0; MgSO4·7H2O — 1,0; NaCl — 1,0; (NH4)2SO4 — 2,0; CaCO3 — 2,0; фильтровальная бумага — 30,0.
Среду стерилизуют при давлении 101,3 кПа в течение 30 мин.
Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 7 дней.
6.17 Среда жидкая Виноградского
Состав среды для первой фазы в процентах: (NH4)2SO4 — 0,2; K2HPO4 — 0,1; MgSO4·7H2O — 0,05; NaCl — 0,2; FeSO4·7H2O — 0,04; CaCO3 или MgCO3 — 0,5.
Состав среды для второй фазы в процентах: NaNO2 - 0,1; Na2CO3 (безводный) — 0,1; NaCl — 0,05; K2HPO4 - 0,05; MgSO4·7H2O — 0,05; FeSO4·7H2O — 0,04.
Среду стерилизуют при давлении 101,3 кПа в течение 30 мин.
Срок хранения среды — не более 2 мес; в холодильнике — не более 5 дней.
6.18 Среда для учета гетеротрофных нитрификаторов
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): сухой питательный агар — 3,5; агар — 13,5; (NH4)2SO4 — 0,5. pH среды — 7,0 — 7,2.
Среду стерилизуют при давлении 101,3 кПа в течение 30 мин.
Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 7 дней.
6.19 Жидкая среда Гильтая
Первый раствор: 2,0 г KNO3, 1,0 г аспарагина растворяют в 250 см3 дистиллированной воды.
Второй раствор: 5 г натрия лимоннокислого, 2,0 г KH2PO4, 2,0 г MgSO4·7H2O, 0,2 г CaCl2·6H2O и FeCl3·6H2O (следы) растворяют в 500 см3 дистиллированной воды.
Оба раствора сливают в коническую колбу по ГОСТ 25336 и доводят объем среды до 1000 см3. Устанавливают pH 7 по индикатору бромтимоловому синему, который добавляют в среду. Цвет среды зеленый. Среду разливают высоким слоем (до 2/3 объема) по пробиркам и стерилизуют в автоклаве при давлении 50,7 кПа, температуре 112 °C в течение 30 мин.
Срок хранения среды — не более 2 мес; в холодильнике — не более 5 дней.
6.20 Среда Березовой
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): цитрат калия или натрия — 2,0; KNO3 - 1,0; KH2PO4 - 1,0; K2HPO4 - 1,0; MgSO4·7H2O — 2,0 г; CaCl2·6H2O — 0,2 г; FeCl3·6H2O — следы (1 см3 1%-ного раствора на 1 дм3 среды).
Среду стерилизуют при давлении 101,3 кПа в течение 20 мин.
Срок хранения среды — не более 6 мес; в холодильнике — не более 10 дней.
6.21 Агар нитритный, приготовленный по методу Виноградского
Состав среды (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): NaNO2 - 1,0; Na2CO3 (безводный) — 1,0; NaCl — 0,5; K2HPO4 - 0,5; MgSO4·7H2O — 0,5; FeSO4·7H2O — 0,4; агар — 20 г.
Среду стерилизуют при давлении 50,7 кПа в течение 30 мин.
Срок хранения среды — не более 6 мес; в холодильнике — не более 10 дней.
6.22 Среда синтетическая безазотистая
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): сахароза — 20,0; K2HPO4 - 1,0; MgSO4·7H2O — 0,5; NaCl, FeSO4, MnSO4 - следы.
Среду стерилизуют при давлении 101,3 кПа в течение 20 мин. Перед посевом добавляют 1 см3 стерильной дрожжевой воды и 20 г стерильного мела.
Срок хранения среды — не более 6 мес; в холодильнике — не более 10 дней.
6.23 Среда Емцева
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): NaH2PO4 - 0,5; K2HPO4 - 0,5; MgSO4·7H2O — 0,5; NaCl — 0,5; FeSO4·7H2O — 0,01; MnSO4·4H2O — 0,01; глюкоза — 20,0; мел — 10,0; смесь микроэлементов по Федорову — 1,0 см3; пептон — 5,0; дрожжевой автолизат — 0,2 см3. pH среды — 7,0.
Среду стерилизуют при давлении 50,7 кПа в течение 20 мин.
Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 7 дней.
6.24 Среда жидкая Бейеринка
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): маннит или Д-глюкоза — 20,0; K2HPO4 - 0,2; CaCO3 - 5,0; MgSO4·7H2O — 0,2; 1 см3 смеси микроэлементов по Федорову.
Среду стерилизуют при давлении 50,7 кПа в течение 20 мин.
Срок хранения среды — не более 2 мес; в холодильнике — не более 5 дней.
6.25 Среда плотная Эшби
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): маннит — 20,0; K2HPO4 - 0,2; MgSO4·7H2O — 0,2; NaCl — 0,2; K2SO4 - 0,1; CaCO3 - 5,0; смесь микроэлементов по Федорову — 1 см3; агар — 20,0 г.
Среду стерилизуют при давлении 50,7 кПа в течение 30 мин.
Срок хранения среды — не более 6 мес; в холодильнике — не более 10 дней.
6.26 Реактив Несслера — по ГОСТ 4517.
Срок хранения среды — не более 6 мес; в холодильнике — не более 10 дней.
6.27 Раствор Люголя — по ГОСТ 10444.1.
6.28 Цинк-йод-крахмал — по ГОСТ 4517.
6.29 Состав микроэлементов по Федорову
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): H3BO3 - 5,0; Na2MoO4·2H2O — 5,0; MnSO4·4H2O — 3,0; KI — 0,5; NaBr — 0,5; ZnSO4·7H2O — 0,2; Al2(SO4)3·18H2O — 0,3.
Срок хранения среды — не более 2 мес; в холодильнике — не более 5 дней.
6.30 Вода дрожжевая
100 г дрожжей растворяют в 1 дм3 воды, кипятят 10 мин, фильтруют, стерилизуют при давлении 50,7 кПа в течение 10 мин. После стерилизации в среду добавляют 20 г стерильного мела на 1 дм3 среды. Мел стерилизуют при давлении 101,3 кПа в течение 20 мин.
Срок хранения среды — не более 2 мес; в холодильнике — не более 5 дней.
Примечание - Все используемые среды хранят в сухих, защищенных от прямого солнечного света помещениях при температуре от 2 °C до 25 °C в специальных для стерилизации и хранения питательных сред широкогорлых колбах из термостойкого стекла вместимостью 500 см3 с герметично завинчивающимися крышками либо в холодильнике в колбах, снабженных ватными пробками, при температуре от 2 °C до 5 °C.
6.31 Бромтимоловый синий — по ГОСТ 4919.1, ГОСТ 10444.1.
6.32 Соль аммонийно-магниево-фосфорнокислая
Первый раствор: в 200 см3 дистиллированной воды растворяют 25,0 г хлористого аммония (NH4Cl) и 20 г сернокислого магния (MgSO4·7H4O).
Второй раствор: в 100 см3 дистиллированной воды растворяют 10 г однозамещенного фосфорнокислого натрия (NaH2PO4).
Оба раствора смешивают и прибавляют 20 см3 насыщенного хлористого аммония. Прибавляют по каплям концентрированный аммиак до образования сильного устойчивого запаха. Через 10 мин фильтруют через бумажный фильтр, промывают дистиллированной водой до исчезновения запаха. Высушивают на воздухе и аммонийно-магниево-фосфорнокислую соль развешивают в пакетики по 0,8 г.
6.33 Реактив Грисса — по ГОСТ 4517 со следующим дополнением.
Первый раствор состоит из 0,5 г сульфаниловой кислоты, растворенной в 30 см3 ледяной уксусной кислоты. Добавляют 100 см3 дистиллированной воды и фильтруют.
Срок хранения раствора в холодильнике при 4 °C — 5 °C — не более 1 мес.
Второй раствор: 0,1 г \alpha - \text{нафтиламина} растворяют в 100 см3 кипящей дистиллированной воды. Охлаждают и добавляют 30 см3 ледяной уксусной кислоты. Раствор фильтруют.
Срок хранения раствора в холодильнике при 4 °C — 5 °C — не более 1 нед.
Непосредственно перед употреблением смешивают равные объемы данных растворов.
6.34 Приготовление стерильной воды — по ГОСТ 18963.
6.35 Приготовление стерильного кальция углекислого — по ГОСТ 10444.1.
6.36 Водный агар
Состав (в граммах на 1 дм3 дистиллированной воды): агар — 20,0.
В термостойкую плоскодонную либо коническую колбу по ГОСТ 25336 помещают 1 дм3 водопроводной воды, вносят 20 г микробиологического агар-агара.
Среду стерилизуют 30 мин в автоклаве при температуре 120 °C, давлении 101,3 кПа.
Срок хранения среды — не более 3 мес; в холодильнике — не более 7 дней.
7 Отбор и подготовка проб
Отбор проб органических удобрений — по ГОСТ Р 54519.
8 Подготовка к проведению анализа
8.1 Подготовку лабораторных помещений, стерилизацию посуды, инструментов, питательных сред, физиологических растворов проводят по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ISO 11133-1, ГОСТ ISO 11133-2.
Длительность и температура стерилизации определяются составом питательной среды, химическим составом материала и целью анализа (см. приложения Б, В).
8.2 Приготовление разведений, посев и учет микроорганизмов
8.2.1 Лабораторную пробу твердых органических удобрений из пакета выкладывают на стерильную полиэтиленовую пленку, тщательно перемешивают шпателем, удаляя при этом посторонние включения (камни, стекла и т.д.), разравнивают тонким слоем и из разных мест отбирают 10 г анализируемой пробы. При анализе жидких или полужидких органических удобрений лабораторную пробу тщательно перемешивают и отбирают 10 см3 пробы для анализа.
8.2.2 Анализируемую пробу переносят в колбу со 100 см3 стерильной водопроводной воды. Параллельно отбирают анализируемые пробы для определения влажности в металлические или стеклянные бюксы. Колбы с органическим удобрением помещают на механическую качалку и встряхивают в течение 15 мин, предварительно заменив ватные пробки на резиновые. По окончании встряхивания приступают к проведению микробиологического анализа, который включает: приготовление разведений, проведение посева и учет количества колоний.
8.2.3 Разведение готовят в стерильной водопроводной воде или в физиологическом растворе (0,85%-ный раствор NaCl по ГОСТ 4233), используя постоянный коэффициент разведения, чаще всего равный 10. Разведение осуществляют в ряде пробирок, содержащих по 9 см3 воды.
Количество разведений подбирается опытным путем с учетом вида органического удобрения. Колбу с суспензией встряхивают и оставляют на 30 с для оседания крупных частиц. Стерильной пипеткой отбирают 1 см3 суспензии (не прикасаясь ко дну колбы), переносят ее в пробирку с водой (9 см3). Суспензию в первой пробирке тщательно перемешивают другой стерильной пипеткой, для чего в пипетку забирают и вновь возвращают в пробирку ее содержимое. Данная операция по перемешиванию суспензии микроорганизмов повторяется не менее 10 раз. Аналогичным образом готовят все последующие разведения, 1 см3 суспензии в колбе соответствует разведению 10-1, в первой пробирке — 10-2 и т.д. Пробирки и колбы обычно подписывают заранее двумя цифрами, написанными одна под другой. Верхняя цифра обозначает номер образца, нижняя — степень разведения (см. приложение Г).
8.2.4 При планировании посева на большое количество питательных сред 9 см3 суспензии будет недостаточно. В этом случае ряд разведений готовят в колбах или бутылках вместимостью 250 см3 с 90 см3 стерильной водопроводной воды. Из первой и последующих колб берут по 10 см3 суспензии. Для приготовления каждого разведения используют новую пипетку. Бутылки встряхивают 1 мин. Использованные пипетки помещают в фарфоровую кружку, на дно которой кладут вату и наливают немного воды. Все операции проводят при зажженной газовой горелке или спиртовке.
8.2.5 Высевают суспензию поверхностным или глубинным способом на плотные и жидкие питательные среды. Посев проводят в боксах, ламинарных шкафах, оборудованных ультрафиолетовыми лампами, с соблюдением условий асептики. Набор сред зависит от задач бактериологического анализа органических удобрений. Расплавленную и охлажденную до температуры 45 °C — 50 °C агаризованную среду разливают в чашки Петри по 15 — 20 см3 в каждую.
Чашки должны находиться на горизонтальной поверхности, чтобы получился ровный слой застывшей среды. Чашки помещают в предварительно протертый 70%-ным этиловым спиртом и нагретый до температуры 65 °C — 70 °C сушильный шкаф на 15 — 20 мин. В сушильном шкафу чашки Петри переворачивают вверх дном, открывают и ставят под углом 45° на крышку и подсушивают для удаления конденсационной воды до появления муарового рисунка на поверхности среды. Развившиеся колонии микроорганизмов на таких чашках не расплываются и не сольются друг с другом.
Тщательно перемешав суспензию в пробирке или бутылке, стерильной пипеткой на поверхность среды наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 см3) соответствующего разведения, затем быстро и тщательно растирают его стерильным стеклянным шпателем по всей поверхности среды. Посев обычно осуществляют из двух или трех последовательных разведений в целях проведения более точного подсчета количества микроорганизмов в органическом удобрении. Из каждого разведения засевают по три — пять параллельных чашек. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки переворачивают крышками вниз и инкубируют в термостате при определенной температуре необходимое время.
8.2.6 При глубинном посеве 0,5 или 1 см3 суспензии из соответствующего разведения переносят пипеткой в три — пять стерильных чашек Петри, затем заливают расплавленной и охлажденной до температуры 45 °C — 50 °C средой и смешивают с посевным материалом легким вращательным движением. После застывания чашки помещают в термостат.
8.2.7 После прохождения необходимого срока инкубации чашки вынимают из термостата и подсчитывают число выросших колоний. Для правильного определения численности клеток подсчитывают только такие чашки, в которых выросло колоний свыше десяти и не более 250 — 300. Закрытые чашки просматривают в проходящем свете и отмечают колонии тушью или маркером по стеклу. Для удобства дно чашки с помощью линейки и маркера делят на секторы. Подсчет колоний на непрозрачных средах (почвенный агар) проводят непосредственно с поверхности. Для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики. Чтобы не пропустить мелкие колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой.
8.2.8 Все количественные подсчеты на агаризованных средах необходимо проводить всегда через одно и то же время после посева, чтобы получить сравнимые результаты.
Количество клеток M в 1 см3 анализируемого субстрата вычисляют по формуле
M = \frac{a \cdot 10n}{V} , (1)
где a — среднее число колоний при посеве данного разведения;
n — порядковый номер разведения, из которого сделан посев;
V — объем суспензии, взятой для посева по 8.3.5, 8.3.6, см3.
Полученное количество клеток соответствует содержанию микроорганизмов в 1 г сырого субстрата.
Для пересчета на 1 г абсолютно сухого субстрата необходимо полученные результаты умножить на коэффициент пересчета, который вычисляют по формуле
где W — влажность субстрата, %.
8.2.9 Наиболее вероятное количество микроорганизмов Mprob, содержащееся в 1 г исходного субстрата, при уровне достоверности P = 0,95 вычисляют по формуле
Mprob = \overline{X} \pm 2\sigma_{X} \cdot K \frac{1}{V} , (3)
где \overline{X} = \frac{\Sigma X}{n} — среднее число колоний, выросших из данного разведения;
\Sigma X — общее число подсчитанных колоний при посеве данного разведения;
\sigma_{X} = + \frac{\sqrt{\Sigma X}}{n} — среднеквадратическое отклонение;
2 — критерий (t) при P = 0,95;
K — разведение, из которого проведен посев;
V — объем суспензии, взятый для посева, см3.
Если уровень достоверности составляет 99%, то (t) критерий равен 2,7.
8.2.10 Для учета микроорганизмов, которые плохо или совсем не развиваются на плотных питательных средах, используют посев в жидкие среды (метод предельных разведений). Этот метод применяют также при определении численности бактерий разных физиологических групп (денитрифицирующие, азотфиксирующие и др.).
В пробирки с жидкой средой вносят измеренный объем посевного материала (1 см3) из различных разведений. Посев проводят из каждого разведения или четырех-пяти последних, высевая в три — пять параллельных пробирок. Посев одной пробы можно выполнять одной стерильной пипеткой, начиная с большего разведения. Время инкубации колеблется от 3 до 10 сут и зависит от скорости роста микроорганизмов, численность которых определяют. При этом отмечают плюсом (+) пробирки с разведениями, в которых развились представители данной группы, а минусом (-) — его отсутствие. В жидких средах о развитии микробов разных групп судят по помутнению среды, образованию осадка, пленки, пузырьков газа, изменению окраски и т.д.
8.2.11 В целях более точного подсчета используют таблицу Мак-Креди, составленную на основании обработки многочисленных результатов методом вариационной статистики (см. приложение Д). Необходимо составить числовую характеристику из трех цифр. Первая цифра отвечает числу параллельно засеянных пробирок (отмечается последнее разведение, в котором рост микроорганизмов наблюдается во всех параллельных пробирках). Следующие две цифры обозначают число пробирок, где происходит развитие микроорганизмов в последующих двух разведениях.
8.2.12 По таблице Мак-Креди находят вероятное число клеток, соответствующее числовой характеристике, и умножают на степень разведения, при которой отмечен рост во всех параллельных пробирках. При пересчете на 1 г абсолютно сухого субстрата полученный результат умножают на коэффициент, рассчитанный по формуле (2).
Числовая характеристика составляет 321; вероятное число клеток 15, которое умножаем на 10 000. Если влажность органического удобрения равна 72%, то умножаем на коэффициент 3,57.
Число клеток в 1 г абсолютно сухого органического удобрения равно:
| Разведение | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
|---|---|---|---|---|---|
| Число параллельно засеянных пробирок | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| Число пробирок, в которых обнаружен рост | 3 | 3 | 2 | 1 | 0 |
Статистическая обработка результатов микробиологических анализов проводится в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 10576-1.
8.2.13 Схема микробиологического анализа органических удобрений приведена в приложении Д.
9 Методы микробиологического анализа органических удобрений
9.1 Метод выявления микроорганизмов-аммонификаторов, использующих органические формы азота
9.1.1 Наиболее активно в процессах аммонификации участвуют представители бактерий родов Pseudomonas, Bacillus, Clostridium и Proteus, представители грибов порядка Mucorales, родов Aspergillus, Trichoderma и др.
9.1.2 Типичные аммонификаторы выявляют посевом из соответствующего разведения (четыре-пять) на мясо-пептонном агаре (МПА) по 6.3 или мясо-пептонном бульоне (МПБ) по 6.4. Для выявления аммонифицирующих бактерий также можно использовать пептонную воду по 6.5.
9.1.3 Численность аммонификаторов определяют методом предельных разведений. О развитии аммонифицирующих бактерий судят по помутнению среды и появлению на поверхности пленки. Учет проводят на третьи — пятые — седьмые сутки.
9.1.4 В целях более точной оценки аммонифицирующей активности бактерий анализируют выделение аммиака (NH3). Аммиак выявляют в атмосфере и субстрате. Выделяющийся NH3 окрашивает подвешенную в пробирке красную лакмусовую бумажку в синий цвет. Накопление NH3 в субстрате устанавливают при помощи реактива Несслера по ГОСТ 4517. На фарфоровую пластинку с лунками или предметное стекло помещают каплю субстрата, затем вносят каплю реактива Несслера. При большом количестве NH3 образуется коричневый или буроватый осадок, при небольшом — оранжевая или желтая окраска.
9.1.5 Бактерии, способные к аммонификации мочевины, — уробактерии, выявляют по выделению аммиака на средах, содержащих мочевину, среде Федорова по 6.6, среде Зенгена по 6.7. Численность уробактерий определяют методом предельных разведений. Посевы проводят из соответствующих разведений и инкубируют в термостате при температуре 25 °C — 30 °C. Через три — пять суток устанавливают выделение аммиака в соответствии с 9.1.4.
Среду Зенгена разливают в пробирки по 6 см3. Посев проводят из разведений 1:103 — 1:109. Культивирование происходит в течение пяти — семи суток в термостате при температуре 25 °C — 30 °C. О содержании уробактерий судят по помутнению среды и появлению на поверхности пленки.
9.2 Метод выявления микроорганизмов, использующих минеральные формы азота
9.2.1 Группа микроорганизмов, использующих минеральные формы азота, представлена в основном бактериями и актиномицетами.
9.2.2 Бактерии и актиномицеты выявляют на крахмало-аммиачном агаре (КАА) по 6.8. Посев проводят из четвертого-пятого разведений по 0,05 см3 на поверхность среды. Инкубируют в термостате при температуре 28 °C, на четвертые-пятые сутки подсчитывают только бактериальные колонии, а на седьмые — десятые подсчитывают актиномицеты. Отмечают окраску колоний (желтый, розовый, черный), воздушного мицелия (серый, белый, желтовато-серый, розовый) и среды (выделение пигмента в субстрат).
9.2.3 При идентификации актиномицетов описывают консистенцию колоний (плотные, кожистые, рыхлые), поверхность (мучнистая, бархатистая) и запах (землистый, эфирный, фруктовый).
Актиномицеты выделяют также на крахмало-казеиновой среде по 6.9 на глицерино-аргининовом агаре по 6.10.
На данных средах, как правило, вырастают колонии актиномицетов, принадлежащих к родам Streptomyces, Streptoverticellum, Chainia. Представители этих родов являются аэробными, грамположительными микроорганизмами. Они образуют разветвленный мицелий, обычно 0,5 — 2,0 мкм в диаметре, который подразделяется на первичный, или субстратный, и вторичный, или воздушный, споры неподвижны, образуются в виде цепочек на специальных спороносящих гифах воздушного мицелия.
9.3 Метод выявления микроскопических грибов
9.3.1 Микроскопические грибы чаще обнаруживают на сусле-агаре по 6.11 на кислой среде Чапека по 6.12 или среде Мартина по 6.13 с добавлением бенгальского розового. Перед посевом в сусло-агар добавляют 2 см3 стерильной молочной кислоты или 0,5 г лимонной кислоты. Перед посевом в среду Чапека добавляют 4 см3/дм3 стерильной молочной кислоты. Среду разливают в чашки, тщательно перемешивая покачиванием. Добавление кислот и других ингибиторов производится асептически в стерильные охлажденные до температуре 45 °C — 50 °C питательные среды.
9.3.2 Количество микроскопических грибов чаще учитывают методом глубинного посева 1 см3 суспензии из трех-четырех разведений в стерильные чашки Петри. Инкубируют при температуре 26 °C — 28 °C, количество грибов учитывают на четвертые-пятые сутки.
9.4 Метод выявления целлюлозоразрушающих микроорганизмов
9.4.1 Из бактерий, интенсивно разлагающих целлюлозу в органических удобрениях, наиболее часто встречаются представители родов Cytophaga, Cellvibrio, Cellfalcicula, Polyangium и Sorangium.
9.4.2 Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы хорошо выявляются на среде Гетчинсона по 6.14 и среде Виноградского по 6.15.
9.4.3 На застывшую среду в чашки Петри помещают стерильный обеззоленный фильтр, засевают суспензию по 1 см3 из третьего-четвертого разведения, растирают стерильным шпателем. Инкубируют в термостате при температуре 28 °C. Учет проводят на десятые сутки. На бумаге вырастают отдельные колонии плесневых грибов, актиномицетов и бактерий. Подсчитывают количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г органического удобрения.
9.4.4 Из грибов, наиболее интенсивно разлагающих целлюлозу в органических удобрениях, наиболее часто встречаются представители родов Dematium, Stachybotris, Cladosporium, Chaetomium, Fumago.
9.4.5 Количественный учет аэробных целлюлозоразрушающих бактерий проводят также методом предельных разведений. Посев из разведений органического удобрения производят в пробирки с жидкой средой Гетчинсона по 6.14 с полосками фильтровальной бумаги. О развитии целлюлозоразлагающих бактерий судят по разрушению полосок фильтровальной бумаги и образованию колоний.
9.4.6 В условиях ограниченного доступа воздуха целлюлозу разлагают в основном представители рода Clostridium, например Cl. omelianskii, представляющий длинные тонкие палочки с круглой спорой на конце.
9.4.7 Анаэробные бактерии, разлагающие целлюлозу, выявляют на среде Омелянского по 6.16. Жидкую питательную среду разливают высоким слоем в высокие пробирки вместимостью 20 — 25 см3, фильтровальную бумагу в виде полосок опускают на дно пробирки.
9.4.8 Посев проводят из разведений в несколько параллельных пробирок, которые инкубируют в термостате при температуре 30 °C. Учет проводят методом предельных разведений на пятые — седьмые сутки по помутнению среды.
9.5 Метод выявления нитрифицирующих бактерий
9.5.1 Первую фазу нитрификации (NH_{4}^{+} + 1_{2}^{1}O_{2} = NO_{2}^{-} - + 2H + H_{2}O) осуществляют в основном бактерии рода Nitrozomonas, вторую фазу (NO_{2}^{-} + _{2}^{1}O_{2} = NO_{3}^{-}) — Nitrozobacter.
Первую и вторую фазы нитрификации можно наблюдать в жидких средах Виноградского по 6.17.
9.5.2 Среды инокулируют из соответствующих разведений органических удобрений. Численность нитрифицирующих бактерий определяют методом предельных разведений. Инкубируют при температуре 25 °C — 30 °C в течение трех-четырех недель. О развитии судят по изменению состава среды. Через неделю после посева при изучении первой фазы нитрификации устанавливают образование азотистой кислоты (капельная реакция с реактивом Грисса или цинк-йод-крахмалом в кислой среде). В присутствии азотистой кислоты с реактивом Грисса по ГОСТ 4517 образуется красное окрашивание, с цинк-йод-крахмалом — темно-синее окрашивание.
9.5.3 Для выявления нитрификаторов используют также аммонийно-магниево-фосфорнокислую соль по 6.32, которую растирают в стерильной ступке, растворяют в 2 см3 дистиллированной воды и переносят на поверхность водного агара чашки Петри. Засевают по 1 см3 суспензии из третьего-четвертого разведения, тщательно перемешивают круговыми движениями до равномерного распределения соли. Инкубируют в течение пяти-шести недель во влажной камере при комнатной температуре. Учет проводят по зонам растворения соли и пересчитывают на 1 г органического удобрения.
9.5.4 Оба раствора аммонийно-магниево-фосфорнокислой соли смешивают и прибавляют 20 см3 насыщенного хлористого аммония. Затем приливают по каплям концентрированный аммиак до образования сильного устойчивого запаха. Оставляют на 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр, промывают дистиллированной водой до исчезновения запаха. Высушивают на воздухе и развешивают в пакетики по 0,8 г.
9.5.5 Для учета гетеротрофных нитрификаторов суспензию из разведений органических удобрений высевают в чашки Петри на специализированную среду по 6.18. Посев инкубируют при комнатной температуре в течение пяти — десяти дней. Когда появляются отдельные бактериальные колонии, на них наносят по капле реактива Грисса по ГОСТ 4517. Покраснение указывает на образование нитратов из аммония, введенного в состав среды.
9.6 Метод выявления денитрифицирующих бактерий
9.6.1 Полную денитрификацию до образования газообразных продуктов проводят только прокариоты. Большинство их относится к родам Pseudomonas, Micrococcus и Bacillus. Денитрифицирующие бактерии определяют обычно на жидкой среде Гильтая по 6.19 или среде Березовой по 6.20.
9.6.2 Среду Гильтая наливают высоким слоем в пробирки вместимостью 20 — 25 см3 и стерилизуют в автоклаве при давлении 50,7 кПа в течение 20 мин.
Среду Березовой наливают высоким слоем в пробирки вместимостью 20 — 25 см3 и стерилизуют при давлении 101,3 кПа в течение 20 мин.
9.6.3 Стерильную среду засевают из третьего — восьмого разведений, инкубируют в течение семи дней при температуре 25 °C — 30 °C. Среда в пробирках синеет, образуются пузырьки газов, от развившихся бактерий мутнеет. Численность денитрифицирующих бактерий определяют методом предельных разведений. Наблюдения проводят на третьи — пятые — седьмые сутки.
9.7 Метод выявления автохтонной микрофлоры
9.7.1 Из группы автохтонных микроорганизмов в органических удобрениях чаще всего встречаются представители родов Nocardia, Micromonospora, Bactoderma и Arthrobacter.
9.7.2 Представителей автохтонной микрофлоры выявляют на нитритном агаре, приготовленном по методу Виноградского по 6.21.
9.7.3 Посев проводят из четвертого-пятого разведения по 0,05 см3 суспензии, инкубируют при температуре 26 °C — 28 °C в термостате в течение одной недели. Колонии учитывают под микроскопом при малом увеличении (окуляр 10x, объектив 3x или окуляр 10x, объектив 8x).
9.7.4 Определяют площадь чашки Петри (P) и площадь поля зрения (p). Разделив площадь чашки на площадь поля зрения, получают коэффициент K = P/p, на который умножают среднее число колоний в поле зрения по чашке. В чашке учитывают не менее 50 полей зрения, затем выводят среднеарифметическое значение результатов на одно поле.
9.8 Метод выявления азотфиксирующих микроорганизмов (диазотрофов)
9.8.1 Среди свободноживущих азотфиксирующих бактерий наибольший интерес представляют виды родов Clostridium и Azotobacter.
9.8.2 Для учета Cl. pasteurianum используют синтетическую безазотистую среду по 6.22. Среду стерилизуют при давлении 101,3 кПа в течение 20 мин. Перед посевом добавляют 1 см3 дрожжевой воды по 6.30. Среду, энергично перемешивая, разливают в пробирки высоким слоем (до 2/3 объема пробирки).
9.8.3 Вносят в каждую пробирку 1 см3 суспензии из второго, третьего, четвертого, пятого разведения. Наблюдения ведут по газообразованию на третьи — пятые — седьмые сутки. Пробирки инкубируют при температуре 28 °C — 30 °C. Признаками развития бактерий являются также помутнение среды и характерный запах масляной кислоты. Численность определяют методом предельных разведений.
9.8.4 Для учета Cl. pasteurianum используют среду Емцева по 6.23.
9.8.5 Посев и учет проводят по 9.8.3.
9.8.6 Наличие клостридиев в культуре определяют при микроскопировании препаратов «раздавленная капля» с раствором Люголя.
9.8.7 Для определения количества клеток аэробного азотофиксатора — Azotobacter chroococcum применяют метод предельного разведения, используя жидкую среду Бейеринка по 6.24.
9.8.8 Пробирки инкубируют при температуре 28 °C — 30 °C, учет проводят на пятые — седьмые сутки. При наличии азотобактера на поверхности среды образуется пленка.
9.8.9 Для учета азотобактера используют также посев на плотную среду Эшби по 6.25. Чашки инкубируют при температуре 28 °C — 30 °C в течение пяти — семи суток.
СОСТАВ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ РАСТВОРОВ
Состав дезинфицирующих растворов приведен в таблице А.1.
СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, ПОСУДЫ И ДРУГИХ ЛАБОРАТОРНЫХ МАТЕРИАЛОВ
Б.1 Способы стерилизации питательных сред, посуды и других лабораторных материалов приведены в таблице Б.1.
ЗАВИСИМОСТЬ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЖИДКОСТЕЙ ОТ ОБЪЕМА СОСУДОВ
В.1 Зависимость продолжительности стерилизации жидкостей от объема сосудов приведена в таблице В.1.
СХЕМА ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАЗВЕДЕНИЙ И ПОСЕВА СУСПЕНЗИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ШПАТЕЛЕМ
Г.1 Схема приготовления разведений и посева суспензии микроорганизмов шпателем (в соответствии с 8.3.1 - 8.3.6) приведена на рисунке Г.1.
ЭКСПРЕСС-ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ УЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ ПО МЕТОДУ ПРЕДЕЛЬНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ (ТАБЛИЦА МАК-КРЕДИ)
Д.1 Экспресс-обработка результатов учета микроорганизмов по методу предельных разведений (таблица Мак-Креди) в соответствии с 8.3.11 - 8.3.12 приведена в таблице Д.1.
СХЕМА ОЦЕНКИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ОРГАНИЧЕСКИХ УДОБРЕНИЙ
Е.1 Схема оценки микробиологических характеристик органических удобрений приведена на рисунке Е.1.
БИБЛИОГРАФИЯ
| [1] | СП 1.2.036-95 | Санитарные правила. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмами III — IV групп патогенности |
|---|---|---|
| [2] | СП 1.3.2322-2008 | Санитарные правила. Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней |
| [3] | СанПиН 2.1.4.559-96 | Гигиенические требования и нормативы качества питьевой воды |
| [4] | ГН 2.1.5.1315-2003 | Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования |
| УДК 631.86.354:006.354 | ОКС 65.080 |
| Ключевые слова: органические удобрения, методы микробиологического анализа, отбор проб, подготовка проб, питательные среды, разведение, посев, учет микроорганизмов | |