МУК 4.2.3852-23. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания

№ МУК 4.2.3852-23Действующий акт

(утв. Роспотребнадзором 30.03.2023)

Примечание

Взамен МУК 4.2.3065-13, утв. Руководителем Роспотребнадзора, Главным государственным санитарным врачом РФ 14.07.2013.

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 30 марта 2021 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ

И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3852-23

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.А. Мельникова); ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора (О.Ю. Борисова, С.Ю. Комбарова, А.С. Пименова, Н.Т. Гадуа, И.А. Чагина, И.Ю. Андриевская, А.А. Басов, Н.М. Максимова, С.Э. Адугюзелов, Н.В. Смирнова); ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора (Л.А. Краева, Н.Н. Курова); ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора (И.А. Дятлов, О.В. Полосенко, М.В. Храмов); ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» Роспотребнадзора (И.П. Требунских, Н.А. Сидорова, Л.Н. Бойко, Н.Я. Салова); ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Санкт-Петербурге и Ленинградской области» Роспотребнадзора (Т.М. Кузьмина, М.А. Кузакова, А.А. Юрецкая, Е.В. Смирнова); ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области» Роспотребнадзора (А.М. Рябова).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 марта 2023 г.

3. МУК 4.2.3852-23 введены взамен МУК 4.2.3065-13 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции», утвержденных Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 14.07.2013.

I. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) определяют методические основы и алгоритмы лабораторной диагностики дифтерийной инфекции в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <1>, а также методическими документами <2>.

<1> Главы III, IV, XXXVIII СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный № 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 № 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный № 67587); от 25.05.2022 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный № 68934) (далее — СанПиН 3.3686-21).

<2> МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности», утвержденные Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009 (далее — МУ 1.3.2569-09).

1.2. МУК предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами научно-исследовательских, медицинских организаций, бактериологических лабораторий и клинико-диагностических лабораторий, осуществляющими лабораторную диагностику дифтерийной инфекции.

1.3 МУК носят рекомендательный характер.

II. Сущность метода

2.1. Дифтерия — острое антропонозное инфекционное заболевание (токсикоинфекция), которое характеризуется фибринозным воспалением в месте входных ворот и интоксикацией организма с преимущественным поражением сердца, почек, нервной системы.

Возбудитель дифтерии — коринебактерии дифтерии Corynebacterium diphtheriae (C. diphtheriae), продуцирующие дифтерийный токсин (экзотоксин). Источником инфекции является больной или бактерионоситель токсигенных C. diphtheriae. Основной механизм передачи — воздушно-капельный, также существует контактно-бытовой; пути передачи — аэрозольный и контактно-бытовой.

Нетоксигенные C. diphtheriae, не продуцирующие экзотоксин, не вызывают дифтерийную инфекцию; данные микроорганизмы выделяются при фарингите, артрите, эндокардите и других гнойно-воспалительных заболеваниях.

2.2. Основным методом лабораторной диагностики дифтерийной инфекции с диагностической целью является бактериологический. Для лабораторной диагностики дифтерийной инфекции с диагностической целью рекомендуется параллельно с бактериологическим методом использовать молекулярно-генетический метод (далее — ПЦР-исследование). У больного биологический материал параллельно забирается из носоглотки (2 тампона) и ротоглотки (2 тампона) и направляется для проведения параллельного бактериологического исследования и ПЦР-исследования (прилож. 1 к настоящим МУК). Для лабораторной диагностики дифтерийной инфекции с профилактической целью и по эпидемиологическим показаниям производится взятие биоматериала из ротоглотки и носоглотки и проводится бактериологическое исследование и (или) ПЦР-исследование (прилож. 2 к настоящим МУК). Результаты ПЦР-исследования получают в течение 24 ч с момента взятия биоматериала. Поступивший биологический материал (первичные тампоны) не сбрасывается до момента получения окончательного ответа и при наличии положительного результата направляется в Референс-центр по мониторингу за возбудителями кори, краснухи, эпидемического паротита, коклюша и дифтерии ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора <3> (далее — Референс-центр) (см. прилож. 1, 2 к настоящим МУК).

<3> Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации».

При получении положительного результата в ПЦР-исследовании у больного (бактерионосителя) производится повторное взятие биологического материала из носоглотки и ротоглотки и проводится бактериологическое исследование, а положительный образец биоматериала и ДНК-образец в течение 48 ч направляются для верификации в Референс-центр. При получении положительного результата в бактериологическом исследовании первичный биологический материал (тампоны) и бактериальная культура в течение 48 ч направляются в Референс-центр для верификации (прилож. 1, 2 к настоящим МУК).

Бактериологическое исследование и ПЦР-исследование проводятся с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции, подтверждения эпидемиологических связей и наблюдения за циркуляцией токсигенных коринебактерий дифтерии.

При бактериологическом исследовании производится выявление возбудителя дифтерии с помощью минимального количества диагностических тестов, необходимых, достаточных и специфичных для получения достоверного ответа в максимально сжатые сроки: не более 3 суток — отрицательный ответ, 3 — 4 суток — ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии (возбудителя дифтерии), 4 — 5 суток — ответ о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии или других представителей рода Corynebacterium (прилож. 3 к настоящим МУК). ПЦР-исследование проводится в течение 24 ч с момента взятия биологического материала. Несвоевременное выявление носителей токсигенных C. diphtheriae бактериологическим методом приводит к скрытому распространению возбудителя дифтерии и возникновению новых очагов дифтерийной инфекции.

В тех случаях, когда при первичном посеве исследуемого материала от больных дифтерией или бактерионосителей выделяются токсигенные, а при повторных обследованиях после лечения антибиотиками нетоксигенные коринебактерий дифтерии предполагается, что токсигенные и нетоксигенные C. diphtheriae колонизировали слизистые ротоглотки и носа одновременно. При лечении антибиотиками исчезают токсигенные штаммы как более чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммы продолжают выделяться. Обнаружение только нетоксигенных штаммов при повторных обследованиях после лечения нельзя трактовать как утрату способности токсигенных штаммов продуцировать экзотоксин.

2.3. Таксономически близкими к виду C. diphtheriae являются Corynebacterium ulcerans (C. ulcerans) и Corynebacterium pseudotuberculosis (C. pseudotuberculosis) — патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, домашних животных, способные вырабатывать дифтериеподобный экзотоксин и вызывать заболевания у человека. Известны случаи выделения токсигенных C. ulcerans при клинической картине заболевания, сходной с дифтерией (дифтериеподобное заболевание), а также токсигенных C. pseudotuberculosis, вызывающих лимфадениты.

2.4. На слизистых оболочках ротоглотки и носоглотки встречаются и другие представители рода Corynebacterium, являющиеся как представителями нормальной микробиоты организма человека, так и условно-патогенными микроорганизмами, которые выделяются при различных гнойно-воспалительных патологических состояниях. К настоящему времени выделено и описано 130 представителей рода Corynebacterium, выделенных из различных биотопов организма человека.

2.5. На селективных дифференциально-диагностических питательных средах (далее — плотная питательная среда), содержащих теллурит калия, колонии микроорганизмов рода Corynebacterium имеют характерные культурально-морфологические свойства, и цвет колоний варьирует от темно-серого, серо-черного до черного. Колонии, морфология которых характерна для микроорганизмов рода Corynebacterium, изучаются по всем рекомендованным идентификационным тестам. Умение выделять коринеформные микроорганизмы (Corynebacterium spp.) является критерием оценки качества работы бактериологических лабораторий, особенно в период снижения и спорадической заболеваемости дифтерией. Сомнительные колонии с нехарактерными морфологическими свойствами подвергаются микроскопии. Если в мазках обнаруживаются коринеформные микроорганизмы, рекомендуется продолжить исследование по всем необходимым идентификационным тестам.

Посев биологического материала из ротоглотки и носоглотки на кровяной агар производить нецелесообразно, т.к. сложно получить рост изолированных колоний C. diphtheriae на данной среде из-за обильного роста другой сопутствующей микрофлоры.

2.6. Окрашивание мазков осуществляется по Леффлеру (щелочной метиленовый синий) или с использованием других синих красителей. Окраска по Граму не применяется, т.к. в процессе окраски клетки грамположительных C. diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и выглядят грамотрицательными (розовый оттенок).

2.7. В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства микробной клетки или культурально-морфологические свойства колоний при идентификации C. diphtheriae недостаточно и рекомендуется проводить комплекс идентификационных тестов. Основной специфический тест для выявления возбудителя дифтерии, правильная постановка которого является залогом успешной диагностики дифтерийной инфекции, — определение у выделенной культуры способности к продукции дифтерийного токсина. Определение продукции токсина начинается в первый день появления роста изолированных колоний на чашках с плотной питательной средой, без накопления чистой культуры. Получение чистой культуры является полезным при дальнейшем исследовании биологических свойств коринебактерий. При выделении нетоксигенных штаммов C. diphtheriae от больных с подозрением на дифтерийную инфекцию рекомендуется обращать внимание на правильность проведения бактериологического исследования и оценку токсигенных свойств.

2.8. Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств коринебактерий данный признак изучается у всех подозрительных колоний (20 и более) с чашек первичного посева. При множественном росте подозрительных колоний не рекомендуется ограничиваться формированием только 1 — 2 бляшек. Рекомендуется изучать токсигенные свойства отдельных изолированных колоний, чтобы не потерять нетоксигенные штаммы C. diphtheriae, присутствие которых возможно при наличии токсигенных C. diphtheriae в биологическом материале.

Используются 2 способа постановки пробы на токсигенность:

модифицированная проба Элека с бумажными полосками, утвержденная для бактериологической практики в нашей стране в 1961 г.;
проба Фельдмана Ю.Г. и соавторов с бумажными дисками, разработанная в нашей стране и утвержденная в 1988 г. <4>

<4> Методические рекомендации по применению модифицированной среды Пизу и индикаторных бумажных дисков для идентификации, биохимического типирования и определения токсигенности дифтерийных микробов, утвержденные начальником Главного эпидемиологического управления Министерства здравоохранения СССР № 28-6/31.

В пробе на токсигенность используется антитоксин — противодифтерийные антитоксические антитела, очищенные методом специфической сорбции, что исключает появление неспецифических линий преципитации микробного происхождения. В исключительных случаях при отсутствии антитоксина применяется лечебная противодифтерийная антитоксическая лошадиная сыворотка. В таком случае могут появляться неспецифические линии преципитации микробного происхождения, которые отличаются от специфических линий токсического происхождения. Лошадиная сыворотка крови для внесения в питательную среду в пробе на токсигенность не используется (т.к. в лошадиную сыворотку для увеличения сроков хранения добавляются консерванты, в составе лошадиной сыворотки может содержаться избыточное количество железа из гемолизированных эритроцитов или избыточный уровень дифтерийного антитоксина, что приводит к торможению токсинообразования или к появлению неспецифических усов преципитации).

2.9. C. diphtheriae подразделяется на биохимические варианты (биовары) — gravis, mitis, intermedius, belfanti, и с 2018 г. выделяется подвариант C. diphtheriae subsp. lausannense [6, 21]. В бактериологическом исследовании проводится идентификация биовара gravis, биоваров mitis и intermedius (вместе), биовара belfanti и subsp. lausannense (вместе). Биовар intermedius отдельно не выделяется, т.к. дифференцирующими признаками от биовара mitis являются только размер колоний и наличие липофильности; subsp. lausannense также отдельно не выделяется, т.к. дифференцирующим признаком от биовара belfanti является ферментация N-ацетилглюкозамина (является технически сложным признаком).

2.10. Для идентификации могут использоваться следующие биохимические тесты: на цистиназу, уреазу, нитратредуктазу, ферментацию глюкозы, сахарозы и крахмала. При проведении бактериологической диагностики дифтерии определение видовой принадлежности других (недифтерийных) представителей рода Corynebacterium не является обязательным.

2.11. Для точной идентификации до вида недифтерийных представителей рода Corynebacterium вместо биохимических тестов рекомендуется применение молекулярно-генетических методов исследования — секвенирование фрагментов 16S рРНК. Для биохимической идентификации выпускаются зарегистрированные в установленном порядке на территории Российской Федерации биохимические тест-системы (наборы реагентов), которые используются для идентификации C. diphtheriae, C. ulcerans и C. pseudotuberculosis при обязательном прохождении внутрилабораторного контроля качества.

2.12. Использование масс-спектрометрических технологий (MALDI-TOF масс-спектрометрия) и автоматических бактериологических анализаторов не является информативным в лабораторной диагностике дифтерийной инфекции, т.к. не идентифицируется главный признак возбудителя дифтерии — токсигенность, а также биовар возбудителя. Данные методы используются для видовой идентификации.

2.13. При проведении биохимического теста на цистиназу рекомендуется учитывать способность бактерий Morganella morganii (M. morganii, семейство Enterobacteriaceae) давать положительный тест на цистиназу. Являясь условно-патогенным микроорганизмом, M. morganii вызывает инфекции полости рта. При росте культур C. diphtheriae в средах Пизу отмечается рост культуры в глубине среды и по уколу. Среда в глубине столбика чернеет, а вокруг укола образуется черно-коричневое облачко. При росте культуры M. morganii в средах Пизу облачко не образуется, а рост сопровождается диффузным изменением окраски среды в черно-коричневый цвет. Некоторые представители семейства Enterobacteriaceae, например Proteus mirabilis (P. mirabilis), образуют H2S на среде Пизу с почернением по ходу укола.

III. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции

3.1. Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterium (семейство Corynebacteriaceae, подпорядок Corynebacterineae, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria), включающему большое количество коринеформных бактерий, являющихся представителями микробиома человека, патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, которые выделяются при различных гнойно-воспалительных патологических состояниях.

Возбудителя дифтерии в дифтерийной пленке впервые в 1883 г. обнаружил патологоанатом Эдвин Клебс. В чистом виде культуру C. diphtheriae получил в 1884 г. бактериолог Фридрих Леффлер (ученик Р. Коха). В 1888 г. бактериологи Пьер Поль Эмиль Ру (ученик Л. Пастера) и Александр Йерсен выделили из фильтрата культуры токсигенного штамма C. diphtheriae дифтерийный экзотоксин. Микробиолог и гистопатолог Виктор Бабеш описал метахроматические гранулы (зерна волютина) в цитоплазме C. diphtheriae (тельца Бабеша-Эрнста).

3.2. К патогенным бактериям, которые способны продуцировать токсин, подобный дифтерийному, и вызывать инфекционные заболевания, относятся C. ulcerans и C. pseudotuberculosis. Эти микроорганизмы являются потенциально опасными не только для животных (крупный и мелкий рогатый скот, лошади, домашние животные), но и для человека. В первом случае данные микроорганизмы провоцируют развитие гнойно-воспалительных заболеваний, а во втором — развитие дифтериеподобных поражений ротоглотки и мягких тканей. Начиная с 1990-х гг., за рубежом появились сообщения о выделении C. ulcerans от пациентов с ларингитами тяжелого течения при наличии налетов псевдомембранозного характера. Также участились случаи выделения токсигенных штаммов C. ulcerans от домашних кошек, вследствие чего сформировалось настороженное отношение к этому микроорганизму, и был организован мониторинг за циркуляцией данного возбудителя.

3.3. Устойчивость к факторам внешней среды. C. diphtheriae устойчивы к низкой и чувствительны к высокой температуре (низкие температуры длительное время не убивают бактерии; под действием прямого солнечного света бактерии гибнут в течение нескольких дней); устойчивы во внешней среде и длительно сохраняют жизнеспособность в дифтерийной пленке, в капельках слюны, на ручках дверей, одежде, постельных принадлежностях, предметах в окружении больного: на игрушках — до 14 дней, в пыли — до 5 недель, на полу — до 18 — 40 дней, в сухой дифтерийной пленке — до 7 недель; в воде выживают до 20 дней. Коринебактерии дифтерии неустойчивы к действию физических методов дезинфекции и химических обеззараживающих средств. Хлорсодержащие и кислородсодержащие дезинфицирующие средства активны в отношении коринебактерий дифтерии в режимах, рекомендуемых для обеззараживания объектов при бактериальных инфекциях; погибают при нагревании до плюс (60 +/- 1) °C в течение 10 мин, при кипячении — моментально.

3.4. Морфологические и тинкториальные свойства. Род Corynebacterium гетерогенный, как и группа, условно объединившая его и другие роды грамположительных палочек, не образующих споры размером 0,3 — 0,8 x ,5 — 8,0 мкм, неподвижных, обладающих различной степенью полиморфизма и плеоморфизма.

C. diphtheriae имеют размер 0,2 — 0,6 x 1,0 7,0 мкм. Для C. diphtheriae характерен значительный полиморфизм — разнообразие размеров и форм клеток. Клетки имеют форму (например, булавы, ракетки, палочки, овоида). Клетки C. ulcerans и C. pseudotuberculosis имеют овоидную форму. На кровяных теллуритовых средах (далее — КТА) овоидную форму часто приобретают токсигенные C. diphtheriae.

Арабиногалактановый полимер клеточной стенки C. diphtheriae отличает этот вид от всех других видов рода Corynebacterium. Клеточная стенка C. diphtheriae имеет от 3 — 5 до 7 — 9 слоев. Известно, что клеточная стенка токсигенных C. diphtheriae лучше дифференцирована и более тонкая по сравнению с клеточной стенкой нетоксигенных C. diphtheriae и других коринеформных микроорганизмов этого рода, что определяет их отношение к антибиотикам: токсигенные более чувствительны, чем нетоксигенные к пенициллину, рифампицину и макролидам. Циркулируют штаммы C. diphtheriae, устойчивые к некоторым антибактериальным препаратам, преимущественно выделенные от бактерионосителей.

Коринеформные бактерии отличаются особым расположением в препарате в виде римских пятерок (v). Подобную форму клетки приобретают при делении. Для некоторых коринебактерий, кроме C. diphtheriae, возможно параллельное расположение клеток.

Все коринебактерии — грамположительные. При окраске преимущественно обнаруживается выраженная внутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зерен волютина (метахроматические гранулы, тельца Бабеша-Эрнста). Описано сродство волютина к метиленовому синему (окраска по Леффлеру), поэтому при обработке этим красителем гранулы или полоски (скопления гранул) прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях приобретает розовый оттенок. В бактериологической практике окраска по Граму не используется, поскольку клетки C. diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и выглядят в мазке как грамотрицательные микроорганизмы. При окраске по Нейссеру клетки C. diphtheriae окрашиваются в желтый цвет с зернами волютина (на концах клетки) темно-коричневого цвета (иногда с синим оттенком).

3.5. Культурально-морфологические свойства. Большинство видов коринебактерий растет в аэробных условиях, в т.ч. и микроорганизмы вида C. diphtheriae. C. diphtheriae являются факультативными анаэробами (генерируют энергию, используя как молекулярный O2, так и органические соединения), что учитывается при изучении их ферментативной активности.

Все коринебактерии, в т.ч. и C. diphtheriae, являются мезофилами и растут при плюс (37 +/- 1) °C.

C. diphtheriae так же, как и другие коринебактерии, растут на питательных средах, сбалансированных по своему составу, и не растут на простых питательных средах. Для культивирования C. diphtheriae и некоторых других коринебактерий, в частности C. ulcerans и C. pseudotuberculosis, используются кровяные теллуритовые среды (КТА, Клауберг II) и Коринебакагар (далее — КБА), которые остаются основными селективными дифференциально-диагностическими средами, обеспечивающими рост колоний через 24 ч, что на одни сутки сокращает сроки выдачи окончательного бактериологического ответа. В состав кровяных теллуритовых сред входит теллурит калия, к которому коринебактерии хорошо устойчивы в отличие от многих других возбудителей. Имеются коринебактерии, которые не вырастают в присутствии теллурита калия. В кровяные теллуритовые среды добавляется кровь (например, крупного рогатого скота (далее — ККРС) или баранья кровь как источник аминокислот, ростовых факторов, железа). В качестве основы этой среды используется коммерческий сухой питательный агар (ГРМ-агар, питательная среда № 1 ГРМ), сухой питательный агар (далее — СПА), Основа кровяного агара (англ. Blood agar base), Колумбийский агар (англ. Columbia agar base), агар Хойла (англ. Hoyle Medium Agar), среда для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (далее — среда АГВ). В составе среды КБА содержится стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (далее — СРГМ), используемый в качестве заменителя крови. Все питательные среды, основы и ингредиенты сред, используемые для приготовления сред первичного посева, подвергаются внутрилабораторному контролю качества. Культурально-морфологические свойства клинически значимых коринебактерий на плотных питательных средах первичного посева представлены в приложении 4 к настоящим МУК.

Коринебактерии растут на жидких питательных средах — в бульоне (ГРМ-бульон, сердечно-мозговой бульон): для C. diphtheriae биовара gravis и subsp. lausannense характерна поверхностная пленка, диффузное помутнение среды с образованием осадка через 24 ч; для C. diphtheriae биоваров mitis и belfanti — бульон прозрачен, на дне пробирки через 24 ч организуется осадок; для C. diphtheriae биовара intermedius — помутнение среды с последующим оседанием осадка на дно пробирки через 24 ч; для C. ulcerans — поверхностная пленка, диффузное помутнение среды с образованием осадка через 24 ч; для C. pseudotuberculosis — бульон прозрачен, на дне пробирки через 24 ч организуется осадок.

Колонии микроорганизмов из рода Corynebacterium на кровяном и сывороточном агарах имеют окраску от серовато-белой до желтой, непрозрачные или полупрозрачные, приподнятые, округлой формы, диаметром 0,5 — 3 мм. Они бывают мягкой, маслянистой консистенции, хотя некоторые виды рода Corynebacterium, в т.ч. C. diphtheriae биовар gravis, C. diphtheriae subsp. lausannense и C. pseudotuberculosis, образуют шероховатые колонии и крошатся при прикосновении. Для колоний C. diphtheriae биовара gravis отмечается легкая изрезанность края, для C. pseudotuberculosis — неровность поверхности. При росте на кровяном агаре у некоторых штаммов C. diphtheriae и C. ulcerans образуются зоны гемолиза.

3.6. Ферментативная активность. Ферментативная активность коринебактерий изучается путем определения ферментов цистиназы, уреазы, нитратредуктазы, способности расщеплять до кислоты глюкозу, сахарозу и крахмал (табл. 1).

Таблица 1

Биохимические свойства клинически значимых коринебактерий

Вид коринебактерий

Основные тесты

Дополнительные тесты

Токсигенность

Цистиназа

Уреаза

Редукция нитратов

Ферментация

глюкоза

сахароза

крахмал

Трегалоза

Обратный CAMP-тест

Гидролиз желатина

Липофильность

N-ацетилглюкозамин

C. diphtheriae биовар gravis

+/-

н/о

C. diphtheriae биовар mitis

+/-

н/о

C. diphtheriae биовар belfanti

+/-

н/о

C. diphtheriae биовар intermedius

+/-

н/о

C. diphtheriae subsp. lausannense

- <**>

н/о

C. ulcerans

+/-

+
при 25 °C

C. pseudotuberculosis

+/-

+ <*>

В1

-
при 25 °C

Примечание:
В1 — вариабельные свойства, положительно у 21% — 89% штаммов;
н/о — не определяется;
<*> — циркулируют штаммы, дающие в этом тесте отрицательный результат;
<**> — к настоящему времени не описаны токсигенные варианты subsp. lausannense

C. diphtheriae продуцируют фермент цистиназу, не продуцируют фермент уреазу, разлагают глюкозу, крахмал (биовар gravis), не разлагают сахарозу. Биовар mitis не разлагает крахмал. C. diphtheriae биоваров gravis, mitis и intermedius восстанавливают соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты). C. diphtheriae биовар belfanti и C. diphtheriae subsp. lausannense не восстанавливают соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты). C. ulcerans продуцируют ферменты цистиназу и уреазу, разлагают глюкозу, крахмал, не разлагают сахарозу, не восстанавливают соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты). C. pseudotuberculosis продуцируют ферменты цистиназу (циркулируют штаммы, не продуцирующие цистиназу) и уреазу, разлагают глюкозу, сахарозу (вариабельный признак), не разлагают крахмал, способность восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты) является вариабельным признаком.

3.7. Токсигенные свойства. C. diphtheriae, вызывающие заболевание дифтерией, обладают токсигенными свойствами. Способность C. diphtheriae вырабатывать экзотоксин опосредована феноменом фаговой (лизогенной) конверсии. Основным геном патогенности C. diphtheriae, отвечающим за токсинообразование, является ген дифтерийного токсина (далее — ген tox). Конверсия нетоксигенных штаммов C. diphtheriae в токсигенные воспроизводится только в особых экспериментальных условиях.

Среди нетоксигенных штаммов C. diphtheriae регистрируются нетоксигенные токснесущие штаммы, которые имеют «молчащий» ген tox и не продуцируют дифтерийный экзотоксин из-за мутаций в этом гене. Распространенность таких штаммов в различные периоды эпидемического процесса составляет от 2% до 20% от популяции нетоксигенных штаммов. Эпидемиологическое значение нетоксигенных токснесущих штаммов до конца не изучено.

IV. Показания к обследованию

4.1 Бактериологическому и молекулярно-генетическому обследованию на наличие возбудителя дифтерии подлежат:

больные дифтерией или с подозрением на это заболевание, а также лица, контактировавшие с ними;
больные с диагнозами острый тонзиллит, острый фарингит, ларинготрахеит, ларингит, круп, ретрофарингеальный абсцесс, перитонзиллярный абсцесс, инфекционный мононуклеоз; раневые инфекции, по клиническим проявлениям подозрительные на дифтерийную этиологию;
лица, поступающие на работу в детские дома, дома ребенка, интернаты психоневрологического профиля для детей и взрослых, противотуберкулезные детские санатории, а также дети и взрослые, направляемые в эти учреждения.

4.2. Фибринозный налет при дифтерийной инфекции носит пленчатый характер, плотно спаянный с подлежащей тканью, чаще всего бывает серо-белого цвета. В ротоглотке налет покрывает небные миндалины, распространяется на небные дужки, мягкое небо, боковые стенки глотки, гортань.

4.3 В зависимости от локализации процесса и его тяжести принято различать следующие клинические формы дифтерии:

дифтерия носа (катаральная, пленчатая, распространенная, токсическая);
дифтерия ротоглотки: локализованная (катаральная, островчатая, пленчатая), распространенная, токсическая;
дифтерия гортани (круп локализованный);
дифтерия гортани и трахеи (круп распространенный), дифтерия гортани, трахеи и бронхов (круп нисходящий);
дифтерия другой локализации (глаз, уха, половых органов, кожи, ран).

V. Организационно-методическая работа

5.1. Все работы по взятию, транспортированию и подготовке проб биологического материала, проведение бактериологических, ПЦР и серологических исследований, сбор, хранение и утилизация отходов осуществляются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <5>, а также методическими документами <6>.

<5> Главы III, IV, XXXVIII СанПиН 3.3686-21; глава X СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 3 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021, регистрационный № 62297), с изменениями, внесенными постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 26.06.2021 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 07.07.2021, регистрационный № 64146); от 14.12.2021 № 37 (зарегистрировано Минюстом России 30.12.2021, регистрационный № 66692); от 14.02.2022 № 6 (зарегистрировано Минюстом России 17.02.2022, регистрационный № 67331) (далее — СанПиН 2.1.3684-21).

<6> Глава X МР 2.1.0246-21 «Методические рекомендации по обеспечению санитарно-эпидемиологических требований к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий», утвержденных Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 17.05.2021 (далее — МР 2.1.0246-21); Р 3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях», утвержденное Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения России 04.03.2004 (далее — Р 3.5.1904-04).

5.2. Взятие биологического материала проводится медицинским персоналом медицинских организаций (врачами, средним медицинским персоналом) с использованием средств индивидуальной защиты (далее — СИЗ) (например, медицинской маски, респиратора, защитного экрана). Взятие биологического материала проводится в специально выделенном для этих целей помещении при хорошем освещении. В отдельных случаях взятие материала производится на дому.

5.3. На доставляемый в бактериологические и клинико-диагностические лаборатории материал оформляется направление, в котором указывается:

наименование медицинской организации, направившей материал на исследование, телефон, адрес электронной почты (по возможности);
фамилия, имя, отчество (при наличии), возраст, адрес места проживания, адрес постоянной регистрации обследуемого;
место локализации взятого биологического материала (например, нос, ротоглотка, кожа, наружный слуховой проход, гениталии);
используемый метод диагностики;
предполагаемый диагноз и цель обследования (диагностическая, профилактическая, по эпидемиологическим показаниям);
дата заболевания или контакта с больным;
данные о вакцинации (вакцинирован: даты и количество полученных доз с указанием вакцины/не вакцинирован: нет данных);
кратность обследования;
фамилия, имя, отчество (при наличии), должность, подпись и контактный телефон лица, взявшего материал (разборчиво).

Сопроводительные документы помещаются в индивидуальную упаковку отдельно от биологического материала и прикрепляются снаружи контейнера.

5.4. Медицинский персонал медицинских организаций (врачи, средний медицинский персонал), допущенный к взятию и посеву биологического материала, проходит входящий и затем периодический инструктаж на рабочем месте 1 раз в 6 месяцев <7>. Инструктаж по взятию проводит врач-инфекционист с привлечением врача-бактериолога (при наличии его в штате медицинской организации) и регистрацией в соответствующем журнале с указанием подписей инструктируемого и инструктирующего и даты проведения инструктажа.

<7> Пункт 2934 главы XXXVIII СанПиН 3.3686-21.

5.5. Бактериологические, ПЦР и серологические исследования проводятся специалистами (врачами-бактериологами, врачами-вирусологами, биологами, врачами-медицинскими микробиологами, врачами клинической лабораторной диагностики), прошедшими подготовку и периодическое повышение квалификации в установленном порядке <8>.

<8> Приказ Минздрава России от 08.10.2015 № 707н «Об утверждении Квалификационных требований к медицинским и фармацевтическим работникам с высшим образованием по направлению подготовки „Здравоохранение и медицинские науки“ (зарегистрировано Минюстом России 23.10.2015, регистрационный № 39438) с изменениями, внесенными приказами Минздрава России от 15.06.2017 № 328н (зарегистрировано Минюстом России 03.07.2017, регистрационный № 47273), от 04.09.2020 № 940н (зарегистрировано Минюстом России 01.10.2020, регистрационный № 60182); приказ Минздрава России от 18.05.2021 № 464н „Об утверждении Правил проведения лабораторных исследований“ (зарегистрировано Минюстом России 23.10.2015, регистрационный № 39438) с изменениями, внесенными приказом Минздрава России от 23.11.2021 № 1088н (зарегистрировано Минюстом России 30.11.2021, регистрационный № 66103).»

Подготовительную работу при проведении бактериологических, ПЦР и серологических исследований (прием поступающих образцов и сопроводительных документов, регистрацию биологического материала, проведение технических манипуляций, например подготовку помещений, ламинарных боксов, расходных материалов, утилизацию использованных расходных материалов и остатков использованных биологических образцов) выполняет специалист со средним медицинским образованием и соответствующей квалификацией (медицинский технолог, медицинский лабораторный техник, фельдшер-лаборант, лаборант), имеющий сертификат специалиста и прошедший периодическое повышение квалификации в установленном порядке <9>.

<9> Федеральный закон от 21.11.2011 № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» (далее — Федеральный закон от 21.11.2011 № 323-ФЗ); приказ Минздрава России от 10.02.2016 № 83н «Об утверждении Квалификационных требований к медицинским и фармацевтическим работникам со средним медицинским и фармацевтическим образованием» (зарегистрировано Минюстом России 09.03.2016, регистрационный № 41337).

5.6. Результаты исследования оформляются в регистрационном и рабочем журналах в бумажной форме (возможно дублирование в электронной форме) и на бланке выдачи результатов. В бланке результатов указывается следующая информация:

наименование бактериологической/клинико-диагностической лаборатории и медицинской организации;
информация о пациенте, достаточная для его идентификации (прием антибиотиков (при наличии);
наименование биологического материала, локализация места взятия материала (нос/зев/другая локализация);
дата взятия материала для исследования;
дата проведения исследования;
результаты исследования (с указанием тест-систем при ПЦР-исследовании);
фамилия, имя, отчество (при наличии) и подпись сотрудника, выполнившего исследование.

5.7. Методическую помощь по вопросам взятия, транспортирования и лабораторной диагностики дифтерийной инфекции осуществляют ФБУЗ центры гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации и Референс-центр.

5.8. Все первичные тампоны с биологическим материалом, взятым от пациентов, сохраняются до полного окончания проведения бактериологического исследования и ПЦР-исследования. Тампоны с биологическим материалом для бактериологического исследования до окончания проведения исследования хранятся в бактериологической лаборатории при температуре плюс (2 — 8) °C; ПЦР-образцы для ПЦР-исследования до окончания исследования хранятся в клинико-диагностической лаборатории при температуре не выше минус 16 °C.

5.9. ФБУЗ центры гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации и бактериологические лаборатории в субъектах Российской Федерации направляют в Референс-центр для верификации все выделенные токсигенные C. diphtheriae, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis вместе с первичными тампонами, взятыми от пациентов, не позднее двух рабочих дней с момента их выделения; нетоксигенные штаммы C. diphtheriae, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis, штаммы с атипичными свойствами, а также штаммы других представителей рода Corynebacterium, выделенные при обследовании на дифтерийную инфекцию (до 50 штаммов в год), — в течение 1 месяца после их выделения. Штаммы C. ulcerans передаются в Референс-центр на верификацию, т.к. токсигенные свойства этого микроорганизма проявляются нестабильно. ФБУЗ центры гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации и клинико-диагностические лаборатории в субъектах Российской Федерации направляют в Референс-центр для верификации все положительные образцы биоматериала и ДНК-образцы, содержащие ДНК C. diphtheriae/C. ulcerans токсигенных, не позднее 2 рабочих дней с момента их выделения и до 50 образцов биоматериала и ДНК-образцов, содержащих ДНК C. diphtheriae/C. ulcerans нетоксигенных, в течение 14 дней с момента выделения.

В Референс-центре проводится верификация культур, образцов биоматериала, ДНК-образцов и молекулярно-генетические исследования: с помощью ПЦР на выявление нетоксигенных токс-несущих штаммов, ПЦР в режиме реального времени для подтверждения токсигенности возбудителя, мультилокусное сиквенс-типирование и полногеномное секвенирование для установления генотипа циркулирующих штаммов и изучения факторов патогенности, а также секвенирование других коринебактерий для их точной видовой идентификации. По результатам верификации и генотипирования Референс-центр может направлять информацию в ФБУЗ центры гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации, бактериологические лаборатории в субъектах Российской Федерации и клинико-диагностические лаборатории в субъектах Российской Федерации.

5.10. Референс-центр осуществляет внешний контроль качества лабораторных исследований на дифтерийную инфекцию, проводимых в ФБУЗ центры гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации, а также в бактериологических и клинико-диагностических лабораториях в субъектах Российской Федерации (по согласованию).

VI. Требования безопасности

6.1. Бактериологические и клинико-диагностические лаборатории, в которых проводятся работы с объектами и материалами, содержащими или подозрительными на содержание патогенных биологических агентов (далее — ПБА) III — IV групп патогенности, должны иметь лицензию на данный вид деятельности <10> и санитарно-эпидемиологическое заключение в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <11>.

<10> Постановление Правительства Российской Федерации от 25.01.2022 № 46 «О лицензировании деятельности в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (за исключением случая, если указанная деятельность осуществляется в медицинских целях) и генно-инженерно-модифицированных организмов III и IV степеней потенциальной опасности, осуществляемой в замкнутых системах».

<11> Пункт 135 главы IV СанПиН 3.3686-21.

6.2. При выполнении бактериологических и серологических исследований необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. Все виды работ с химическими реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксированном помещении, оборудованном бактерицидными лампами и боксами микробиологической безопасности II класса в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <12>.

<12> Глава IV СанПиН 3.3686-21.

VII. Условия проведения исследований

7.1. Бактериологические, серологические и ПЦР-исследования проводятся с использованием необходимого оборудования, расходных материалов и реагентов (прилож. 5, 6, 7 к настоящим МУК).

7.2. Приготовление питательных сред и реактивов, проведение бактериологических и серологических исследований осуществляют в следующих условиях:

температура воздуха плюс (21,5 +/- 3,5) °C с учетом климатических особенностей;
атмосферное давление с учетом климатических особенностей разных регионов страны;
влажность воздуха не более 80%.

VIII. Бактериологическая диагностика

Взятие биологического материала для бактериологического исследования

8.1. Взятие биологического материала проводят из ротоглотки и носоглотки.

8.1.1. Взятие биологического материала на дифтерию производится 2 стерильными сухими тампонами.

8.1.2. Сухие вискозные, назофарингеальные, урогенитальные и мини-велюртампоны не используются. Предпочтительнее использование сухих ватных тампонов. Рекомендуется использовать тампоны в виде капли, не используются тампоны в виде веретена. Не используются тампоны, приготовленные из косметических ватных палочек.

8.1.3. Приготовление ватных тампонов может осуществляться в лабораторных условиях.

Приготовление ватных тампонов в лабораторных условиях. На один конец металлической легко сгибающейся проволоки плотно наматывают слой гигроскопической ваты. Длина намотки должна быть равной 3 — 4 см (во избежание аспирации ваты). Изготовленные тампоны в пробирках помещают в пакеты для стерилизации по 4 — 6 штук и стерилизуют в автоклаве при плюс (112 +/- 1) °C в течение 30 мин.

8.1.4. Взятие биологического материала на дифтерию допускается в жидкие транспортные системы на основе среды Эймса.

8.1.5. Биологический материал берется отдельными тампонами натощак или не ранее чем через 2 — 3 ч после еды до применения полоскания или других видов лечения или процедур. В течение 6 ч перед процедурой не используют медикаменты, орошающие носоглотку или ротоглотку, и препараты для рассасывания во рту. Взятие биологического материала производится с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка и внутренних поверхностей щек и зубов. Первым тампоном собирают материал с участков ротоглотки: миндалин, дужек мягкого неба, небного язычка, при необходимости — с задней стенки глотки. При наличии налетов биологический материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Вторым тампоном собирают биологический материал из носоглотки; для этого тампон вводят глубоко сначала в один, а потом в другой носовой ход, собирая материал со слизистых стенок и перегородки носа, при этом не касаясь крыльев носа снаружи.

8.1.6. При дифтерии других локализаций (глаза, уши, кожа, раны, гениталии), помимо биологического материала из пораженных участков, обязательно забирается материал из ротоглотки и носоглотки. При взятии биологического материала с конъюнктивы глаза допускается использование офтальмологического тампона. При показаниях к обследованию на дифтерию и одновременном наличии пораженных слизистых и кожи в углу рта обследование этих участков проводится отдельным тампоном и параллельно обязательно берется материал из ротоглотки и носоглотки.

8.1.7. При прямой ларингоскопии биологический материал (слизь, пленки) собирается непосредственно из гортани. В случаях оперативного вмешательства для бактериологического исследования следует брать слизь из интубационной трахеотомической трубки, которая забирается сухими тампонами, а также пленки, извлеченные при операции, которые помещаются в пробирку для дальнейшего проведения бактериологического исследования.

8.1.8. При исследовании на дифтерию пораженного участка кожи сначала необходимо протереть его поверхность промокательными движениями стерильной марлевой салфеткой или тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором, осторожно приподнять или отодвинуть струпья и корочки. После этого тампоном, предназначенным для взятия биологического материала на дифтерию, собрать секрет с пораженного участка. Одновременно обязательно забирают биологический материал из ротоглотки и носоглотки.

8.1.9. При постмортальном исследовании для выявления возбудителя дифтерии биологический материал следует брать с миндалин, гортани, полости носа (слизь, пленки) и кожи, при редких локализациях — с конъюнктивы, ушей, слизистой гениталий, пищевода и желудка. Учитывая, что дифтерия является токсикоинфекцией, другие органы (например, сердце, печень) обследуют только для выявления токсических поражений.

Транспортирование биологического материала

8.2 Транспортирование биологического материала может осуществляться 3 способами:

на сухих тампонах;
на плотных питательных средах (после посева биологического материала);
в транспортных средах (лабораторно приготовленных жидких транспортных средах или на жидких транспортных системах на основе среды Эймса).

8.2.1. Сухие тампоны. Биологический материал на сухих тампонах должен быть доставлен в бактериологическую лабораторию не позднее чем через 3 ч после взятия. До момента транспортировки сухие тампоны хранятся при комнатной температуре. Исследуемый биологический материал доставляется в сумках-термоконтейнерах при температуре плюс (37 +/- 1) °C, что позволяет защитить материал от прямых солнечных лучей и переохлаждения.

8.2.2. Посев на чашки первичного посева сразу после взятия биологического материала. При невозможности доставки исследуемого биологического материала в установленные сроки (не позднее 3 ч) или проведении обследования во второй половине дня материал из ротоглотки и носоглотки засевают на чашку Петри с питательной средой (разделенной пополам) техникой «площадки» с последующим рассевом этим же тампоном к середине чашки. При этом одна половина чашки Петри предназначена для материала из ротоглотки, другая — для материала из носоглотки. Затем посевы помещают в термостат при плюс (37 +/- 1) °C до утра следующего дня, после чего доставляют в сумках-термоконтейнерах в бактериологическую лабораторию (с обязательным указанием времени посева материала). При редких локализациях посев биологического материала из каждого пораженного участка осуществляется на отдельную чашку Петри с питательной средой.

8.2.3. Транспортные среды. При невозможности организовать посев биологического материала «чашечным методом» биологический материал для сохранения и подращивания возбудителя дифтерии допускается помещать в пробирки с жидкой транспортной средой, которая готовится в лабораторных условиях (п. 8.18). Не допускается использование коммерческих транспортных систем с агаризованной средой (в т.ч. с углем и без него), предназначенных для исследования на микрофлору ротоглотки и носа, в связи с тем, что состав этих сред не удовлетворяет условиям культивирования возбудителя дифтерии, что приводит к потере биологического материала, но стимулирует размножение другой микрофлоры. Допускается использование коммерческих жидких транспортных систем со средой Эймса, которые по ростовым свойствам удовлетворяют условиям культивирования возбудителя дифтерии. В случае использования транспортной среды, приготовленной в лабораторных условиях, или коммерческих жидких транспортных систем биологический материал собирается сухим тампоном, далее его опускают в пробирку со средой и транспортируют в лабораторном штативе в вертикальном положении.

Перед использованием каждой новой серии лабораторно приготовленной или коммерческой жидкой транспортной среды обязательным является проведение внутрилабораторного контроля качества с занесением сведений в журналы контроля качества питательных сред в установленном порядке.

8.2.4. Чашки Петри с питательной средой и пробирки с транспортной средой для посева биологического материала на дифтерию доставляются в медицинские организации из бактериологических лабораторий. Хранение питательных сред в медицинских организациях осуществляется в холодильнике при плюс (4 — 6) °C: чашки со средой — не более 7 дней, пробирки с лабораторно приготовленной транспортной средой — не более 7 дней. Перед взятием и посевом биологического материала их необходимо достать из холодильника и согреть до комнатной температуры. При невозможности круглосуточной доставки материала в бактериологическую лабораторию медицинские организации оснащаются термостатами.

8.2.5. В стационаре взятие биологического материала проводят круглосуточно, используя только «чашечный метод».

8.2.6. Исследуемый биологический материал из ротоглотки и носоглотки, собранный сухими тампонами (не менее 2 пробирок/тупферов от одного лица, при редких локализациях добавляются дополнительные пробирки), или материал из ротоглотки и носоглотки, засеянный в пробирки с транспортной средой (также не менее 2 пробирок от одного лица, при редких локализациях добавляются дополнительные пробирки), а также из мест редких локализаций, засеянный «чашечным методом», должен быть четко пронумерован и иметь сопроводительную документацию (п. 5.3). Пробирки с материалом от одного лица скрепляются вместе.

8.2.7. Биологический материал транспортируется в бактериологические лаборатории в сумках-термоконтейнерах (с обязательным указанием времени посева материала).

Условия использования транспортных сред

8.3. Применение транспортных сред определяется их типом и временем доставки.

8.3.1 Лабораторно приготовленная транспортная среда используется при следующих условиях:

если биологический материал будет транспортироваться в бактериологическую лабораторию в день забора (через временной промежуток более 3 ч), то биологический материал помещается в лабораторно приготовленную жидкую транспортную среду, после транспортировки помещается в термостат до утра следующего дня при температуре плюс (37 +/- 1) °C и на следующий день засевается на среды первичного посева;
если биологический материал забирается во второй половине дня и будет транспортироваться в бактериологическую лабораторию на следующий день, то биологический материал в лабораторно приготовленной жидкой транспортной среде помещается в термостат до утра при температуре плюс (37 +/- 1) °C, на следующий день транспортируется и засевается на среды первичного посева.

8.3.2 Коммерческие жидкие транспортные системы используются при следующих условиях:

если биологический материал будет транспортироваться в день забора (через временной промежуток более 3 ч), то биологический материал помещается в коммерческую жидкую транспортную систему и держится при комнатной температуре или в условиях холодильника при температуре плюс (4 — 8) °C (предпочтительнее использовать условия холодильника), после транспортировки без подращивания засевается на среды первичного посева;
если биологический материал забирается во второй половине дня и будет транспортироваться на следующий день, то биологический материал в коммерческой жидкой транспортной системе хранится при комнатной температуре или в условиях холодильника при температуре плюс (4 — 8) °C (предпочтительнее использовать условия холодильника), на следующий день транспортируется и засевается на среды первичного посева.

Доставка образцов в жидких транспортных системах осуществляется при температуре плюс (4 — 8) °C. Следует учитывать, что применение транспортной среды (при посеве на следующий день) увеличивает срок выдачи окончательного ответа на одни сутки.

Бактериологическое исследование материала

8.4. Бактериологический метод является «золотым стандартом» лабораторной диагностики дифтерийной инфекции и предусматривает выделение возбудителя путем посева на плотные питательные среды с последующим обязательным определением токсигенности и биохимических свойств.

Порядок проведения бактериологического исследования

8.5. Продолжительность бактериологического исследования на дифтерийную инфекцию составляет 3 — 5 дней.

8.5.1 Первый день (посев биологического материала).

Среды, предназначенные для посева и разлитые в чашки Петри слоем не менее 4 — 6 мм, предварительно асептически подсушивают одним из следующих способов:

перевернутые чашки Петри с открытыми крышками выдерживают в термостате при температуре плюс (37 +/- 1) °C до исчезновения капель влаги с поверхности агара (15 — 20 мин; не пересушивать);
чашки Петри с полуоткрытыми крышками помещают в стерильный ламинарный бокс на 30 мин.

Не используют для посева материала охлажденные чашки с питательной средой, взятой непосредственно из холодильника.

Материал для исследования из ротоглотки, носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред — КТА или Клауберг II, КБА, разлитых в чашки Петри (чашечный метод посева) (рис. 1).

рис. 1

Рис. 1. Посев биологического материала чашечным методом с формированием «площадки»

Посев биологического материала от одного лица производят на одну чашку, используя при этом половину поверхности (1/2) чашки среды для посева материала из ротоглотки, а вторую — для посева материала из носоглотки. При посеве материала с кожи или других пораженных мест добавляют еще одну чашку (все чашки маркируются). Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку. Не используют 1/4 чашки для посева материала на плотной питательной среде.

При посеве материал тщательно втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2 x 1 см2 у края чашки, стараясь оставить весь биологический материал на поверхности формируемой «площадки». Формирование такой «площадки» является обязательным: это позволяет сохранить исследуемый материал, находящийся на тампоне. Дальнейший рассев исследуемого биологического материала осуществляют этим же тампоном, не отрывая тампон от поверхности питательной среды, засевая оставшуюся 1/2 поверхности чашки, что позволяет получить изолированные колонии (чистую культуру) для дальнейшей идентификации непосредственно с чашки первичного посева. Такой метод сохраняет весь биологический материал на поверхности питательной среды и позволяет работать с отдельными изолированными колониями, что сокращает длительность проведения исследования на одни сутки.

Засеянные чашки с плотной питательной средой или пробирки с жидкой транспортной средой, приготовленной в лабораторных условиях, помещают в термостат для инкубации при плюс (37 +/- 1) °C. При использовании коммерческих жидких транспортных систем биологический материал может быть посеян на среды первичного посева в день взятия (при доставке в интервале более 3 ч), а также может храниться при комнатной температуре или в условиях холодильника при плюс (4 — 8) °C (при невозможности посева в день взятия) (п. 8.3).

Высев из жидкой транспортной среды, приготовленной в лабораторных условиях (не отжимая тампон), производят описанным выше способом на следующие сутки, используя дифференциально-диагностическую плотную питательную среду. Высев из коммерческих жидких транспортных систем на дифференциально-диагностическую плотную питательную среду производят в день взятия биологического материала (при условии доставки в интервале более 3 ч) или на следующий день (при взятии во второй половине дня) (п. 8.2.3).

Чашки рекомендуется ставить в стопки не более чем по 2 штуки в высоту, поскольку необходимо оставлять пространство для циркуляции воздушного потока в термостате, чтобы температура питательной среды в чашках Петри в максимально короткие сроки пришла в равновесие с температурой инкубации. Для увлажнения воздуха в термостат помещают сосуд с водой, чтобы минимизировать потерю влажности агаровой среды в течение инкубации и таким образом исключить воздействие неблагоприятного фактора, оказывающего влияние на рост микроорганизмов.

8.5.2 Второй день.

Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 ч после посева материала (если материал засевали во второй половине дня, то просмотр осуществляется ровно через 24 ч, т.е. во второй половине дня) только с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (далее — МБС).

Чашки с колониями, подозрительными на дифтерийные, отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. Оценка культуральных свойств на средах первичного посева производится в соответствии с приложением 4 к настоящим МУК.

Микроскопию препаратов-мазков из подозрительных колоний можно не проводить, т.к. все эти колонии подлежат обязательному изучению в пробе на токсигенность.

Из сомнительных колоний готовят препараты-мазки. В препаратах-мазках как подозрительных, так и сомнительных колоний клетки C. diphtheriae из культуры, выросшей на средах первичного посева с ингибиторами роста (теллурит калия), могут быть укорочены, утолщены, однако присущее им расположение и полиморфизм сохраняются; C. ulcerans могут иметь овоидную форму. Оценка морфологических признаков не позволяет установить видовую принадлежность микроорганизмов, но дает возможность при обнаружении коринеформных микроорганизмов предположительно отнести их к роду Corynebacterium и подвергнуть дальнейшей идентификации. В случае обнаружения других форм микроорганизмов (кокков, дрожжей, споровых палочек) дальнейшее изучение этих колоний прекращается.

В случае роста подозрительных по культуральным свойствам колоний, похожих на колонии коринебактерий, необходимо сразу через 24 ч роста приступить к изучению их токсигенных свойств. Токсигенные свойства изучают не менее чем у 2 изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности, а другой половины колонии — в пробирку со скошенным сывороточным агаром для сохранения и накопления чистой культуры.

При невозможности снять 1/2 колонии в первые 24 ч роста для посева на токсигенность используется материал целой колонии. Если колония маленьких размеров, после формирования бляшек в пробе на токсигенность, не прожигая петли, производится посев на сывороточный агар.

Учитывая, что через 24 ч роста колонии имеют небольшие размеры и материала 1/2 или целой колонии может быть недостаточно для накопления дифтерийного токсина в пробе на токсигенность, а также то, что в исследуемом материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности C. diphtheriae, крайне важно изучить токсигенные свойства, по возможности, у максимального числа выросших колоний (20 и более), смешивая по 5 — 7 однотипных колоний в одну бляшку. При невозможности постановки пробы на токсигенность классическим способом из-за недостаточного количества и малого размера колоний, выросших через 24 ч, изучают, смешивая однотипные по морфологии и размеру колонии в нескольких бляшках. Чашки с пробой на токсигенность помещают в термостат.

Чашки с первичным посевом исследуемого материала вновь помещают в термостат на 24 ч и просматривают их повторно через 48 ч роста первичного материала (на третьи сутки).

8.5.3 Третий день.

Через 18 — 24 ч (учет результатов может быть проведен и через 18 ч) при появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности изучаемую культуру идентифицируют как коринебактерии токсигенные и выдают предварительный ответ о выделении токсигенной культуры. При отсутствии специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности чашки инкубируют еще 24 ч.

Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре, засевают на среды для определения фермента цистиназы (среда Пизу), фермента уреазы, фермента нитратредуктазы, биохимического варианта (ферментация глюкозы, сахарозы, крахмала). Со скошенного сывороточного агара наличие фермента цистиназы на среде Пизу можно идентифицировать уже через 6 ч после посева по появлению облачка по ходу укола в среду.

Чашки с первичным посевом исследуемого материала просматривают с помощью МБС повторно через 36 — 48 ч инкубации в термостате. При наличии подозрительных колоний изучают их токсигенные свойства и выделяют чистую культуру на скошенном сывороточном агаре, если эти процедуры не были выполнены через 24 ч роста первичного материала.

Если вырастает только одна колония через 48 ч роста на чашках первичного посева, ее засевают на среду для определения токсигенности. Для дальнейшей идентификации можно использовать культуру с бляшки через 48 ч роста в пробе на токсигенность или через 24 ч роста в случае выявления токсигенных свойств идентифицируемой культуры.

При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактерии дифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не выявлены.

При отсутствии роста микроорганизмов на «площадках» в чашках первичного посева через 48 ч инкубации в ряде случаев требуется повторное взятие и исследование материала. Отсутствие роста микроорганизмов свидетельствует о нарушениях правил взятия и транспортирования биологического материала (нарушение сроков доставки, техники отбора проб, применение антибактериальных препаратов, полосканий ротоглотки) и требует контроля проведения этого этапа бактериологического исследования. В случае отсутствия роста у всех обследуемых одномоментно (например, исследования в один день, использование питательной среды одной варки) следует обратить внимание на ошибки проведения внутрилабораторного контроля качества сред первичного посева.

Предварительный ответ о выявлении C. diphtheriae может быть выдан при наличии множественного роста однотипных подозрительных колоний на чашках первичного посева, отрицательной пробе на уреазу и положительной пробе Пизу.

8.5.4 Четвертый/Пятый день.

При появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности (через 24 ч инкубации пробы на токсигенность 48-часового роста первичного посева) выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре, засевают на среды для изучения биохимических свойств — продукции фермента цистиназы (среда Пизу) (учет результата можно проводить уже через 6 ч после посева по появлению облачка по ходу укола в среду и окончательно — через 24 ч), сахаролитической активности, нитратредуктазной активности, продукции фермента уреазы, если эта процедура не была сделана ранее.

Повторно (через 48 ч) учитывают результаты пробы на токсигенность, поставленной во второй день исследования. Одновременно производят учет цистиназной, нитратредуктазной, уреазной активности, сахаролитических свойств в пробах, поставленных в третий день исследования.

При отсутствии специфических линий преципитации через 48 ч после постановки пробы на токсигенность, но при положительных результатах проб на цистиназу, глюкозу и нитраты, отрицательных результатах проб на уреазу и сахарозу только на 4 — 5 сутки культуру идентифицируют как C. diphtheriae нетоксигенные с указанием биохимического варианта.

При выделении токсигенных C. diphtheriae на 3 — 4 сутки от начала исследования дополнительно ответ о биохимических свойствах может быть выдан на 4 — 5 сутки (через 72 или 96 ч с момента первичного посева исследуемого материала).

Схема бактериологического исследования

8.6. Схема бактериологического исследования представлена в п.п. 8.6.1 - 8.6.4 и в приложении 3 к настоящим МУК.

8.6.1. Первый день исследования. Посев исследуемого материала на селективную дифференциально-диагностическую или, при необходимости, в жидкую транспортную среду. Инкубирование в термостате при плюс (37 +/- 1) °C.

8.6.2. Второй день исследования (24 ч). Изучение выросших колоний, при возможности постановка пробы на токсигенность и посев культуры на скошенный сывороточный агар. При использовании жидкой транспортной среды проводится пересев на селективную дифференциально-диагностическую среду.

8.6.3. Третий день исследования (48 ч). Учет результатов пробы на токсигенность, поставленной во второй день исследования. Постановка пробы Пизу и первичный учет через 6 ч. В случае наличия специфических линий преципитации и при положительной пробе Пизу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии. Посев чистой культуры, выделенной во второй день исследования, на среду Пизу (учет через 6 ч и окончательный на следующий день), на среды Гисса для изучения сахаролитической активности (глюкоза, сахароза, крахмал), постановка тестов на нитраты и уреазу. Повторный просмотр (через 48 ч) чашек первичного посева с помощью МБС. Постановка проб на токсигенность и отсев колоний на скошенный сывороточный агар. В случае использования жидкой транспортной среды ход исследования см. начиная со второго дня и далее по схеме. Выдача бактериологического ответа об отсутствии коринебактерий дифтерии. При обнаружении у исследуемой культуры фермента цистиназы, отсутствии фермента уреазы можно выдать предварительный ответ о выделении коринебактерий дифтерии.

8.6.4. Четвертый день исследования (72 ч). Учет токсигенных свойств культуры, выделенной в третий день исследования (через 48 ч роста первичного посева). При обнаружении специфических линий преципитации и положительной пробе Пизу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии. Определяют биохимические свойства (цистиназа, глюкоза, сахароза, крахмал, нитраты, мочевина). Учет биохимических свойств культуры (токсигенной или нетоксигенной), выделенной во второй день исследования (через 24 ч инкубации первичного посева). Выдача бактериологического ответа о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта и дополнительного ответа о биохимических свойствах токсигенных коринебактерий дифтерии, выделенных ранее.

8.6.5. Выдача бактериологического ответа о выделении токсигенных или нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта (в случае 48 ч инкубации первичного посева и 48 ч проявления или непроявления специфических линий преципитации в пробе на токсигенность).

Заключение бактериологического исследования

8.7 На основании проведенного исследования формулируются следующие варианты бактериологического заключения:

наличие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные культурально-морфологические и биохимические свойства (ферментация глюкозы и крахмала, отсутствие ферментации сахарозы, редукция нитратов) позволяют заключить, что выделенная культура является C. diphtheriae токсигенные, биохимический вариант gravis. Наличие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные культурально-морфологические и биохимические свойства (ферментация глюкозы, отсутствие ферментации сахарозы и крахмала, редукция нитратов) позволяют заключить, что выделенная культура является C. diphtheriae токсигенные, биохимический вариант mitis/intermedius. Наличие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные культурально-морфологические и биохимические свойства (ферментация глюкозы, отсутствие ферментации сахарозы и крахмала, отсутствие редукции нитратов) позволяют заключить, что выделенная культура является C. diphtheriae токсигенные, биохимический вариант belfanti/subsp. lausannense. К настоящему времени не описаны токсигенные варианты subsp. lausannense;
отсутствие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные культурально-морфологические и биохимические свойства (ферментация глюкозы и крахмала, отсутствие ферментации сахарозы, редукция нитратов) позволяют заключить, что выделенная культура является C. diphtheriae нетоксигенные, биохимический вариант gravis. Отсутствие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные культурально-морфологические и биохимические свойства (ферментация глюкозы, отсутствие ферментации сахарозы и крахмала, редукция нитратов) позволяют заключить, что выделенная культура является C. diphtheriae нетоксигенные, биохимический вариант mitis/intermedius. Отсутствие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные культурально-морфологические и биохимические свойства (ферментация глюкозы, отсутствие ферментации сахарозы и крахмала, отсутствие редукции нитратов) позволяют заключить, что выделенная культура является C. diphtheriae нетоксигенные, биохимический вариант belfanti/subsp. lausannense;
при выделении других коринебактерий бактериологический ответ считают отрицательным и выдается ответ: «Коринебактерии дифтерии не обнаружены»;
при наличии линий преципитации (иногда размытых), идентичных специфическим линиям контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae № 665, положительных проб на уреазу, цистиназу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствии ферментации сахарозы, отсутствии редукции нитратов культуру относят к виду C. ulcerans токсигенные;
при отсутствии линий преципитации при определении токсигенных свойств и наличии всех других признаков, характерных для C. ulcerans, бактериологический ответ считают отрицательным;
C. pseudotuberculosis идентифицируется по положительной реакции в пробе на уреазу. Тест восстановления нитратов в нитриты у этих микроорганизмов является вариабельным признаком, поэтому дифференциацию от C. ulcerans проводят по крахмалу (C. pseudotuberculosis не способны разлагать крахмал — отрицательный результат). Необязательный тест для практических бактериологов: для дифференциальной диагностики C. ulcerans и C. pseudotuberculosis вводят дополнительную пробу ферментации трегалозы, гидролиз желатина и обратный CAMP-тест. При наличии линий преципитации и характерных свойствах культуру относят к C. pseudotuberculosis токсигенные;
при отсутствии линий преципитации при определении токсигенных свойств и наличии всех других признаков, характерных для C. pseudotuberculosis, бактериологический ответ считают отрицательным.

8.7.1. При обследовании с диагностической целью и по эпидемиологическим показаниям может быть выдан предварительный ответ о выявлении C. diphtheriae при наличии множественного роста однотипных подозрительных колоний на чашках первичного посева после 24 или 48 ч инкубации, выявлении наличия фермента цистиназы и отсутствии фермента уреазы путем внесения в пробирки большого количества колоний. Предварительный ответ может быть изменен после окончания бактериологического исследования.

8.7.2. При отсутствии роста микроорганизмов на «площадках» в чашках первичного посева через 48 ч инкубации выдается ответ: «Роста микрофлоры не обнаружено, анализ рекомендуется повторить».

8.7.3. При выделении C. ulcerans и C. pseudotuberculosis необходимо подтверждение подобной идентификации в Референс-центре, чтобы исключить ошибки при возможном выделении C. diphtheriae.

При нативной микроскопии (по просьбе инфекционистов) требуется дополнительный материал на дополнительных тампонах из ротоглотки и носоглотки. Однако чаще всего микроорганизмы в виде «палочек» не обнаруживают, что делает этот способ неинформативным.

Методики идентификации возбудителя дифтерийной инфекции

8.8. Идентификацию возбудителя дифтерийной инфекции проводят путем оценки его токсигенных и биохимических свойств.

Определение токсигенных свойств коринебактерий с помощью реакции преципитации в агаре

8.9. В основе метода определения токсигенности C. diphtheriae (модифицированный тест Элека с бумажными полосками и тест Фельдмана с соавт. с бумажными дисками) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде (агаре). В местах оптимального количественного соотношения между токсином (антигеном), продуцируемым коринебактериями, и антитоксином (антителом), нанесенным на фильтровальную бумагу (в виде полосок или дисков), происходит их взаимодействие с образованием иммунного комплекса, который выпадает в виде преципитата (в виде белой линии) («усы» преципитации).

Токсигенность коринебактерий определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии со среды первичного посева или культура со скошенного агара). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии в этом случае преципитатов в агаровом слое опыт следует повторить с выделенными на скошенной 10%-й сывороточной среде.

Для постановки пробы на токсигенность необходимо иметь нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота (далее — СККРС), или сыворотку новорожденных телят (телячью, англ. newborn calf serum), или бычью сыворотку (adult bovine serum) без консервантов. Не используется лошадиная сыворотка крови для внесения в питательную среду в пробе на токсигенность. Бактериологические лаборатории, проводящие исследования биологического материала на дифтерию, должны иметь неснижаемый запас антитоксина для определения токсигенности выделенных дифтерийных штаммов. Для постановки пробы на токсигенность необходимо использовать контрольный токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665 (24-часового роста на сывороточном или кровяном агаре).

8.9.1. Методика определения токсигенных свойств коринебактерий с использованием коммерческих бумажных дисков, пропитанных дифтерийным антитоксином в производственных условиях (по Фельдману с соавт.).

Приготовление чашек для постановки пробы на токсигенность. Питательный агар для определения токсигенности целесообразно разливать в пробирки по 12 мл (количество, необходимое для приготовления одной чашки диаметром до 90 мм (пластик) и 100 мм (стекло)). При большом объеме работы питательный агар разливают во флаконы по 80 мл (на 5 чашек пробы на токсигенность). Питательный агар следует расплавлять только 1 раз; многократное плавление ухудшает свойства среды. Питательный агар расплавляют в водяной бане при плюс (90 +/- 1) °C, тотчас же вынимают из бани, охлаждают до плюс (50 +/- 1) °C (температуру питательной среды рекомендуется проверить инфракрасным пирометром) и добавляют 20% СККРС или телячьей сыворотки (к 12 мл питательного агара добавляют 3 мл СККРС, или бычьей сыворотки, или сыворотки новорожденных телят без консервантов), перемешивают (не допуская образования пузырей) и выливают, соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри, распределяют среду по дну осторожным вращением чашки, не допуская «вспенивания» — появления неровностей и пузырей на поверхности среды. Лучший результат пробы на токсигенность получается при использовании бычьей сыворотки или сыворотки новорожденных телят. Сыворотка перед добавлением в питательную среду должна быть комнатной температуры (если добавить холодную сыворотку в питательную среду, могут образовываться комочки).

Далее оставляют на столе с приоткрытой крышкой до полного застывания среды. Потом чашку подсушивают в термостате при плюс (37 +/- 1) °C в течение 15 — 20 мин, при открытой крышке, повернув ее вверх дном, до нанесения бумажных дисков с антитоксином на поверхность среды. Чашки с питательной средой недопустимо пересушивать.

В редких случаях, когда на чашках первичного посева вырастают единичные колонии (не более 8), токсигенные свойства которых подлежат изучению, возможно использование одноразовых чашек Петри диаметром 4,5 см. Количество питательного агара и СККРС уменьшается в 2 раза (8 мл питательного агара плюс 2 мл СККРС, или бычьей сыворотки, или сыворотки новорожденных телят без консервантов и разливается на 2 чашки). Данный размер чашки используется только с дисками, пропитанными антитоксином. Готовые чашки со средой можно использовать в течение 2 суток при температуре плюс (2 — 8) °C.

Постановка пробы на токсигенность. На поверхность чашки Петри (диаметром 100 мм) со средой для определения токсигенности коринебактерий помещают 4 коммерческих бумажных диска с дифтерийным антитоксином, на поверхность чашки Петри (диаметром 90 мм) — 3 коммерческих бумажных диска с дифтерийным антитоксином. Помещение дисков с антитоксином на поверхность агара производят с помощью обожженного (стерильного) пинцета. Вокруг каждого диска с антитоксином формируют 5 бляшек: 2 бляшки контрольного штамма и 3 испытуемые (из одного посева с подозрительными колониями формируют минимум 2 бляшки из изолированных колоний и 1 из смеси 3 — 6 однотипных колоний; материалом из этого же посева можно занять места вокруг других дисков с антитоксином). Все 5 бляшек располагают симметрично вокруг диска на расстоянии 0,6 см от его края. Диаметр каждой бляшки 0,5 см. На одной чашке Петри (диаметром 100 мм) можно разместить до 4 дисков с антитоксином и, соответственно, до 20 бляшек с культурами (8 бляшек контрольных и 12 бляшек испытуемых), на одной чашке Петри (диаметром 90 мм) можно разместить 3 диска с антитоксином и, соответственно, до 15 бляшек с культурами (6 бляшек контрольных и 9 бляшек испытуемых). Бумажные диски расставляют на поверхности среды для определения токсигенности на максимально удаленном расстоянии между дисками, чтобы не произошло перекрестных реакций (рис. 2). На чашке указывается время и дата постановки пробы на токсигенность.

Чашки с посевами помещают в термостат при плюс (37 +/- 1) °C.

рис. 2

Рис. 2. Схема пробы на токсигенность с использованием коммерческих бумажных дисков с дифтерийным антитоксином (по Фельдману с соавт.)

Примечание: рис. 3 - бумажный диск с дифтерийным антитоксином; рис. 4 - контрольный токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665; № 1, № 2, № 3, № 4, № 5, № 6 — испытуемые культуры.

Учет результатов. Результат реакции учитывают через 18 — 24 ч, а также через 48 ч. Просмотр чашек и учет результатов пробы на токсигенность рекомендуется производить в проходящем свете с использованием настольного источника света (настольная лампа). Наличие линий преципитации между диском с антитоксином и испытуемой культурой свидетельствует о ее токсигенности. Исследуемая культура считается токсигенной, если линия преципитации данной культуры сливается под углом с линией преципитации контрольного штамма (рис. 3).

рис. 5

Рис. 3. Учет результатов постановки пробы на токсигенность через 24 ч (А) и через 48 ч (Б).

Примечание: А — бумажный диск с дифтерийным антитоксином; К — контрольный токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665; 1, 2, 3 — испытуемые культуры.

Отсутствие линий преципитации у испытуемых культур через 48 ч при наличии их у контрольного штамма указывает на отсутствие токсигенности у изучаемых культур. Линии преципитации у контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 должны появляться через 18 — 24 ч.

При отсутствии линий преципитации у контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 результат пробы на токсигенность учитывать нельзя. В данном случае требуется перестановка пробы на токсигенность и выяснение причин неудовлетворительного результата постановки, который может быть связан с: плохим качеством питательной среды; плохим качеством сыворотки или наличием в ней консервантов; сниженными ростовыми свойствами контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 (что требует улучшения его фенотипических свойств при выращивании на 10%-м кровяном агаре или его замены); нарушением техники постановки пробы.

8.9.2. Методика определения токсигенных свойств коринебактерий с использованием бумажных полосок, приготовленных в лабораторных условиях (по модифицированному тесту Элека).

Приготовление бумажных полосок с дифтерийным антитоксином. Для приготовления полосок в лабораторных условиях необходимо использовать фильтровальную бумагу марок ФБ, или ФОМ III, или ФОБ III. Полоски фильтровальной бумаги нарезают размером 0,7 см x 8,0 см, заворачивают по 2 — 4 штуки в пакетик и стерилизуют в автоклаве при плюс (120 +/- 1) °C в течение 30 мин. Пакетики с бумажными полосками хранят в герметично укупоренной таре не более 6 месяцев. Важным является сохранение ровных краев полоски и отсутствие грифельной черты от рисования их на фильтровальной бумаге. Перед постановкой пробы на токсигенность содержимое ампулы с антитоксином растворяют в 1 мл стерильной дистиллированной воды, переносят в стерильную пробирку и указывают на ней данные этикетки (растворенный антитоксин хранят при температуре плюс (4 — 6) °C не более 10 дней). Фильтровальные бумажки обожженным пинцетом помещают в стерильную чашку Петри, где на каждую полоску наносят 0,125 мл антитоксина, содержащего 500 МЕ в 1 мл.

Чашки для постановки пробы на токсигенность этим методом готовят так же, как при работе с бумажными дисками. Чашки диаметром 4,5 см не используют. В центр чашки на поверхность агара обожженным (стерильным) пинцетом помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксином. Чашку с бумажной полоской с антитоксином подсушивают в термостате при плюс (37 +/- 1) °C в течение 15 — 20 мин при открытой крышке, повернув ее вверх дном.

Готовые чашки со средой можно использовать в течение 2 суток при температуре плюс (2 — 8) °C.

Постановка пробы на токсигенность с бумажными полосками с дифтерийным антитоксином. Культуру засевают в виде бляшек диаметром 0,5 см на расстоянии 0,6 — 0,7 см друг от друга и 0,6 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 бляшек (по 5 бляшек с каждой стороны полоски). Из них 6 бляшек испытуемой культуры, 4 контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 бляшек с контрольным токсигенным штаммом C. diphtheriae биовара gravis № 665 и 4 — испытуемых. Материал от одного анализа засевают параллельными бляшками по обе стороны полоски с антитоксином друг напротив друга (рис. 4). На чашке указывается время и дата постановки пробы на токсигенность.

Чашки с посевом помещают в термостат при плюс (37 +/- 1) °C.

рис. 6

Рис. 4. Схема пробы на токсигенность по модифицированному тесту Элека с бумажными полосками

Примечание: «К+» — контрольный токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665; № 1, № 2, № 3 — испытуемые культуры.

Учет результатов. Результат учитывают через 18 — 24 ч и 48 ч от начала постановки пробы на токсигенность (рис. 5).

рис. 7

Рис. 5. Учет результатов постановки пробы на токсигенность по модифицированному тесту Элека с бумажными полосками с дифтерийным антитоксином через 48 ч

Примечание: «К+» — контрольный токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665; № 1, № 2, № 3 — испытуемые культуры.

Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665. Чаще всего это может произойти через 48 ч, через 24 ч намечается только тенденция к слиянию.

Если через 18 — 24 ч с момента постановки пробы на токсигенность у контрольного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 линии преципитации не обнаруживаются, результат пробы на токсигенность учитывать нельзя. В данном случае требуется перестановка пробы на токсигенность и выяснение причин неудовлетворительного результата постановки, который может быть связан с: плохим качеством питательной среды; плохим качеством сыворотки или наличием в ней консервантов; сниженными ростовыми свойствами контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 (что требует улучшения его фенотипических свойств при выращивании на 10%-м кровяном агаре или его замены); нарушением техники постановки пробы.

8.9.3. Оценка результатов реакции пробы на токсигенность при использовании бумажных дисков или полосок с дифтерийным антитоксином:

испытуемые культуры являются токсигенными, если образовавшиеся линии преципитации сливаются или имеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическими линиями контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665;
испытуемые культуры являются нетоксигенными, если не образуются линии преципитации с антитоксином при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма.

Результаты окончательно учитывать через 48 ч от начала постановки пробы на токсигенность. Учет результатов более чем через 48 ч после постановки не допускается. При использовании очищенного ферментолизом и специфической сорбцией антитоксина неспецифические линии преципитации в пробе на токсигенность не образуются.

8.9.4. Определение токсигенных свойств коринебактерий в реакции преципитации в агаре (модифицированном тесте Элека) с использованием бумажных полосок, пропитанных противодифтерийной антитоксической лечебной лошадиной сывороткой.

Использование противодифтерийной антитоксической лечебной лошадиной сыворотки для постановки пробы на токсигенность допускается только в исключительных случаях (при отсутствии антитоксина).

Разведение антитоксической противодифтерийной сыворотки. Соблюдая правила асептики, антитоксическую сыворотку переносят из ампулы в стерильную пробирку. На пробирке указывают данные этикетки и срок хранения. Хранят сыворотку при температуре плюс (4 — 8) °C. Сыворотка должна быть разведена стерильным физиологическим раствором до содержания 500 МЕ в 1 мл. Коммерческий препарат может иметь разную активность (5000 МЕ, 10 000 МЕ, 20 000 МЕ) и различный объем. Например, в ампуле содержится 10 000 МЕ (в объеме 4,8 мл, как указано на этикетке коробки с ампулами) антитоксической сыворотки. Для упрощения расчетов общий объем сыворотки можно принять за 5 мл. Следовательно, в 1 мл сыворотки содержится 2000 МЕ (10 000 МЕ : 5 = 2000 МЕ). Чтобы получить 500 МЕ в 1 мл, следует 1 мл сыворотки развести в 4 раза, т.е. к 1 мл сыворотки добавить 3 мл стерильного физиологического раствора. При необходимости можно развести сыворотку в меньших объемах: к 0,1 мл сыворотки добавить 0,3 мл физиологического раствора, или к 0,2 мл сыворотки добавить 0,6 мл физиологического раствора, или к 0,3 мл сыворотки добавить 0,9 мл физиологического раствора и т.д. Разведение сыворотки можно выполнить другим способом. Если, например, в ампуле содержится 5000 МЕ сыворотки в объеме 2,5 мл, то 500 МЕ содержится в 0,25 мл сыворотки. К этому объему добавляют 0,75 мл стерильного физиологического раствора и получают разведение сыворотки 500 МЕ в 1 мл. Разведенную сыворотку можно хранить не более 7 дней при температуре плюс (4 — 8) °C.

Приготовление чашек для постановки пробы на токсигенность, бумажных полосок и нанесение их на чашки с питательной средой, постановку пробы на токсигенность проводят так же, как и при использовании полосок фильтровальной бумаги, пропитанных коммерческим антитоксином.

Учет результатов. Результат учитывают через 18 — 24 ч и 48 ч роста. Следует иметь в виду, что препарат антитоксической противодифтерийной сыворотки, помимо антител к дифтерийному антитоксину, содержит антитела к антигенам микробной клетки. Поэтому при постановке пробы на токсигенность с использованием данного препарата преципитаты могут образовываться не только в результате связывания токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител с компонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифические преципитаты). Последние могут формироваться как у токсигенных, в т.ч. и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии (рис. 6).

рис. 8

Рис. 6. Схема учета линий преципитации в пробе на токсигенность по модифицированному тесту Элека с бумажными полосками, пропитанными противодифтерийной антитоксической лечебной лошадиной сывороткой.

Примечание: К — контрольный токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665; И — испытуемые культуры; 1 — специфические линии преципитации; 2 — неспецифические линии преципитации.

Иногда отмечается появление множественных линий преципитации. Неспецифические преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48 — 72 ч, в редких случаях могут появляться и на первые сутки. Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665. В тех случаях, когда у контрольного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 формируется несколько линий преципитации, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенность осуществляют через 18 — 24 ч от момента ее постановки. Если в течение данного времени у контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции и такой результат учету не подлежит.

Варианты оценки результатов реакции:

испытуемые культуры коринебактерий являются токсигенными, если образуемые ими линии преципитации сливаются или имеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическими линиями контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665;
испытуемые культуры коринебактерий являются нетоксигенными, если линии преципитации, образуемые испытуемой культурой, отсутствуют при наличии специфических линий преципитации у контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665; не могут слиться со специфическими линиями преципитации контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665, а скрещиваются или имеют тенденцию к скрещиванию с ними (неидентичные, неспецифические линии); линии преципитации испытуемой культуры сливаются с неспецифическими линиями контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665; линии преципитации испытуемой культуры перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665.

8.9.5 Токсигенность может быть не выявлена при:

недостаточной концентрации дифтерийного антитоксина, нанесенного на полоску;
использовании противодифтерийной антитоксической лечебной лошадиной сыворотки или сыворотки с консервантами при приготовлении питательной среды для определения токсигенности;
использовании лошадиной сыворотки для внесения в среду на токсигенность;
любых нарушениях техники постановки пробы на токсигенность (нарушение сроков и условий хранения питательных сред, сывороток, дифтерийного антитоксина; приготовление чашек, приготовление полосок, техника нанесения бляшек);
использовании контрольного штамма со сниженными ростовыми свойствами.

Методики определения биохимических свойств

8.10. Идентификацию возбудителя проводят путем постановки биохимических тестов.

8.10.1 Определение цистиназной активности.

C. diphtheriae, C. ulcerans и C. pseudotuberculosis, в отличие от других коринеформных бактерий, обладают ферментом цистиназой. Определение цистиназной активности проводят на среде Пизу, в составе которой имеется цистин и уксусно-кислый свинец. В процессе роста культуры C. diphtheriae, C. ulcerans и C. pseudotuberculosis продуцируют цистиназу, расщепляющую цистин, а образующийся при этом сероводород вступает в реакцию с уксусно-кислым свинцом, который превращается в серно-кислый свинец — соединение темно-коричневого цвета.

C. diphtheriae, C. ulcerans и C. pseudotuberculosis вызывают не только почернение среды по ходу укола, но и образуют вокруг него облачко темно-коричневого цвета.

Цистиназную активность бактерий рода Corynebacterium определяют на среде Пизу одним из следующих способов:

с помощью использования коммерческой среды Пизу, предназначенной для определения цистиназной активности, зарегистрированной и разрешенной для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <13>. Исследование по определению цистиназной активности бактерий рода Corynebacterium с использованием коммерческой среды осуществляется в соответствии с инструкцией производителя;

<13> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий» (далее — постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416).

с помощью среды Пизу, приготовленной в лабораторных условиях на основе АГВ агара.

Для определения цистиназной активности исследуемую культуру засевают многоразовой бактериологической петлей (из нихромовой проволоки) с диаметром ушка 1 — 2 мм (рекомендуется использовать длинную бактериологическую петлю) методом укола в среду Пизу, разлитую в пробирки столбиком высотой 2 — 4 см. Посев производят в толщину агарового столбика строго по центру, чуть не доходя до дна пробирки. После посева пробирки помещают в термостат. Образование облачка по ходу укола может визуализироваться уже через 6 ч после постановки. Окончательно результат реакции учитывают через 24 ч инкубации при температуре плюс (37 +/- 1) °C.

Учет результатов. Вследствие образования уксусно-кислого свинца происходит почернение и окрашивание в коричневый цвет среды в зоне роста культуры по ходу укола с образованием облачка темно-коричневого цвета (рис. 7). В данном случае проба Пизу считается положительной.

рис. 9

Рис. 7. Учет цистиназной активности на среде Пизу через 6 ч (А) и через 24 ч (Б)

Контроль качества. В качестве контролей используют:

отрицательный контрольный образец (контроль реактива) — инкубируют пробирку со стерильной средой без посева;
положительный контрольный образец — в отдельную пробирку засевают контрольный токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665.

8.10.2 Определение уреазной активности.

C. ulcerans, C. pseudotuberculosis и некоторые другие микроорганизмы рода Corynebacterium обладают способностью продуцировать в процессе роста фермент уреазу и расщеплять мочевину. C. diphtheriae не продуцируют фермент уреазу и, следовательно, не обладают уреазной активностью.

Уреазную активность бактерий рода Corynebacterium определяют одним из следующих способов:

по методу Заксе. Ex tempore смешивают 1 часть реактива A и 19 частей реактива B. Полученную смесь разливают по 0,1 — 0,2 мл в стерильные пробирки и вносят 1 петлю испытуемой культуры, предварительно выращенной на скошенном 10%-м сывороточном агаре. Затем пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре плюс (37 +/- 1) °C в течение 30 мин, после чего производят учет результатов. При отсутствии изменения цвета смеси пробирки обратно помещают в термостат и результат учитывают на следующий день;
путем посева на питательный бульон с мочевиной. Испытуемую культуру засевают в бульон с мочевиной, разлитый в стерильные пробирки по 2 — 3 мл, и помещают их в термостат при температуре плюс (37 +/- 1) °C; результат учитывают через 24 ч инкубации;
использованием коммерческих наборов реагентов для определения уреазной активности, зарегистрированных и разрешенных для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <14>. Исследование по определению уреазной активности с использованием коммерческих наборов реагентов осуществляется в соответствии с инструкцией производителя.

<14> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

Учет результатов. Фермент уреаза расщепляет мочевину до диоксида углерода и аммиака, вследствие чего происходит сдвиг pH среды в щелочную сторону и изменение цвета индикатора. Визуально это проявляется в изменении цвета среды в малиновый. При отсутствии у испытуемой культуры этого фермента окрашивания среды не происходит.

Контроль качества. В качестве контроля используют:

отрицательный контрольный образец (контроль реактива) — инкубируют пробирку со стерильной средой без посева;
отрицательный контрольный образец — в отдельную пробирку засевают контрольный токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665;
положительный контрольный образец — в отдельную пробирку засевают контрольный токсигенный штамм C. ulcerans № 7819 или контрольный штамм C. pseudodiphtheriticum «Соколов».

8.10.3 Определение нитратредуктазной активности.

C. diphtheriae биоваров gravis, mitis и intermedius способны восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) до солей азотистой кислоты (нитриты). C. diphtheriae биовара belfanti и subsp. lausannense и C. ulcerans не способны восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) до солей азотистой кислоты (нитриты). У C. pseudotuberculosis данный признак может быть вариабельным и положителен у 21% — 89% штаммов.

Нитратредуктазную активность бактерий рода Corynebacterium определяют одним из следующих способов:

посев в пробирку с нитратным бульоном. Исследуемую культуру засевают в нитратный бульон, разлитый в стерильные пробирки по 2 — 3 мл, помещают в термостат и инкубируют при температуре плюс (37 +/- 1) °C в течение 24 ч; затем добавляют 2 — 3 капли реактива на нитриты (реактив Грисса или реактив Касаткина) и учитывают результат;
с помощью коммерческих питательных сред/тестов/наборов реагентов для определения нитратредуктазной активности, зарегистрированных и разрешенных для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <15>. Исследование по определению нитратредуктазной активности с использованием коммерческих питательных сред/тестов/наборов реагентов осуществляется в соответствии с инструкцией производителя.

<15> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

Учет результатов. Если при восстановлении нитрата до нитрита, катализируемом ферментом нитратредуктазой, после добавления реактива Грисса/Касаткина происходит окрашивание среды в красный цвет, то реакция считается положительной.

Если после добавления реактива Грисса/Касаткина изменения окраски среды не происходит в течение 2 мин, то реакция считается отрицательной.

Контроль качества. В качестве контроля используют:

отрицательный контрольный образец (контроль реактива) — инкубируют пробирку со стерильной средой без посева;
положительный контрольный образец — в отдельную пробирку засевают контрольный токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665.

8.10.4 Определение сахаролитической активности.

C. diphtheriae, C. ulcerans и C. pseudotuberculosis обладают в разной степени сахаролитической активностью.

Сахаролитическую активность выделенных культур коринебактерий оценивают одним из следующих способов:

с использованием лабораторно приготовленных жидких сред Гисса с углеводами — глюкозой, сахарозой, растворимым крахмалом с добавлением индикатора Андреде. Испытуемую культуру засевают бактериологической петлей в среды Гисса, затем помещают в термостат и инкубируют при температуре плюс (37 +/- 1) °C в течение 24 ч;
с использованием коммерческих наборов реагентов (индикатора Андреде), зарегистрированных и разрешенных для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <16>. Исследование по определению сахаролитической активности бактерий рода Corynebacterium с помощью коммерческих наборов реагентов осуществляется в соответствии с инструкцией производителя.

<16> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

Учет результатов. Результат учитывают через 24 ч. При сбраживании того или иного углевода образуется кислота, что способствует сдвигу pH среды, в результате чего цвет индикатора меняется и среда приобретает ярко-малиновую окраску. При культивировании микроорганизмов, не сбраживающих тот или иной сахар, цвет среды не меняется.

Контроль качества — ферментация глюкозы:

отрицательный контрольный образец (контроль реактива) — инкубируют пробирку со стерильной средой без посева;
положительный контрольный образец — в отдельную пробирку засевают контрольный токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665.

Контроль качества — ферментация сахарозы:

отрицательный контрольный образец (контроль реактива) — инкубируют пробирку со стерильной средой без посева;
положительный контрольный образец — в отдельную пробирку засевают штамм Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC 25923.

Контроль качества — ферментация крахмала:

первый отрицательный контрольный образец (контроль реактива) — инкубируют пробирку со стерильной средой без посева;
второй отрицательный контрольный образец — в отдельную пробирку засевают контрольный токсигенный штамм C. diphtheriae биовара mitis № 6765;
положительный контрольный образец — в отдельную пробирку засевают контрольный токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665.

8.10.5. Обратный CAMP-тест (дополнительный тест для идентификации C. pseudotuberculosis).

CAMP-тест является тестом для ориентировочной идентификации стрептококков серогруппы B, синтезирующих способный к диффузии внеклеточный белок («CAMP фактор»), усиливающий гемолиз при взаимодействии с бета-токсином S. aureus. Для постановки теста засевают культуру S. aureus, продуцирующую бета-гемолизин, одним штрихом в центре чашки. Испытуемую культуру высевают отдельными штрихами, параллельными друг другу и перпендикулярными линии посева стафилококка на расстоянии 2 — 4 мм от нее. Через 18 — 24 ч культивирования при плюс (37 +/- 1) °C наблюдается образование клиновидной (ангулярной) зоны нарастающего гемолиза эритроцитов между посевами стрептококка и стафилококка.

C. pseudotuberculosis дает положительный результат в обратном CAMP-тесте. Этот микроорганизм продуцирует фосфолипазу, которая ингибирует гемолитический эффект бета-гемолиза у золотистого стафилококка (рис. 8). На 10%-й кровяной агар (на основе Колумбийского агара) или среду для CAMP-теста засевают одним штрихом в центре чашки в виде полосы S. aureus, продуцирующего бета-гемолизин. Перпендикулярно к этому штамму отдельными параллельными штрихами засевают изучаемые культуры на расстоянии 2 — 4 мм от него (линии посева не должны соприкасаться); инкубируют засеянные чашки Петри при температуре плюс (37 +/- 1) °C в течение 24 ч.

рис. 10

Рис. 8. Учет обратного CAMP-теста (А) и CAMP-теста (Б) <17>

<17> www.microbiologynotes.com/reverse-camp-test - обратный CAMP-тест для идентификации Clostridium perfringens (в свободном доступе).

Учет результатов. Результат учитывают через 24 ч. Положительный результат CAMP-теста — наличие клиновидной (ангулярной) зоны нарастающего гемолиза эритроцитов у бета-гемолитического стрептококка. Положительный результат обратного CAMP-теста — торможение гемолитического эффекта бета-гемолиза у золотистого стафилококка.

Контроль качества. В качестве контроля используют:

отрицательный контрольный образец — Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) ATCC 19615;
положительный контрольный образец для CAMP-теста — Streptococcus agalactiae (S. agalactiae) ATCC 13813;
контрольный образец для CAMP-теста — S. aureus ATCC 25923 или S. aureus ATCC 6538-P.

Питательные среды и реактивы, используемые в бактериологической диагностике дифтерийной инфекции

8.11. Качество питательных сред имеет важнейшее значение при любом бактериологическом исследовании. Чтобы добиться максимальной высеваемости C. diphtheriae из исследуемого материала и роста колоний, видимых невооруженным глазом через 24 ч, необходимо создать оптимальные условия для роста, размножения этих бактерий, сохранения их биологических и культурально-морфологических свойств, а также для ингибирования роста сопутствующей микрофлоры. Это достигается путем использования питательных основ и теллурита калия. Теллурит калия в определенной концентрации не препятствует росту представителей рода коринебактерий и способен ингибировать рост посторонней микрофлоры. Колонии коринебактерий на средах первичного посева имеют серо-черную окраску, т.к. данные микроорганизмы способны восстанавливать теллурит калия до металлического теллура (вещества черного цвета) и накапливать его внутри клеток.

8.12. Основными средами для первичного посева материала на дифтерийную инфекцию являются кровяные теллуритовые среды — КТА, Клауберг II. В качестве основы для этих сред используют питательные агары на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар, питательная среда № 1 ГРМ, среда АГВ), СПА, агар Хойла, основа Кровяного агара, Колумбийский агар. Для приготовления кровяных теллуритовых сред используют дефибринированную кровь крупного рогатого скота или баранью кровь. Допускается использование замороженной крови (при длительном хранении крови). Для выделения коринебактерий дифтерии также используется питательная среда КБА, в составе которой содержится в качестве заменителя крови СРГМ, который получают путем ферментативного гидролиза суспензии черного альбумина с последующей сушкой методом распыления.

8.13. Для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии выпускаются коммерческие сухие среды — среда для определения токсигенности (далее — ОТДМ) и Коринетоксагар. Коммерческие среды готовят по прописи на этикетке, добавляя в них ex tempore нужные ингредиенты.

8.14. Для отсева колоний и культивирования коринебактерий готовят 10%-ю сывороточную агаровую среду, можно использовать 5 — 10%-й кровяной агар. В качестве основы для сывороточного или кровяного агаров можно использовать — ГРМ-агар, питательную среду № 1 ГРМ, СПА, среду АГВ, основу Кровяного агара или Колумбийский агар.

8.15. В лабораторных условиях готовят жидкую транспортную среду для сохранения и накопления коринебактерий дифтерии, которую используют при транспортировании исследуемого материала. В качестве основы для приготовления можно использовать ГРМ-бульон или сердечно-мозговой бульон. Допускается использование жидких транспортных систем на основе среды Эймса.

8.16. Каждая новая серия питательной среды (как коммерческой, так и приготовленной в лабораторных условиях) подлежит входящему и периодическому внутрилабораторному контролю качества (п.п. 8.27 - 8.34).

8.17. Для посева биологического материала применяют питательные среды, зарегистрированные и разрешенные для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <18>, приготовление которых осуществляется согласно инструкции производителя.

<18> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

Жидкая транспортная лабораторно приготовленная среда

8.18. В качестве основы для приготовления жидкой транспортной среды используют 0,1%-й агар на сухом питательном ГРМ-бульоне или 0,1%-й агар на сердечно-мозговом бульоне (pH 7,6).

Приготовление транспортной среды. Питательный бульон разливают в пробирки по 4 мл, стерилизуют в автоклаве при 1 атм. в течение 20 мин. Срок хранения — не более 14 дней при плюс (2 — 8) °C. Перед употреблением в каждую пробирку, с соблюдением правил асептики, добавляют 1,0 мл СККРС, или бычьей сыворотки, или сыворотки новорожденных телят (без консервантов) и 0,05 мл (1 капля) коммерческого 2%-го раствора теллурита калия. Среду выборочно (3 — 5 пробирок) контролируют на стерильность, выдерживая при плюс (37 +/- 1) °C в течение 48 ч.

Готовую жидкую транспортную лабораторно приготовленную среду можно использовать в течение 7 дней при условии ее хранения при температуре плюс (2 — 8) °C.

Готовую среду (ГРМ-бульон) можно использовать в течение 1 месяца при условии хранения ее при температуре плюс (2 — 8) °C.

Среды для первичного посева клинического материала

8.19. Для первичного посева используются питательные среды, представленные в п.п. 8.19.1 - 8.19.3.

8.19.1 Кровяной теллуритовый агар.

Для приготовления КТА в качестве питательной агаровой основы можно использовать ГРМ-агар, или питательную среду № 1 ГРМ, или СПА, или среду АГВ, или агар Хойла, или основу Кровяного агара, или Колумбийский агар, зарегистрированные и разрешенные для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <19>, приготовление которых осуществляется согласно инструкции производителя.

<19> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

Приготовление КТА. К 100 мл стерильной питательной агаровой основы (pH 7,6), расплавленной и охлажденной до плюс (45 — 50) °C, добавляют 7 мл дефибринированной или 10 мл гемолизированной крови и 2 мл 2%-го раствора теллурита калия. В качестве крови необходимо использовать ККРС или баранью кровь без консервантов.

Готовую среду КТА разливают по чашкам Петри слоем 4 — 5 мм.

Готовую среду КТА можно использовать в течение 7 дней при условии ее хранения при температуре плюс (2 — 8) °C.

8.19.2 Среда Клауберга II.

Для приготовления Среды Клауберга II в качестве питательной агаровой основы можно использовать ГРМ-агар, или питательную среду № 1 ГРМ, или СПА, или среду АГВ, или основу Кровяного агара, или Колумбийский агар, зарегистрированные и разрешенные для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <20>, приготовление которых осуществляется согласно инструкции производителя.

<20> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

Приготовление среды Клауберга II. К 100 мл стерильной питательной агаровой основы (pH 7,6), расплавленной и охлажденной до плюс (45 — 50) °C, добавляют 10 мл глицериновой смеси, 50 мл «лаковой» крови и 3 мл коммерческого 2%-го раствора теллурита калия. Принимая во внимание, что питательная среда разводится глицериновой смесью и «лаковой» кровью в 1,6 раза, при приготовлении данной среды следует увеличить навеску сухого питательного агара в 1,6 раза.

Пример расчета. На этикетке флакона с сухим коммерческим питательным агаром указана навеска, необходимая для приготовления 1 л среды, например, 30 г. Для приготовления 1 л питательной основы для среды Клауберга II следует взять навеску 48 г (т.е. 30 г x 1,6 = 48 г).

Для приготовления глицериновой смеси к 40 мл дефибринированной крови добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина (глицерин стерилизуют при температуре плюс (110 +/- 1) °C в течение 30 мин).

Для приготовления «лаковой» крови к 34 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови.

Готовую среду Клауберга II разливают по чашкам Петри слоем 4 — 5 мм.

Готовую среду Клауберга II можно использовать в течение 7 дней при условии ее хранения при температуре плюс (2 — 8) °C.

8.19.3. Питательная среда для выделения коринебактерий (Коринебакагар).

Состав Коринебакагара представлен в табл. 2.

Таблица 2

Состав Коринебакагара, г/л

Наименование компонента	Используемое количество, г/л
Панкреатический гидролизат рыбной муки	20,0
Стимулятор роста гемофильных микроорганизмов	10,0
Натрия хлорид	5,0
Глюкоза	1,0
Агар	10,0 +/- 2,0

Дополнительно вносят коммерческий 2%-й раствор теллурита калия (из расчета 12,5 мл раствора на 1 л основы).

Приготовление Коринебакагара. Основу в количестве, указанном на этикетке для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят не более 2 мин до полного расплавления агара, разливают мерно во флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре плюс (121 +/- 1) °C в течение 15 мин. Среду охлаждают до температуры плюс (45 — 50) °C, добавляют в асептических условиях коммерческий 2%-й раствор калия теллурита из расчета 12,5 мл раствора на 1 л основы, тщательно перемешивают, разливают в стерильные чашки Петри слоем 5 — 6 мм. После застывания чашки со средой подсушивают в асептических условиях. Внесение крови не требуется.

Готовую среду можно использовать не более 7 суток при условии ее хранения при температуре плюс (2 — 8) °C или в течение 2 суток в случае хранения при температуре плюс (18 — 25) °C.

Среды для ведения культур

8.20. Среды для ведения культур представлены в п.п. 8.20.1 - 8.20.2.

8.20.1. 10%-й сывороточный агар.

Сывороточный агар, используемый для отсева колоний и культивирования коринебактерий, может быть приготовлен на любой из перечисленных выше питательных основ. В качестве сыворотки можно использовать телячью сыворотку или СККРС (без консервантов).

Приготовление сывороточного агара. К 90 мл расплавленного и охлажденного до температуры плюс (50 +/- 1) °C питательного агара (pH 7,6) стерильно добавляют 10 мл СККРС или телячьей сыворотки без консервантов. Среду перемешивают, разливают в стерильные пробирки по 4 — 5 мл и устанавливают их в наклонном положении для получения скошенного агара, каждая партия которого проверяется на стерильность, для чего 3 пробирки без посева бактериальных культур помещают на сутки в термостат при плюс (37 +/- 1) °C. В случае прорастания среды бракуется вся партия.

Готовые пробирки со скошенным сывороточным агаром можно использовать до 10 дней при условии их хранения при температуре плюс (2 — 8) °C.

8.20.2. 5 — 10%-й кровяной агар.

Кровяной агар, используемый для отсева колоний и культивирования коринебактерий, может быть приготовлен на любой из перечисленных выше питательных основ. В качестве крови можно использовать ККРС или баранью кровь.

Приготовление кровяного агара. К 100 мл расплавленного и охлажденного до температуры плюс (45 — 50) °C питательного агара (pH 7,6) стерильно добавляют 5 — 10% ККРС или бараньей крови (кровь должна быть комнатной температуры или согретой в термостате). Среду перемешивают, разливают в стерильные чашки Петри слоем 4 — 5 мм. Каждая новая партия среды (приготовленная в лабораторных условиях или коммерческая) проверяется на стерильность с занесением информации в журнал контроля питательных сред в установленном порядке.

Допускается использование готовых кровяных агаров, зарегистрированных и разрешенных для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <21>.

<21> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

Готовые чашки с кровяным агаром можно использовать до 10 дней при условии их хранения при температуре плюс (2 — 8) °C.

Среды для определения токсигенности

8.21. Для определения токсигенности C. diphtheriae, C. ulcerans и C. pseudotuberculosis допускается использование готовых к применению коммерческих питательных сред, предназначенных для продукции микроорганизмами дифтерийного токсина, зарегистрированных и разрешенных для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <22>.

<22> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

8.21.1. В качестве сред для определения токсигенности можно использовать Коринетоксагар или ОТДМ.

Приготовление питательной среды проводится в соответствии с инструкцией производителя.

Готовая среда в пробирках может храниться в течение 14 дней при температуре плюс (2 — 8) °C.

Приготовление чашек для пробы на токсигенность представлено в п. 8.9.1. Готовая среда в чашках Петри прозрачная, желтого цвета, не очень плотная.

Среду с сывороткой в чашках можно использовать в течение 2 суток при условии ее хранения при температуре плюс (2 — 8) °C.

Среды для определения биохимических свойств

8.22. Среды и реактивы для определения биохимических свойств представлены в п.п. 8.22.1 - 8.22.5.

8.22.1. Среда для определения цистиназной активности (среда Пизу) (коммерческая).

Для определения цистиназной активности C. diphtheriae, C. ulcerans и C. pseudotuberculosis допускается использование коммерческой питательной среды Пизу, предназначенной для определения продукции микроорганизмами фермента цистиназы, зарегистрированной и разрешенной для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <23>.

<23> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

Приготовление коммерческой среды Пизу. Сухую смесь в количестве, указанном на этикетке для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят 3 мин до полного расплавления агара. Среду не стерилизуют. Среду разливают при постоянном перемешивании по 4 мл в стерильные пробирки, соблюдая правила асептики. Готовая среда светло-желтого цвета. Допускается осадок на дне пробирки и небольшая опалесценция.

Готовая среда в пробирках может храниться до 10 дней при температуре плюс (2 — 8) °C.

8.22.2. Среда Пизу на основе коммерческой среды АГВ (лабораторно приготовленная).

Приготовление среды Пизу. Навеску сухой среды АГВ в количестве 2,7 г вносят в 90 мл дистиллированной воды и кипятят до ее полного растворения. Готовят 5%-й раствор гидрокарбоната натрия. Для этого растворяют 0,5 г NaHCO3 в 10 мл дистиллированной воды. Затем в раствор вносят 0,1 г L-цистина и кипятят до полного растворения цистина. После охлаждения до комнатной температуры 2 мл приготовленного щелочного раствора цистина вносят в 90 мл расплавленной среды АГВ, доводят pH до 7,6 +/- 0,1 и стерилизуют при плюс (112 +/- 1) °C в течение 10 мин. К расплавленной и охлажденной до плюс (45 +/- 1) °C основе последовательно добавляют 10 мл СКРС, 1 мл 10%-го раствора уксусно-кислого свинца, 1,5 мл стерильного свежеприготовленного 10%-го раствора тиосульфата натрия и разливают по пробиркам, высота столбика питательной среды должна быть не менее 3 см.

Растворы уксусно-кислого свинца и тиосульфата натрия готовят ex tempore, используя стерильные пробирки и дистиллированную воду, стерилизуют на водяной бане при плюс (100 +/- 1) °C в течение 30 мин.

Готовую среду допускается использовать в течение 3 суток после ее приготовления при условии хранения при температуре плюс (2 — 8) °C.

8.22.3 Среды и реактивы для определения уреазной активности.

Определение уреазной активности можно осуществлять следующими способами:

приготовление реактивов для определения уреазной активности по методу Заксе. Готовят 2 реактива — A и B (табл. 3). Непосредственно перед применением смешивают 1 часть реактива A и 19 частей реактива B. Полученную смесь разливают по 0,1 — 0,2 мл в стерильные пробирки.

Таблица 3

Приготовление реактивов для определения уреазной активности по методу Заксе

Наименование реактива	Наименование компонента	Используемое количество	Условия стерилизации
Реактив A	Мочевина	2 г	Не стерилизуют
	Спирт этиловый 96%-й	2 мл
	Вода дистиллированная	4 мл
Реактив B	0,2%-й раствор фенолрот	1 мл	Стерилизуют в автоклаве текучим паром при плюс (100 +/- 1) °C в течение 30 — 60 мин в зависимости от объема раствора
	Однозамещенный фосфат калия	0,1 г
	Двузамещенный фосфат калия	0,1 г
	Натрий хлористый	0,5 г
	Вода дистиллированная	мл

Реактивы A и B хранят при температуре плюс (2 — 8) °C не более 1 месяца;

приготовление бульона с мочевиной для определения уреазной активности. К 100 мл стерильного ГРМ-бульона, или мясо-пептонного бульона, или бульона Хоттингера (pH 7,0) добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6%-го спиртового раствора индикатора крезолрот. Готовый бульон с мочевиной разливают над пламенем горелки по 2 — 3 мл в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром при (110 +/- 1) °C или на водяной бане в течение 15 мин.

Условия хранения: при температуре от плюс (2 — 8) °C — 14 дней.

8.22.4 Среда и реактивы для определения нитратредуктазной активности.

Определение нитратредуктазной активности можно осуществлять следующими способами:

лабораторно приготовленный нитратный бульон. Приготовление нитратного бульона. К 100 мл питательного бульона (ГРМ-бульона, или мясо-пептонного бульона, или бульон Хоттингера) (pH 7,3 — 7,5), свободного от нитритов (проверить реактивом Грисса или Касаткина), прибавляют 0,1 г свободного от нитритов нитрата калия (KNO3). Проверяют еще раз на содержание нитритов и разливают по 2 — 3 мл в химически чистые сухие пробирки. Среды стерилизуют 15 мин при плюс (121 +/- 1) °C.

Условия и сроки хранения: при температуре плюс (2 — 8) °C в защищенном от света месте не более 14 дней;

питательная среда для определения восстановления нитратов в нитриты «Питательная среда № 7 ГРМ». Приготовление питательной среды № 7 ГРМ. Навеску питательной среды размешивают 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 10 мл в стеклянные пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре плюс (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

Приготовление реактива Грисса.

Раствор 1: 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты, прибавляют 100 мл дистиллированной воды, фильтруют.

Условия и сроки хранения: раствор годен в течение 1 месяца при плюс (2 — 8) °C.

Раствор 2: 0,1 г 1-нафтиламина растворяют в 100 мл кипящей воды, охлаждают, прибавляют 30 мл ледяной уксусной кислоты, фильтруют.

Условия и сроки хранения: раствор годен в течение 7 суток при плюс (2 — 8) °C. Растворы хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой. Раствор серого или розового цвета не использовать.

Перед использованием растворы № 1 и № 2 смешивают в равных объемах.

Допускается использование коммерческого сухого реактива Грисса, используя теплую (не выше плюс (50 +/- 1) °C) воду дистиллированную.

Реактив Касаткина:

раствор 1: 0,1%-й раствор риванола в дистиллированной воде;
раствор 2: 12%-й раствор соляной кислоты (HCl).

Растворы 1 и 2 хранят при плюс (4 — 8) °C в течение 2 месяцев.

Перед выполнением реакции смешивают равные объемы растворов 1 и 2. Реактив годен к применению в течение 15 мин.

8.22.5. Среды и реактивы для определения сахаролитической активности (Гисса с глюкозой, сахарозой, крахмалом) (в модификации).

Среда Гисса с глюкозой, сахарозой.

Приготовление среды Гисса с глюкозой, сахарозой. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 1 г углевода, 0,5 г NaCl, 1 мл индикатора Андреде и 1 каплю 20%-го раствора NaOH. Доводят приготовленный раствор до кипения. Разливают по 2 — 3 мл в химически чистые сухие пробирки. Среды стерилизуют автоклавированием при температуре плюс (112 +/- 1) °C в течение 20 мин, или текучим паром в течение 3 дней по 30 мин, или при 0,5 атм. 30 мин. Готовые среды с индикатором Андреде бесцветные или имеют соломенный оттенок.

Условия и сроки хранения: при температуре плюс (2 — 8) °C в защищенном от света месте не более 14 дней.

Среда Гисса с крахмалом.

Приготовление среды Гисса с крахмалом. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 0,5 г крахмала, 0,5 г NaCl, 1 мл индикатора Андреде и 1 каплю 20%-го раствора NaOH. Доводят приготовленный раствор до кипения, дают остыть и добавляют 0,5 г растворимого крахмала. Разливают по 2 — 3 мл в химически чистые сухие пробирки. Среду стерилизуют автоклавированием при температуре плюс (112 +/- 1) °C в течение 20 мин, или текучим паром в течение 3 дней по 30 мин, или при 0,5 атм. 30 мин. Готовые среды с индикатором Андреде бесцветные или имеют соломенный оттенок.

Условия и сроки хранения: при температуре плюс (2 — 8) °C в защищенном от света месте не более 14 дней.

Реактив Андреде.

Состав реактива Андреде представлен в табл. 4.

Таблица 4

Состав реактива Андреде

Наименование компонента	Используемое количество
Фуксин кислый	0,5 г
Натрий гидроокись (1N NaOH)	20,0 мл
Дистиллированная вода	100,0 мл

Приготовление реактива Андреде. Кислый фуксин растворяют в дистиллированной воде и добавляют раствор 1N NaOH (4 г NaOH, 100 мл дистиллированной воды), перемешивают и выдерживают на свету при комнатной температуре 48 ч, периодически встряхивая, затем убирают в темное место в темной посуде. Если обесцвечивания раствора не происходит, то фуксин для работы не пригоден.

Готовый индикатор Андреде хранят в темной стеклянной посуде с притертой пробкой при комнатной температуре.

Красители

8.23. Для определения тинкториальных свойств используются лабораторно приготовленные красители. Допускается использование готовых к применению коммерческих наборов красителей, зарегистрированных и разрешенных для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <24>.

<24> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

8.23.1 Приготовление растворов для окраски по Граму.

В лабораторных условиях для выполнения окраски по Граму готовят следующие растворы:

Карболовый раствор генцианового фиолетового (а) или кристаллического фиолетового (б).

а) 1 г красителя, 10 мл 96%-го спирта, 2 г кристаллической карболовой кислоты, 100 мл дистиллированной воды. В ступке растирают краситель с карболовой кислотой до консистенции кашицы, прибавляют небольшими порциями спирт и окончательно разводят водой, сливают в бутыль, оставляют на сутки, затем фильтруют;

б) 10 мл насыщенного 4,8%-го спиртового раствора красителя, 100 мл 2% карболовой воды.

Срок хранения карболового раствора генцианового фиолетового или кристаллического фиолетового в темном прохладном месте при температуре плюс (2 — 8) °C — не более 2 месяцев.

Раствор Люголя (в модификации Грама).

2 г йодида калия, 10 мл дистиллированной воды, 1 г йода кристаллического. Смесь хорошо укупоривают, оставляют на сутки, после чего добавляют до 300 мл дистиллированной воды. Раствор Люголя хранят в темном, прохладном месте в стеклянных емкостях темного цвета.

Срок хранения раствора Люголя в сухом защищенном от света месте при температуре плюс (8 — 15) °C — не более 30 дней.

Карболовый раствор фуксина Циля.

1 г основного фуксина, 10 мл 96%-го спирта, 5 г кристаллической карболовой кислоты, 100 мл дистиллированной воды. В ступке растирают краситель с карболовой кислотой до консистенции кашицы, прибавляют небольшими порциями спирт и окончательно разводят водой, сливают в бутыль, оставляют на сутки, затем фильтруют;

Срок хранения раствора фуксина в сухом защищенном от света месте при температуре плюс (10 — 35) °C — не более 1 года.

8.23.2 Приготовление растворов для окраски по Нейссеру.

Приготовление растворов.

В лабораторных условиях для выполнения окраски по Нейссеру готовят следующие растворы:

0,1 г метиленового синего кристаллического, 2 мл 96%-го этилового спирта, 5 мл уксусной кислоты ледяной, 100 мл дистиллированной воды;
раствор хризоидина, или везувина, или бисмарк-браун: 1 г красителя, 300 дистиллированной воды. Краситель растворяют в кипящей воде, затем фильтруют через бумагу.

Методика окраски по Нейссеру:

на фиксированный мазок наливают уксуснокислую синьку Нейссера на 2 — 3 мин;
сливают краситель и наносят раствор Люголя на 40 сек;
промывают мазок водой;
докрашивают раствором хризоидина (или везувина, или бисмарк-браун) 1 — 3 мин.

Далее промывают водой, высушивают. Тела бактерий окрашиваются в нежно-желтый цвет, зерна волютина — в темно-коричневый с синим оттенком.

Срок хранения раствора в сухом защищенном от света месте при температуре плюс (10 — 35) °C — не более 6 месяцев.

8.23.3 Щелочной метиленовый синий по Леффлеру.

Приготовление красителя. Смешать 99 мл дистиллированной воды, 1 мл 1%-го раствора гидроксида калия (KOH) и 30 мл 10%-го спиртового раствора метиленового синего.

Методика окраски: на фиксированный мазок наливают краситель, окрашивают в течение 1 — 2 мин, затем краситель сливают, препарат промывают водой и высушивают.

Срок хранения раствора в сухом защищенном от света месте при температуре плюс (10 — 35) °C — не более 6 месяцев.

8.23.4 Окраска уксуснокислым толуидиновым синим.

Смешать толуидиновый синий 0,5 г, ледяную уксусную кислоту 2 мл, 96%-го этилового спирта 5 мл и 100 мл дистиллированной воды.

Методика окраски: на фиксированный мазок наливают краситель, окрашивают в течение 3 — 5 мин, затем краситель сливают, препарат промывают водой и высушивают.

Срок хранения раствора в сухом защищенном от света месте при температуре плюс (10 — 35) °C — не более 6 месяцев.

Контрольные штаммы

8.24 Перечень используемых штаммов.

Для проведения внутрилабораторного контроля качества питательных сред, используемых реагентов и постановки биохимических тестов необходимо использовать следующие контрольные штаммы:

токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665;
токсигенный штамм C. diphtheriae биовара mitis № 6765;
токсигенный штамм C. ulcerans № 7819 или штамм C. pseudodiphtheriticum «Соколов»;
штамм S. aureus ATCC 25923 (для внутрилабораторного контроля качества сред первичного посева и как дополнительный штамм для постановки CAMP-теста);
штамм S. pyogenes ATCC 19615 (дополнительный для CAMP-теста);
штамм S. agalactiac ATCC 13813 (дополнительный для CAMP-теста);
штамм S. aureus ATCC 6538-P (дополнительный для CAMP-теста).

Контрольные штаммы C. diphtheriae, C. ulcerans и C. pseudodiphtheriticum получают из специализированных государственных коллекций патогенных микроорганизмов. Используемые контрольные штаммы должны обладать типичными свойствами и соответствовать паспортным данным.

8.25 Хранение контрольных штаммов в лабораторных условиях.

Варианты хранения контрольных штаммов:

в лиофилизированном состоянии при температуре плюс (2 — 8) °C не более 3 лет;
на среде хранения — в полужидком сывороточном агаре, приготовленном на бульоне (pH 7,6). В качестве бульона можно использовать коммерческие бульоны (ГРМ-бульон или сердечно-мозговой бульон). Полужидкий агар разливают по 8 мл в пробирки и добавляют по 1 мл СККРС. В зависимости от интенсивности работы лаборатории посев каждого из контрольных штаммов проводят в 4 — 7 пробирок из расчета по 1 — 2 пробирки на 1 месяц работы и в 1 пробирку для восполнения запасов рабочей культуры через 3 месяца на следующий квартал. Посевы инкубируют 24 ч при плюс (37 +/- 1) °C. При наличии роста пробирки закрывают резиновыми пробками и закладывают на хранение при температуре плюс (2 — 8) °C. Одну из пробирок с культурой, предназначенной для восполнения рабочих запасов, маркируют и хранят отдельно. Запасы рабочей культуры желательно хранить в отдельном холодильнике. Условия и сроки хранения: при температуре от плюс (2 — 8) °C, пересев один раз в 3 месяца. Восполнять запас рабочей культуры разрешается только 3 раза (конец 3, 6 и 9 месяца) с момента его создания, далее необходимо вскрыть новую ампулу с контрольным штаммом;
длительное хранение в 50%-м растворе глицериновой смеси. Раствор глицерина готовят в стерильном физиологическом растворе, стерилизуют 15 мин при плюс (121 +/- 1) °C, разливают по 1,5 мл в одноразовые пластиковые пробирки емкостью 2 мл с закручивающимися крышками, бактериальную культуру суспендируют в раствор. Рекомендуется закладывать по несколько аликвот каждого из контрольных штаммов. Условия и сроки хранения: не более 6 месяцев при температуре минус (18 — 34 °C). Закладку запасов эталонной культуры на длительное хранение осуществляют единожды на весь период ее использования. Запасы эталонной культуры восполнению не подлежат;
длительное криохранение культур при температуре не выше минус 70 °C в защитной среде. Состав защитной среды: глицерин — 100 мл, лактоза — 50 г, дистиллированная вода — до 1 л. Защитную среду разливают в криопробирки, подлежащие хранению при минус (70 +/- 1) °C. Криопробирки с запасом эталонной культуры устанавливают в криобокс (штатив для криопробирок) и закладывают на хранение при температуре минус (70 +/- 1) °C. Допускается применение коммерческих криопробирок с бусинами или без бусин с готовым консервантом для хранения и воспроизводства штаммов. Срок хранения — не более 5 лет. Закладку запасов эталонной культуры на длительное хранение осуществляют единожды на весь период ее использования. Запасы эталонной культуры восполнению не подлежат;
длительное хранение в жидком азоте (при наличии соответствующего оборудования). Срок хранения — не более 5 лет. Закладку запасов эталонной культуры на длительное хранение осуществляют единожды на весь период ее использования. Запасы эталонной культуры восполнению не подлежат.

8.26. Восстановление контрольных штаммов можно осуществлять разными способами в зависимости от вида и формы хранения культур.

8.26.1. Восстановление контрольных штаммов возможно согласно инструкции коллекции патогенных микроорганизмов.

8.26.2. Для восстановления контрольных штаммов из лиофилизированного состояния из ампулы: оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона, пропитанного стерильным физиологическим раствором и отжатым, прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Ватный тампон не должен быть сильно влажным (его нужно отжать), т.к. жидкость с тампона может попасть в пробирку с лиофилизатом из-за разности давления. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70%-м этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом. После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1 — 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят 0,5 мл питательного бульона (ГРМ-бульон, сердечно-мозговой бульон) для регидратации. Содержимое ампулы перемешивают, переносят стерильной пастеровской пипеткой в пробирку с питательным бульоном (ГРМ-бульон, сердечно-мозговой бульон), содержащим СККРС и теллурит калия (пример расчета: 4 мл питательного бульона, 500 мкл СККРС без консервантов и 1 капля коммерческого 2%-го раствора теллурита калия), и инкубируют при плюс (37 +/- 1) °C в течение 24 ч. После инкубации бульон с культурой высевают на КТА или КБА; можно продублировать высев на кровяной агар.

8.26.3. Для восстановления контрольных штаммов из лиофилизированного состояния из флакона все манипуляции с высушенным образцом проводят стерильно над подносом или лотком с марлевой салфеткой, пропитанной дезинфицирующим раствором. Крышку флакона и флакон обработать 70%-м спиртом. Алюминиевый колпачок обжечь над пламенем горелки. Далее вскрытие осуществляют следующими способами:

вариант 1. Используя одноразовый шприц объемом 1 — 5 мл и с иглой № 0840 (для внутримышечного введения), из флакона или пробирки набирают в шприц 0,3 мл стерильного питательного бульона (ГРМ-бульон, сердечно-мозговой бульон). Отгибают клапан (середину) алюминиевого колпачка и прокалывают иглой резиновую пробку. После этого вводят содержимое шприца во флакон. Не отпуская поршень, шприц с иглой извлекают из пробки флакона, флакон обертывают салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором, и, осторожно встряхивая, растворяют содержимое. Полученную взвесь отбирают при помощи шприца и переносят в пробирки с бульоном (ГРМ-бульон, сердечно-мозговой бульон), содержащим СККРС и теллурит калия, и инкубируют при плюс (37 +/- 1) °C в течение 24 ч. После инкубации бульон с культурой высевают на КТА или КБА; можно продублировать высев на кровяной агар;
вариант 2. Возможно открытие флакона с помощью пинцета и отбор содержимого с помощью любого пипетирующего устройства (автоматическая пипетка-дозатор, пастеровская пипетка или мерная градуированная пипетка для микробиологического титрования.). Для этого крышку флакона и флакон обработать 70%-м спиртом. Алюминиевый колпачок обжечь над пламенем горелки. Обжечь пинцет, аккуратно снять алюминиевый колпачок, сбросить в дезинфицирующий раствор. Пинцетом снять резиновую пробку и в открытый флакон (флакон при этом держат под небольшим углом) ввести пастеровской пипеткой (или другим устройством) 0,3 мл стерильного питательного бульона (ГРМ-бульон, сердечно-мозговой бульон). Осторожно пипеткой перемешать до растворения сухого содержимого флакона. После растворения полученную взвесь переносят пастеровской пипеткой (или другим устройством) в пробирки с бульоном (ГРМ-бульон, сердечно-мозговой бульон), содержащим СККРС и теллурит калия, и инкубируют при плюс (37 +/- 1) °C в течение 24 ч. После инкубации бульон с культурой высевают на КТА или КБА; можно продублировать высев на кровяной агар.

8.26.4. Для восстановления контрольных штаммов из криозаморозки или из жидкого азота: температуру криопробирки из запасов эталонной культуры доводят до комнатной температуры (при использовании готовых коммерческих криопробирок с бусинами сразу, вынув пробирку и отвинтив крышку, стерильным пинцетом или инокуляционной петлей/иглой достают одну бусину). Содержимое (или бусину) аккуратно перемешивают, вносят в пробирку с 4 мл питательного бульона (ГРМ-бульон, сердечно-мозговой бульон), содержащий СККРС и теллурит калия (в том же соотношении, что и выше), и инкубируют при плюс (37 +/- 1) °C в течение 24 ч. После инкубации бульон с культурой высевают на КТА или КБА; можно продублировать высев на кровяной агар. При использовании бусины возможен сразу посев газоном на чашку с плотной питательной средой с дальнейшей инкубацией при плюс (37 +/- 1) °C в течение 24 ч.

8.26.5. Для восстановления контрольных штаммов коринебактерий из полужидкого агара или 50%-го глицерина: бактериальную взвесь переносят в питательный бульон (ГРМ-бульон, сердечно-мозговой бульон), содержащий СККРС и теллурит калия (в том же соотношении, что и выше). Далее инкубируют при плюс (37 +/- 1) °C в течение 24 ч. После инкубации бульон с культурой высевают на КТА или Коринебакагар; можно продублировать высев на кровяной агар.

8.26.6. После восстановления контрольных штаммов из условий хранения у них необходимо оценить культурально-морфологические свойства и поставить все тесты на соответствие полученного штамма видовым и паспортным свойствам. Культуры с измененными свойствами в работу не допускаются.

Внутрилабораторный контроль качества бактериологического исследования на дифтерийную инфекцию

8.27. Порядок проведения внутрилабораторного контроля качества при бактериологической диагностике дифтерийной инфекции.

Для поддержания высокого качества и эффективности проведения лабораторной диагностики дифтерийной инфекции в лабораториях, осуществляющих этот вид исследований, обязательным является осуществление внутрилабораторного контроля качества, проведение которого фиксируется в соответствующих журналах в установленном порядке.

8.28 Внутрилабораторный контроль качества включает:

правильное поддержание (ведение) контрольных штаммов;
проведение контроля качества всех питательных сред, реагентов, наборов реагентов, используемых для: приготовления сред первичного посева (входящий контроль — каждая новая серия питательной среды, каждая новая партия реагентов; периодический контроль); приготовления среды для постановки пробы на токсигенность (входящий контроль — каждая новая серия питательной среды, каждая новая партия реагентов; периодический контроль); сред, наборов реагентов и тест-систем для проведения биохимической идентификации как приготовленных в лабораторных условиях, так и коммерческих (входящий контроль — каждая новая серия питательной среды, каждая новая партия реагентов, наборов реагентов, тест-систем; периодический контроль);
контроль постановки пробы на токсигенность (каждая постановка);
контроль проведения биохимических тестов — постановка положительных и отрицательных контролей при проведении биохимической идентификации (каждая постановка);
контроль качества жидких транспортных сред (каждая новая серия/приготовленная партия).

8.29. Проведение внутрилабораторного контроля качества питательных сред, реагентов, наборов реагентов необходимо осуществлять при: выявлении нарушений условий хранения; смене контрольных штаммов; после ремонтно-профилактических работ (например, термостат, автоклав); выявлении неудовлетворительного выполнения внешней оценки качества микробиологических исследований; выявлении возможного снижения качества сред, реагентов, тест-систем в динамике (в случае снижения высеваемости нетоксигенных штаммов); уменьшении величины колоний искомого микроорганизма по сравнению с входящим контролем; позднем появлении роста культуры в среде, не соответствующем срокам для данного микроорганизма; отсутствии подавления роста сопутствующей микрофлоры на среде с заявленными ингибирующими свойствами.

При длительном использовании одной серии реактивов, наборов реагентов и тест-систем внутрилабораторный контроль качества необходимо проводить 1 раз в квартал (периодический контроль).

8.30 Целевое использование контрольных штаммов в лаборатории качества включает:

токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665 пересевается каждые 1 — 2 суток (для готовности к постановке пробы на токсигенность, а также оценки ростовых свойств сред первичного посева и проведения биохимической идентификации). Если в бактериологической лаборатории временно не проводятся исследования на дифтерию, необходимо проводить регулярный контроль (не реже 2 раз в месяц) токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 в пробе на токсигенность и на среде Пизу;
токсигенный штамм C. diphtheriae биовара mitis № 6765, токсигенный штамм C. ulcerans № 7819 или штамм C. pseudodiphtheriticum «Соколов» пересевается каждые 1 — 2 суток (для проведения биохимической идентификации);
штамм S. aureus ATCC 25923 пересевается каждые 1 — 2 суток (для проведения биохимической идентификации и оценки ингибирующих свойств сред первичного посева);
штамм S. aureus ATCC 25923 или штамм S. aureus ATCC 6538-P, штамм S. pyogenes ATCC 19615 и штамм S. agalactiae ATCC 13813 (дополнительные штаммы для постановки обратного CAMP-теста).

Периодически (при закладке эталонных штаммов на длительное хранение) контрольные штаммы проверяют 1 раз в квартал по всем тестам на соответствие полученного штамма видовым и паспортным свойствам.

8.31 Контроль качества питательных сред для первичного посева.

Контроль качества сред для первичного посева исследуемого материала устанавливают путем определения:

всхожести клеток C. diphtheriae и размера колоний (24 ч);
интенсивности роста колоний (48 ч);
размера и культурально-морфологических свойств (48 ч);
ингибирующей активности в отношении сопутствующей микрофлоры (24 и 48 ч).

Для проведения контроля качества сред для первичного посева используют контрольные штаммы:

токсигенный штамм C. diphtheriae биовара gravis № 665;
штамм S. aureus ATCC 25923.

Посев бактериальных культур.

Суточные культуры контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 и штамма S. aureus ATCC 25923, выращенные на 10%-м сывороточном агаре, смывают физиологическим раствором. Готовят исходную взвесь каждой культуры (пробирка № 0): мутность полученной суспензии должна соответствовать 10 ед. оптического стандарта мутности (ОСО 42-28-85 П), что условно соответствует 1 млрд бактериальных клеток в 1 мл взвеси или 3 ед. по стандарту МакФарланда (при наличии денситометра). Из исходных взвесей культур (пробирки № 0) готовят последовательные разведения в физиологическом растворе согласно табл. 5.

Таблица 5

Схема приготовления разведений культур C. diphtheriae биовара gravis № 665 и S. aureus ATCC 25923

№ пробирки	Кол-во физ. р-ра, мл	Объем вносимой суспензии, мл	Условное кол-во микр. клеток в 1 мл взвеси
1	1,0	1,0 из исходной взвеси	5 x 108
2	4,5	0,5 из 1-й пробирки	5 x 107
3	4,5	0,5 из 2-й пробирки	5 x 106
4	4,5	0,5 из 3-й пробирки	5 x 105
5	4,5	0,5 из 4-й пробирки	5 x 104
6	4,5	0,5 из 5-й пробирки	5 x 103
7	2,0	0,5 из 6-й пробирки	103

Из двух последних разведений (пробирки № 6 и № 7) по 0,1 мл суспензии бактериальной культуры токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 вносят в 2 чашки с испытуемой средой первичного посева, досуха втирают круговыми движениями при помощи шпателя. На 2 другие чашки с испытуемой средой таким же образом из пробирок № 6 и № 7 производят посев взвеси S. aureus ATCC 25923.

Засеянные чашки Петри ставят в термостат и инкубируют 24 — 48 ч при температуре плюс (37 +/- 1) °C.

Учет результатов производят визуально через 24 и 48 ч.

Питательная среда для первичного посева биологического материала удовлетворяет необходимым требованиям, если колонии C. diphtheriae формируются на испытуемой среде через 24 ч инкубации. При высеве из разведения 103 (пробирка № 7) должна вырастать хотя бы одна колония C. diphtheriae. Отсутствие формирования (наличие видимых невооруженным глазом) колоний C. diphtheriae через 24 ч инкубации в посевах из разведений 5 x 103 (пробирка № 6) и 103 (пробирка № 7) или через 48 ч инкубации в посеве из 103 разведения (пробирка № 7) свидетельствует о сниженных ростовых свойствах питательной основы. В этом случае питательную основу нельзя использовать и необходимо поменять.

КТА и КБА должны подавлять рост S. aureus при посеве 103 микробных клеток в 1 мл взвеси (пробирка № 7). Появление единичных (1 — 2) колоний S. aureus в посеве из пробирки № 7 (чаще всего на КТА) свидетельствует о снижении ингибирующих свойств данной серии среды. Повышение концентрации теллурита калия в среде не допускается.

8.32 Контроль качества среды для определения токсигенности.

Контроль качества среды для определения токсигенности C. diphtheriae осуществляют путем проверки ее только контрольным токсигенным штаммом C. diphtheriae биовара gravis № 665, соблюдая методику определения токсигенных свойств на плотных питательных средах.

Учет результатов производят визуально через 24 и 48 ч.

Критерием оценки качества среды является наличие четких специфических линий преципитации и время их образования. Пригодными для работы считаются такие серии среды и сыворотки, при использовании которых у контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 образуются линии преципитации («усы» преципитации) не позднее 24 ч после посева бляшками.

Отсутствие у контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 интенсивных (четкие, визуализированные) линий преципитации («усы» преципитации) через 24 ч после посева бляшками свидетельствует о непригодности этой среды и (или) ингредиентов для постановки пробы на токсигенность и (или) нарушениях техники постановки пробы.

8.33 Контроль качества сред для определения биохимических свойств.

Внутрилабораторный контроль качества сред для определения биохимических свойств проводят путем определения степени выраженности и времени формирования признака у контрольных штаммов (положительные контроли); отсутствие реакции в отрицательных контролях.

8.33.1. Оценка качества сред, реагентов, реактивов и постановка пробы Пизу: наличие через 24 ч окрашивания среды в зоне роста культуры в темно-коричневый цвет по ходу укола в среду Пизу и образование вокруг него облачка темно-коричневого цвета у контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 (положительный контроль); отсутствие этого признака в среде без посева культуры (отрицательный контроль); не допускается наличие в готовой среде Пизу пузырьков.

8.33.2. Оценка качества сред, наборов реагентов, реактивов, тест-систем и постановка пробы для определения уреазной активности: наличие изменения цвета среды в малиновый, свидетельствующее о сдвиге pH среды в щелочную сторону, и изменения цвета индикатора под действием расщепления ферментом уреазы мочевины до диоксида углерода и аммиака; данный признак характерен для контрольного токсигенного штамма C. ulcerans № 7819 или контрольного штамма C. pseudodiphtheriticum «Соколов» (положительный контроль); отсутствие этого признака в среде без посева культуры (отрицательный контроль) и у контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665.

8.33.3. Оценка качества сред, наборов реагентов, реактивов, тест-систем и постановка пробы для определения нитратредуктазной активности: наличие через 24 ч роста окрашивания среды в красный цвет при восстановлении нитрата до нитрита, катализируемом ферментом нитратредуктазой после добавления реактива Грисса/Касаткина, у контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 (положительный контроль); отсутствие этого признака в стерильной среде без посева культуры (отрицательный контроль).

8.33.4. Оценка качества сред, реагентов и постановка пробы для определения сахаролитической активности: наличие окрашивания среды в ярко-малиновый цвет при сбраживании того или иного углевода с образованием кислоты, что способствует сдвигу pH среды и изменению цвета индикатора. Наличие ферментации глюкозы и крахмала у контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665 (положительный контроль); отсутствие ферментации крахмала у контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара mitis № 6765 (отрицательный контроль); наличие ферментации сахарозы у контрольного штамма S. aureus ATCC 25923 (положительный контроль); отсутствие признака в среде без посева культуры (отрицательный контроль).

8.33.5. Оценка качества сред, реагентов и постановка обратного CAMP-теста: наличие торможения гемолитического эффекта бета-гемолиза у золотистого стафилококка — штамма S. aureus ATCC 25923 или штамма S. aureus ATCC 6538-P; штамм S. pyogenes ATCC 19615 (отрицательный контроль); штамм S. agalactiae ATCC 13813 (положительный контроль CAMP-теста).

8.34 Контроль качества жидких транспортных сред.

Контроль качества жидких транспортных сред определяется по сохранению жизнеспособности и стабильности основных биологических свойств микроорганизмов.

8.34.1 Определение показателей сохранения жизнеспособности.

Суточную культуру контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665, выращенную на 10%-м сывороточном агаре, смывают физиологическим раствором. Мутность полученной суспензии должна соответствовать 10 ед. оптического стандарта мутности (ОСО 42-28-85 П). Из исходных взвесей культур готовят последовательные разведения в физиологическом растворе, как показано в табл. 5. Далее по 1 мл микробной взвеси из пробирок № 5 и № 6 высевают на 4 пробирки с жидкой транспортной средой. Из 2 пробирок, тщательно перемешав содержимое, по 0,1 мл взвеси сразу высевают на чашки Петри с КТА или КБА («нулевой» посев). Засеянные чашки Петри ставят в термостат и инкубируют 24 — 48 ч при температуре плюс (37 +/- 1) °C.

Посев в других пробирках выдерживают при плюс (18 — 24) °C, а затем из них делают высев на КТА или КБА и инкубируют 24 — 48 ч при температуре плюс (37 +/- 1) °C.

Среднее количество колоний, выросших при «нулевом» посеве и после 24 — 48 ч выдерживания в транспортной среде, не должны различаться более чем в 10 раз.

8.34.2. Определение показателей стабильности основных биологических свойств микроорганизмов.

Данный показатель определяют на чашках, где выросло не менее 25 колоний. При этом оценивается соответствие выросших колоний характерным культуральным, токсигенным и биохимическим свойствам контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis № 665. Изучение проводят по всем методикам.

IX. Серологические исследования

9.1. При диагностике дифтерийной инфекции как дополнительные методы используются иммуноферментный анализ (далее — ИФА) и реакция пассивной гемагглютинации (РПГА).

9.2. Биологическим материалом для серологического исследования служит сыворотка крови. Пациента обследуют в динамике. Первый забор крови проводится не позднее 5 дней от начала заболевания и строго до начала введения противодифтерийной сыворотки.

Повторно кровь берут не ранее, чем через 14 дней от первого забора. Для получения объективных данных обе сыворотки должны быть поставлены в одной постановке.

Взятие биологического материала для серологического исследования

9.3. Материалом для исследования служит сыворотка крови. Не рекомендуется использовать мутные вследствие липемии гемолизированные образцы. Перед исследованием их необходимо процентрифугировать при 3000 об./мин в течение 10 мин. Использование сильно гемолизированных образцов не допускается. В этом случае рекомендуется повторное взятие образца крови.

9.4 Забор крови осуществляется одним из 2 способов:

взятие крови из вены. Кровь забирают из вены в объеме 3 — 4 мл или из подушечки пальца в объеме 0,5 — 1,0 мл (у детей младшего возраста) в одноразовую пластиковую пробирку без антикоагулянта. Взятие крови из локтевой вены для получения сыворотки производят одноразовой иглой (диаметр 0,8 — 1,1 мм) в пробирку без антикоагулянта или одноразовым шприцем объемом 5 мл. При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую пробирку;
взятие крови из пальца. Капиллярную кровь берут из пальца в пробирки без антикоагулянта. Перед взятием крови кисть руки пациента согревают горячей водой, затем насухо вытирают. Подушечку пальца протирают 70%-м спиртом и прокалывают стерильным скарификатором одноразового использования. Кровь собирают непосредственно через край стерильной одноразовой центрифужной пробирки. После взятия крови место укола смазывают 5%-м раствором йода. Пробы крови, взятые без антикоагулянта, отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин или помещают в термостат при плюс (37 +/- 1) °C на 15 мин. Затем проводится центрифугирование в течение 10 мин при 3000 об./мин. По окончании центрифугирования сыворотка переносится в стерильные пробирки с использованием для каждого образца отдельного наконечника с аэрозольным барьером.

Транспортирование и хранение биологического материала

9.5. Пробирки с кровью маркируют в соответствии с прилагаемым в сопроводительном документе списком, ставят в штатив, который помещают в полиэтиленовый пакет с гигроскопичным материалом в количестве, достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки. Пакет со штативом помещают в термоизолирующий контейнер (сумка-холодильник) и транспортируют при температуре плюс (4 — 8) °C. При транспортировании и хранении крови в зимнее время года необходимо создать условия, при которых не происходит ее замораживание.

Срок хранения крови — не более 6 ч от момента взятия. Сыворотка крови хранится при комнатной температуре в течение 6 ч, при температуре плюс (4 — 8) °C — в течение 5 суток, более длительно — при температуре не выше минус 16 °C. При хранении сывороток в морозильной камере не допускается их повторное замораживание/размораживание.

Методика постановки ИФА для выявления специфических противодифтерийных антитоксических антител класса G

9.6. Для количественного определения антител класса G к дифтерийному анатоксину применяется ИФА.

Диагностику методом ИФА проводят с использованием наборов реагентов, зарегистрированных и разрешенных для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <25>.

<25> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

Подготовка реагентов и сывороток, проведение реакции и интерпретация результатов проводятся строго в соответствии с инструкцией производителя.

Принцип метода. Поверхность лунок полистиролового планшета для иммунологических реакций покрыта дифтерийным анатоксином. В первой реакционной стадии в лунках инкубируют предварительно разведенные образцы. Имеющиеся в положительных образцах специфичные антитела (IgG) к дифтерийному анатоксину связываются с антигенами на поверхности лунок. Субстанции, не участвующие в реакции, и избыточное количество реагентов удаляются путем многократной промывки. Для выявления связавшихся антител проводят вторую инкубацию, используя меченные ферментом (пероксидаза хрена, реже щелочная фосфатаза) антитела к IgG человека, способные вызвать цветную реакцию. Далее следует вторая отмывка лунок планшета. Затем в них добавляется раствор хромогена, позволяющий выявить степень окрашивания в каждой лунке, которая прямо пропорциональна концентрации антител к дифтерийному анатоксину в образце. Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента. Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре.

Методика постановки РПГА для выявления противодифтерийных антитоксических антител

9.7. РПГА позволяет определить титр антител к дифтерийному анатоксину в сыворотке крови пациента. Диагностику методом РПГА проводят с использованием наборов реагентов, зарегистрированных и разрешенных для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <26>.

<26> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

Принцип метода. РПГА — двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного, который представляет собой эритроциты, сенсибилизированные дифтерийным анатоксином, и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сыворотке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антител против дифтерийного анатоксина образуется специфический комплекс: антитоксические антитела (антитело) плюс сенсибилизированные анатоксином эритроциты барана (антиген). В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

Интерпретация результатов серологических исследований

9.8. Нарастание количества в ИФА или титра в РПГА IgG к дифтерийному анатоксину в пробах, взятых с интервалом не менее 14 дней, может служить дополнительным подтверждением заболевания дифтерийной инфекцией.

Внутрилабораторный контроль качества серологических исследований

9.9. Внутрилабораторный контроль качества является обязательным при выполнении серологических исследований, который проводится в установленном порядке <27>. Внутрилабораторный контроль проводят при каждой постановке испытуемых сывороток.

<27> Приказ Минздрава России от 07.02.2000 № 45 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации»; ГОСТ Р 53133.2 «Контроль качества клинических лабораторных исследований. Часть 2», введенный приказом Ростехрегулирования от 18.12.2008 № 559-ст; отраслевой стандарт ОСТ 91500.13.0001 «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов», утвержденный приказом Минздрава России от 26.05.2003 № 220;

X. Молекулярно-генетическая диагностика

10.1. ПЦР-исследование применяется при обследовании пациентов с профилактической целью, по эпидемиологическим показаниям и параллельно с бактериологическим исследованием — с диагностической целью согласно алгоритму проведения лабораторной диагностики дифтерийной инфекции (приложения 1, 2 к настоящим МУК). ПЦР-исследования проводят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <28>, а также методическими документами <29>. Результаты молекулярно-генетического исследования должны быть получены в течение 24 ч от момента взятия биологического материала.

<28> Главы III, IV, XXXVIII СанПиН 3.3686-21; глава X СанПиН 2.1.3684-21.

<29> Глава X МР 2.1.0246-21; МУ 1.3.2569-09; Р 3.5.1904-04.

Взятие биологического материала для ПЦР-исследования

10.2. Взятие биологического материала для ПЦР-исследования на дифтерию проводят из ротоглотки и носоглотки.

10.2.1. Взятие биологического материала на дифтерию производится 2 стерильными сухими вискозными тампонами. Одним тампоном собирают биоматериал из носоглотки, другим тампоном — из ротоглотки.

10.2.2. Сухие урогенитальные и мини-велюр-тампоны не используются. Рекомендуется использовать тампоны в виде капли, не используются тампоны в виде веретена. Не используются тампоны, приготовленные из косметических ватных палочек. У детей раннего возраста (1 — 2 месяца) допускается взятие материала из носоглотки и ротоглотки с помощью педиатрических велюр-тампонов.

10.2.3. Биологический материал берется отдельными тампонами, натощак или не ранее чем через 2 — 3 ч после еды, до применения полоскания или других видов лечения или процедур. В течение 6 ч перед процедурой не используют медикаменты, орошающие носоглотку или ротоглотку, и препараты для рассасывания во рту. Взятие биологического материала производится с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка и внутренних поверхностей щек и зубов. Первым тампоном собирают материал с участков ротоглотки: миндалин, дужек мягкого неба, небного язычка, при необходимости — с задней стенки глотки. При наличии налетов биологический материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Вторым тампоном собирают биологический материал из носа. Для этого тампон вводят глубоко сначала в один, а потом в другой носовой ход, собирая материал со слизистых стенок и перегородки носа, при этом не касаясь крыльев носа снаружи.

10.2.4. При дифтерии других локализаций (глаза, уши, кожа, раны, гениталии), помимо биологического материала из пораженных участков, обязательно забирается материал из ротоглотки и носоглотки. При взятии биологического материала с конъюнктивы глаза допускается использование офтальмологического тампона. При показаниях к обследованию на дифтерию и одновременном наличии пораженных слизистых и кожи в углу рта обследование этих участков проводится отдельным тампоном и параллельно обязательно берется материал из ротоглотки и носоглотки.

10.2.5. При прямой ларингоскопии биологический материал (слизь) собирается непосредственно из гортани. В случаях оперативного вмешательства следует брать слизь из интубационной трахеотомической трубки, которая забирается сухим тампоном.

10.2.6. При исследовании на дифтерию пораженного участка кожи сначала необходимо протереть его поверхность промокательными движениями стерильной марлевой салфеткой или тампоном, смоченными стерильным физиологическим раствором, осторожно приподнять или отодвинуть струпья и корочки. После этого тампоном, предназначенным для взятия биологического материала на дифтерию, собрать секрет с пораженного участка. Одновременно обязательно забирают биологический материал из ротоглотки и носоглотки.

10.2.7. После взятия материала часть зонда с тампоном помещают в 2 разные пробирки объемом 2 мл с 0,5 мл физиологического раствора или транспортной среды для ПЦР. Рукоятки зондов отламывают движениями вниз-вверх-вниз, придерживая тампоны (зонд из полистирола с вискозным тампоном погружают на глубину 1,0 — 1,2 см, универсальный велюр-тампон — на 3 см до места слома) сверху крышкой пробирки. Пробирки герметично закрывают, маркируют (зев и нос) и помещают в индивидуальный полиэтиленовый пакет.

10.2.8. Допускается хранение биологического материала в течение 3 суток при температуре плюс (2 — 8) °C, более длительно при температуре не выше минус 16 °C.

10.2.9. Пробирка с биологическим материалом проверяется визуально на герметичность и маркируется в соответствии с прилагаемым к направлению списком (п. 5.3).

Транспортирование биологического материала

10.3. При необходимости транспортирования внутри одного здания пробирки с биологическим материалом помещают в штативы и специальные герметичные контейнеры-переноски. Транспортирование производится при комнатной температуре или при температуре плюс (2 — 8) °C.

При необходимости транспортирования биологического материала в другие организации образцы от каждого пациента помещают в индивидуальный герметичный пакет и дополнительно упаковывают в общий герметичный пакет, помещаемый в термоконтейнер с международным знаком «Биологическая опасность». Транспортирование производится в термоконтейнерах, приспособленных для транспортирования биологических материалов, при температуре плюс (2 — 8) °C, соблюдение которой (по возможности) контролируется специальными индикаторами.

Проведение ПЦР-исследования

10.4. Медицинский персонал медицинских организаций проводит исследования в соответствии с инструкциями, правилами безопасности, изложенными в технических паспортах к приборам и в инструкциях к диагностическим наборам реагентов.

10.5. Исследование проводится с применением наборов реагентов, зарегистрированных и разрешенных для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <30>.

<30> Пункт 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.

10.6. Анализ является однонаправленным, и разные его этапы проводятся в отдельных помещениях — зонах. Работа начинается в зоне экстракции нуклеиновых кислот, продолжается в зонах амплификации и детекции. Образцы, оборудование и реактивы не возвращаются в зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса. Все лабораторное оборудование, в т.ч. дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы являются стационарными: их не перемещают из одного помещения в другое. Неиспользованные реактивы, реактивы с истекшим сроком годности, а также использованные реактивы утилизируются <31>.

<31> МУ 1.3.2569-09.

При работе методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени не допускается открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов. При работе методом ПЦР с детекцией методом электрофореза пробирки с продуктами ПЦР открываются в помещении при проведении электрофореза. Персонал и любые предметы из помещения для электрофореза в другие рабочие помещения не перемещаются. При выходе из помещения для электрофореза производится смена рабочей верхней одежды, головных уборов и обуви.

С целью обеззараживания исследуемого материала и отработанных отходов предусматривается наличие автоклавной комнаты, которая может быть общей с другими лабораторными подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности <32>.

<32> Глава IV СанПиН 3.3686-21.

Подготовка биологического материала для ПЦР-исследования

10.7. Непосредственно перед исследованием содержимое закрытых пробирок с мазками требуется тщательно перемешать на вортексе, придерживая крышку пробирки, и центрифугировать в течение 5 сек при 5 тыс. об./мин на микроцентрифуге с целью удаления капель с внутренней поверхности крышки пробирки. Затем следует открыть пробирки и, не извлекая зондов, отобрать необходимое количество образца для исследования.

Порядок проведения ПЦР-исследования

10.8. Порядок проведения ПЦР-исследования и интерпретация результатов анализа осуществляется в соответствии с инструкцией изготовителя используемого набора реагентов.

10.9. Для диагностики дифтерийной инфекции могут применяться варианты ПЦР, различающиеся способом детекции фрагментов амплификации: ПЦР с детекцией методом электрофореза, с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (далее — ПЦР-РВ) или по окончании ПЦР (далее — ПЦР-КТ).

Детекция и анализ результатов различаются в зависимости от варианта ПЦР. Для некоторых вариантов ПЦР, помимо амплификаторов (термоциклеров), требуется дополнительное оборудование для детекции и анализа результатов (например, прибор для детекции флуоресценции при ПЦР-КТ и дополнительное оборудование для разделения ДНК методом электрофореза и визуализации ДНК в агарозном геле).

10.10. С целью упрощения и ускорения анализа результатов можно использовать программное обеспечение, рекомендованное производителем диагностического набора реагентов.

Формулировка заключения

10.11. Результат анализа формулируется в зависимости от типа и специфичности используемой тест-системы.

В случае получения сомнительного результата, требующего повторного сбора и исследования биологического материала, в заключении указывают: «Результат сомнительный, требуется повторить сбор и исследование биологического материала».

10.12. Отчетная документация оформляется на бумажном и электронном носителях в виде отчетов по результатам экспериментов, формируемых программой для анализа результатов ПЦР (видеосистемой при детекции методом электрофореза), которые должны содержать коды и результаты исследования биологических образцов пациента и контрольных образцов. Файлы постановок экспериментов сохраняются на электронном или бумажном носителях в течение 3 лет в соответствии с законодательством Российской Федерации <33>.

<33> Приказ Минздрава России от 31.07.2020 № 785н «Об утверждении требований к организации и проведению внутреннего контроля качества и безопасности медицинской деятельности» (зарегистрировано Минюстом России 02.10.2020, регистрационный № 60192).

Результаты исследования оформляются в соответствии с п. 5.6.

10.13. Результаты ПЦР-исследования учитываются в совокупности с клинико-эпидемиологическими данными на пациента.

10.14. Все положительные образцы биоматериала и ДНК-образцы, где обнаружена ДНК C. diphtheriae/C. ulcerans токсигенных, должны быть в течение 48 ч направлены с сопроводительными документами в Референс-центр для верификации с целью дифференциации с нетоксигенными токснесущими штаммами этих возбудителей.

Контроль качества ПЦР-исследования

10.15. С целью предотвращения появления недостоверных, в т.ч. ложноположительных, результатов необходимо соблюдать требования по организации лаборатории, правила работы персонала с оборудованием и реактивами и требования, указанные в инструкции и методических рекомендациях производителей конкретного набора реагентов. Характеристики диагностических наборов, установленные разработчиком, воспроизводятся при условии соблюдения всех требований и рекомендаций, включая использование оборудования, комплектов реагентов, соблюдение всех этапов и процедур исследования от момента сбора биологического материала до интерпретации результатов.

10.16. При проведении исследования используются положительные и отрицательные контроли для всех этапов анализа. Результаты ПЦР-исследования считаются достоверными, если получены правильные (в соответствии с инструкцией к используемому набору реагентов) результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК.

10.17. С целью обеспечения внутрилабораторного контроля качества ПЦР-исследования периодически (не реже 1 раза в месяц) и незамедлительно при подозрении на загрязнение лаборатории фрагментами амплификации ДНК (появление положительной реакции в отрицательных контрольных образцах ПЦР) требуется проводить контроль контаминации лаборатории продуктами ПЦР путем взятия смывов в установленном порядке.

В случае получения постоянных положительных сигналов в отрицательных контролях все используемые реагенты подлежат замене, незамедлительно проводится обработка лабораторных помещений препаратами, разрушающими ДНК, и облучением в ультрафиолетовом спектре с записью в журнале аварийных ситуаций <34>.

<34> Пункт 8.9 МУ 1.3.2569-09.

Приложение 1 к МУК 4.2.3852-23

АЛГОРИТМ ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ С ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕЛЬЮ

рис. 11

Приложение 2 к МУК 4.2.3852-23

АЛГОРИТМ ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ С ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ ЦЕЛЬЮ И ПО ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАНИЯМ

рис. 12

Приложение 3 к МУК 4.2.3852-23

СХЕМА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ ПРИ ПОСЕВЕ С СУХИХ ТАМПОНОВ

рис. 13

Приложение 4 к МУК 4.2.3852-23

КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОЛОНИЙ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ КОРИНЕБАКТЕРИЙ НА ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ ПЕРВИЧНОГО ПОСЕВА ПРИ ПРОСМОТРЕ В СТЕРЕОСКОПИЧЕСКОМ МИКРОСКОПЕ (УВЕЛИЧЕНИЕ ОБЪЕКТИВА ОТ 2 ДО 8 РАЗ)

Микроорганизм	Сроки роста колоний
Микроорганизм	24 ч	48 ч
1	2	3
	КТА на основе ГРМ-агара
C. diphtheriae биовар gravis	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, начинает формироваться выпуклость центра колонии, легкая изрезанность края, маслянистые, слегка шероховатые, диаметром 1,5 — 2 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, слегка шероховатые, диаметром 2 — 3 мм, имеют радиальную исчерченность (форма «маргаритки») или выраженную краевую изрезанность, часто крошатся при прикосновении
C. diphtheriae биовар mitis и биовар belfanti, subsp. lausannense	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, иногда могут быть плоскими, мягкой, маслянистой консистенции, с ровным краем, слегка шероховатые, диаметром 1 — 1,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, приподнятые, но могут остаться плоскими, слегка шероховатые, мягкой, маслянистой консистенции или могут крошиться при прикосновении, с ровным краем, диаметром 1,5 — 2 мм
C. diphtheriae биовар intermedius	Колонии имеют серо-черную окраску, мелкие, плоские, мягкой, маслянистой консистенции, диаметром 0,3 — 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, мягкой, маслянистой консистенции, диаметром 0,5 — 1,0 мм
C. ulcerans	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, с ровным краем, маслянистые, диаметром 0,3 — 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, выпуклые или приподнятые с выпуклым центром, мягкой, маслянистой консистенции, может быть легкая изрезанность края, диаметром 1 — 2 мм
C. pseudotuberculosis	Колонии имеют серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, с ровным краем, маслянистые, диаметром 0,3 — 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, с ровным краем, маслянистые, диаметром 0,8 — 1,0 мм
	КТА на основе Питательной среды № 1 ГРМ
C. diphtheriae биовар gravis	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, начинает формироваться выпуклость центра колонии, легкая изрезанность края, маслянистые, слегка шероховатые, слегка крошатся при прикосновении, диаметром 1,5 — 2,0 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, слегка шероховатые, диаметром 2 — 3 мм, имеют радиальную исчерченность (форма «маргаритки») или выраженную краевую изрезанность, часто крошатся при прикосновении
C. diphtheriae биовар mitis и биовар belfanti, subsp. lausannense	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, иногда могут быть плоскими, мягкой, маслянистой консистенции, с ровным краем, слегка шероховатые, диаметром 1,0 — 1,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, приподнятые, но могут остаться плоскими, слегка шероховатые, мягкой, маслянистой консистенции или могут крошиться при прикосновении, с ровным краем, диаметром 1,5 — 2,0 мм
C. diphtheriae биовар intermedius	Колонии имеют темно-серую окраску, мелкие, плоские, мягкой, маслянистой консистенции, диаметром 0,3 — 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, мягкой, маслянистой консистенции, диаметром 0,5 — 1,0 мм
C. ulcerans	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, слегка выпуклые, с ровным краем, маслянистые, диаметром 0,5 — 0,7 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, выпуклые или приподнятые с выпуклым центром, мягкой, маслянистой консистенции, с ровным краем, диаметром 1 — 2 мм
C. pseudotuberculosis	Колонии имеют серую окраску, округлые, непрозрачные, с ровным краем, маслянистые, диаметром 0,5 — 0,7 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, с ровным краем, маслянистые, диаметром 0,8 — 1,0 мм
	КТА на основе СПА
C. diphtheriae биовар gravis	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, начинает формироваться выпуклость центра колонии, легкая изрезанность края, маслянистые, слегка шероховатые, слегка крошатся при прикосновении, диаметром 1,5 — 2,0 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, шероховатые, диаметром 2 — 4 мм, имеют радиальную исчерченность (форма «маргаритки») или выраженную краевую изрезанность, часто крошатся при прикосновении
C. diphtheriae биовар mitis и биовар belfanti, subsp. lausannense	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, маслянистой консистенции, с ровным краем, слегка шероховатые, диаметром 1 — 1,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, приподнятые, но могут остаться плоскими, слегка шероховатые, мягкой, маслянистой консистенции или могут крошиться при прикосновении, с ровным краем, диаметром 2 — 3 мм
C. diphtheriae биовар intermedius	Колонии имеют темно-серую окраску, мелкие, плоские, мягкой консистенции, диаметром 0,3 — 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, мягкой, маслянистой консистенции, диаметром 0,8 — 1,0 мм
C. ulcerans	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, слегка выпуклые, с ровным краем, блестящие, маслянистые, диаметром 0,5 — 0,8 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, выпуклые или приподнятые с выпуклым центром, мягкой, маслянистой консистенции, с ровным краем, диаметром 1 — 2 мм
C. pseudotuberculosis	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, с ровным краем, маслянистые, диаметром 0,5 — 0,8 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, с ровным краем, маслянистые, диаметром 0,8 — 1,0 мм
	Среда Клауберга II
C. diphtheriae биовар gravis	Колонии имеют темно-серую или черную окраску, округлые, непрозрачные с блестящей поверхностью, слегка приподнятые, начинает формироваться выпуклость центра колонии, легкая изрезанность края, иногда может просматриваться светлая периферия, маслянистые, иногда крошатся при прикосновении или имеют водянистую консистенцию, чаще мелкие, диаметром до 0,5 — 1,0 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, шероховатые, иногда наблюдаются «гигантские» плоские колонии, диаметр колоний увеличивается в 2 — 3 раза и через 48 ч может доходить до 2 — 4 мм, имеют радиальную исчерченность (форма «маргаритки») или выраженную краевую изрезанность, может просматриваться тонкая светлая периферия, крошатся при прикосновении, часто расположены группами по несколько сливающихся колоний в виде «гусеницы»
C. diphtheriae биовар mitis и биовар belfanti, subsp. lausannense	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, маслянистой консистенции, с ровным краем, слегка шероховатые, диаметром 1 — 1,5 мм	Колонии имеют серо-черную или черную окраску («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, приподнятые, но могут остаться плоскими, слегка шероховатые, мягкой, маслянистой консистенции или могут крошиться при прикосновении, с ровным краем, диаметром 2 — 3 мм
C. diphtheriae биовар intermedius	Колонии имеют темно-серую окраску, мелкие, плоские, мягкой консистенции, диаметром 0,3 — 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, мягкой, маслянистой консистенции, диаметром 0,8 — 1,0 мм
C. ulcerans	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, слегка выпуклые, с ровным краем, блестящие, маслянистые, иногда может просматриваться светлая периферия, диаметром 0,4 — 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску или черную окраску, с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, выпуклые или приподнятые с выпуклым центром, мягкой, маслянистой консистенции, с ровным краем, иногда может просматриваться светлая периферия, диаметром 1 — 2 мм
C. pseudotuberculosis	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, с ровным краем, блестящие, диаметром 0,5 — 0,8 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, с ровным краем, шероховатые, могут крошиться при прикосновении, диаметром 0,8 — 1,0 мм
	Коринебакагар (КБА)
C. diphtheriae биовар gravis	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, несколько уплощены со слегка неровными краями, слегка шероховатые, диаметром не менее 0,6 мм	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, шероховатые, со складчатой поверхностью и неровными (изрезанными) краями (форма «маргаритки»), диаметром 2 — 3,5 мм
C. diphtheriae биовар mitis и биовар belfanti, subsp. lausannense	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, блестящие, с ровным краем, диаметром не менее 0,5 мм	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, гладкие, блестящие, с ровным краем, диаметром 1,5 — 3 мм
C. diphtheriae биовар intermedius	Колонии имеют темно-серую окраску, мелкие, плоские, диаметром 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, мягкой, маслянистой консистенции, диаметром 0,5 — 1,0 мм
C. ulcerans	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, с ровным краем, с серебристым ободком по краю, блестящие, диаметром не менее 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, блестящие, с ровным краем, диаметром 0,5 — 1,5 мм
C. pseudotuberculosis	Колонии имеют серую окраску, округлые, непрозрачные, с ровным краем, диаметром не менее 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, с ровным краем, шероховатые, диаметром 0,7 — 1,0 мм
	КТА на основе агара Хойла (Hoyle Medium Agar)
C. diphtheriae биовар gravis	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, слегка шероховатые, имеют легкую изрезанность края, маслянистой консистенции, могут крошиться при прикосновении, диаметром 0,8 — 1 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, шероховатые, диаметром 2 — 4 мм, имеют радиальную исчерченность (форма «маргаритки») или выраженную краевую изрезанность, часто крошатся при прикосновении
C. diphtheriae биовар mitis и биовар belfanti, subsp. lausannense	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, слегка выпуклые, слегка шероховатые, с ровным краем, маслянистой консистенции, диаметром 0,7 — 1 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, шероховатые, диаметром 2 — 3 мм, с ровными краями, часто крошатся при прикосновении
C. diphtheriae биовар intermedius	Колонии имеют серую окраску, мелкие, округлые, полупрозрачные, блестящие, диаметром 0,5 — 0,8 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, шероховатые, с ровным краем, маслянистой консистенции, диаметром 0,8 — 1,2 мм
C. ulcerans	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, с ровным краем, блестящие, маслянистой консистенции, диаметром 0,3 — 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, слегка шероховатые, с неровной поверхностью, с ровным краем, диаметром 1,0 — 1,5 мм
C. pseudotuberculosis	Колонии имеют серую окраску, округлые, приподнятые, непрозрачные, с ровным краем, слегка шероховатые, диаметром 0,3 — 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, с ровным краем, шероховатые, могут крошиться при прикосновении, диаметром 0,8 — 1,2 мм
	КТА на основе Колумбийского агара (Columbia agar base)
C. diphtheriae биовар gravis	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, слегка шероховатые, имеют легкую изрезанность края, могут крошиться при прикосновении, диаметром 1,0 — 1,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, приподнятые с выпуклым центром, шероховатые, диаметром 2,0 — 2,5 мм, имеют радиальную исчерченность (форма «маргаритки»), часто крошатся при прикосновении
C. diphtheriae биовар mitis и биовар belfanti, subsp. lausannense	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, слегка шероховатые, с ровным краем, маслянистой консистенции, диаметром 0,7 — 1,0 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, приподнятые с выпуклым центром, шероховатые, с ровными краями, диаметром 1,5 — 2,0 мм, часто крошатся при прикосновении
C. diphtheriae биовар intermedius	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, слегка приподнятые, блестящие, маслянистой консистенции, диаметром 0,3 — 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, шероховатые, с ровным краем, маслянистой консистенции, диаметром 0,8 — 1,0 мм
C. ulcerans	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, слегка выпуклые, с ровным краем, блестящие, маслянистой консистенции, диаметром 0,5 — 0,8 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, блестящие, но могут быть слегка шероховатыми, с неровной поверхностью, ровными краями, маслянистой консистенции, диаметром 1,0 — 1,5 мм
C. pseudotuberculosis	Колонии имеют серую окраску, округлые, слегка приподнятые, полупрозрачные, с ровным краем, блестящие, диаметром 0,5 — 0,7 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, с ровным краем, блестящие, но могут быть слегка шероховатыми, могут крошиться при прикосновении, диаметром 1,0 — 1,2 мм
	КТА на основе Кровяного агара (Blood agar base)
C. diphtheriae биовар gravis	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, слегка шероховатые, имеют легкую изрезанность края, маслянистой консистенции, могут крошиться при прикосновении, диаметром 0,8 — 1,0 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, приподнятые с выпуклым центром, слегка шероховатые, с легкой изрезанностью края, могут иметь легкую радиальную исчерченность, диаметром 1,8 — 2,0 мм, часто крошатся при прикосновении
C. diphtheriae биовар mitis и биовар belfanti, subsp. lausannense	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, слегка шероховатые, с ровным краем, маслянистой консистенции, диаметром 0,7 — 0,8 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, приподнятые с выпуклым центром, шероховатые, с легкой изрезанностью края, диаметром 1,8 — 2,1 мм, часто крошатся при прикосновении
C. diphtheriae биовар intermedius	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, слегка приподнятые, блестящие, маслянистой консистенции, диаметром 0,3 — 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, слегка шероховатые, с ровным краем, маслянистой консистенции, диаметром 0,8 — 1,0 мм
C. ulcerans	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, слегка выпуклые, с ровным краем, блестящие, маслянистой консистенции, диаметром 0,5 — 0,8 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, слегка шероховатыми, с неровной поверхностью, маслянистой консистенции, диаметром 1,0 — 1,3 мм
C. pseudotuberculosis	Колонии имеют серую окраску, округлые, слегка приподнятые, непрозрачные, с ровным краем, блестящие, диаметром 0,3 — 0,5 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, с легкой краевой изрезанностью, слегка шероховатые, диаметром 1,2 — 1,7 мм
	КТА на основе среды АГВ
C. diphtheriae биовар gravis	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, слегка шероховатые, имеют легкую изрезанность края, маслянистой консистенции, могут крошиться при прикосновении, диаметром 1,0 — 1,2 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, приподнятые, шероховатые, с изрезанным краем, могут иметь легкую радиальную исчерченность, диаметром 1,7 — 1,8 мм, часто крошатся при прикосновении
C. diphtheriae биовар mitis и биовар belfanti, subsp. lausannense	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, слегка шероховатые, с ровным краем, маслянистой консистенции, слегка крошатся при прикосновении, диаметром 0,8 — 0,9 мм	Колонии имеют серо-черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), округлые, непрозрачные, приподнятые, шероховатые, с ровным краем, диаметром 1,7 — 1,8 мм, часто крошатся при прикосновении
C. diphtheriae биовар intermedius	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, блестящие, маслянистой консистенции, диаметром 0,5 — 0,7 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, приподнятые, слегка шероховатые, с ровным краем, маслянистой консистенции, диаметром 0,8 — 1,0 мм
C. ulcerans	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, с ровным краем, блестящие, маслянистой консистенции, диаметром 0,5 — 0,8 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, слегка шероховатыми, с ровным краем, маслянистой консистенции, диаметром 1,1 — 1,2 мм
C. pseudotuberculosis	Колонии имеют темно-серую окраску, округлые, выпуклые, непрозрачные, с ровным краем, блестящие, маслянистой консистенции, диаметром 0,5 — 0,7 мм	Колонии имеют серо-черную окраску, округлые, непрозрачные, выпуклые, с ровным краем, шероховатые, диаметром 0,8 — 1,0 мм

Приложение 5 к МУК 4.2.3852-23

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА <35>

<35> Примечание: допускается использование средств измерений, вспомогательного оборудования и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками; допускается использование реагентов, реактивов, расходных материалов и питательных сред, в т.ч. готовых, флюорогенных и хромогенных, диагностических препаратов и тест-систем с аналогичными характеристиками, зарегистрированных и разрешенных к применению в установленном порядке.

Таблица 1

Средства измерений

Наименование средств измерения	Наименование документов
Весы лабораторные	ГОСТ 24104
pH-метр	ГОСТ Р 8.857
Калиброванные дозаторы и многоканальные дозаторы (диапазоны объемов 5 — 50, 50 — 200 и 200 — 1000 мкл) и одноразовые сменные наконечники	ГОСТ 28311
Мерные цилиндры объемом 50 мл и 1 л	ГОСТ 1770
Отраслевой стандартный образец мутности 10Е	-

Таблица 2

Вспомогательные устройства и материалы

Наименование аппаратуры и материалов	Наименование документов
Бокс микробиологической безопасности II класса	-
Шкаф вытяжной химический	-
Термостат, поддерживающий температуру плюс (37 +/- 1) °C	-
Холодильник фармацевтический, поддерживающий температуру плюс (2 — 8) °C	-
Морозильник фармацевтический, поддерживающий температуру минус (18 — 35) °C	-
Микроскоп стереоскопический	-
Микроскоп биологический с иммерсионной системой	ГОСТ 28489
Водяная баня лабораторная	-
Флаконы стеклянные	ГОСТ 34038
Чашки Петри стеклянные	ГОСТ 25336
Чашки Петри пластиковые	-
Петля микробиологическая многоразовая нихромовая, диаметр кольца 1 — 3 мм	-
Петля микробиологическая 1, 10 мкл одноразовая из полимерных материалов	-
Фильтровальная бумага	ГОСТ 12026
Пипетки градуированные стеклянные	ГОСТ 29227
Пинцет медицинский	ГОСТ 21241
Пробирки бактериологические	ГОСТ 25336
Штативы для пробирок	-
Шпатели Дригальского	-
Предметные стекла для микропрепаратов, предназначенных для микроскопирования в видимой области спектра ГОСТ 9285
Стерильный зонд-тампон ватный в индивидуальной упаковке, стерильный зонд для взятия мазков из ротоглотки и носа у детей и взрослых	-
	Таблица 3

Питательные среды и реактивы

Наименование питательных сред и реактивов	Наименование документов
Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар)	-
Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (СПА)	-
Питательная среда для выделения коринебактерий (Коринебакагар)	-
Питательная среда для определения токсигенности дифтерийных микробов сухая (Коринетоксагар)	-
Питательная среда для определения токсигенности дифтерийных микробов сухая (среда ОТДМ)	-
Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-бульон)	-
Питательная среда для идентификации коринебактерий по тесту расщепления цистина сухая (среда Пизу)	-
Питательная среда для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам сухая (среда АГВ)	-
Питательная среда для количественного определения микробной загрязненности (питательная среда № 1 ГРМ)	-
Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей	ГОСТ 13805
Питательная среда для определения восстановления нитратов в нитриты (питательная среда № 7 ГРМ)	-
Транспортная система с жидкой средой Эймса	-
Колумбийский агар или основа Колумбийского агара	-
Основа среды Хойла (для коринебактерий дифтерии)	-
Бульон с сердечно-мозговой вытяжкой	-
Бульон мясо-пептонный	ГОСТ 20730
Набор реагентов «ДС-ДИФ-КОРИНЕ»: тест-система биохимическая для дифференциации микроорганизмов рода коринебактерий, в т.ч. возбудителя дифтерии, и определения его токсигенных свойств.	-
Набор реагентов СИБ № 5: система индикаторная бумажная для идентификации коринебактерий дифтерии	-
Кровь крупного рогатого скота для питательных сред дефибринированная	-
Кровь баранья дефибринированная для питательных сред стерильная	-
Сыворотка крови крупного рогатого скота жидкая, стерильная, без консервантов	-
Сыворотка крови новорожденных телят, стерильная, без консервантов	-
Сыворотка противодифтерийная лошадиная очищенная концентрированная	-
Комплект реагентов для окраски микроорганизмов по методу Грама	-
Мочевина (Карбамид)	ГОСТ 6691
Крезоловый красный, индикатор (О-крезолсульфофталеин)	ТУ 6-09-5207
Кислота соляная	ГОСТ 3118
Кислота уксусная	ГОСТ 61
Калий азотнокислый	ГОСТ 4217
Калий гидроокись	ГОСТ 24363
Калия теллурит, раствор 2%-й	-
Калия фосфорно-кислый однозамещенный	ГОСТ 4198
Калий фосфорно-кислый двузамещенный	ГОСТ 2493
Натрия гидроокись	ГОСТ 4328
Натрий серноватистокислый (натрия тиосульфат) 5-водный	ГОСТ 27068
Натрий уксуснокислый плавленый (натрий ацетат)	ТУ 6-09-246
Реактив Грисса	ТУ 6-09-3569
Натрий хлористый	ГОСТ 4233
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный	ГОСТ 4172
Феноловый красный, индикатор (фенолсульфофталеин)	ТУ 6-09-5170
Аммоний фосфорнокислый однозамещенный	ГОСТ 3771
D-глюкоза	ГОСТ 6038
Сахароза	ГОСТ 5833
Крахмал растворимый	ГОСТ 10163
L-Цистин	ТУ 6-09-3252
Фуксин кислый	ТУ 6-09-3803
Йодистый калий	ГОСТ 4232
Кристаллический фиолетовый	ТУ 6-09-4119
Йод	ГОСТ 4159
Кислота уксусная	ГОСТ 61
Хризоидин	ТУ 6-09-716
Гидрокарбонат натрия	ГОСТ 2156
Карболовая кислота	-
Генциановый синий	-
Свинец (II) уксуснокислый 3-водный	ГОСТ 1027
Везувин	-
Сульфаниловая кислота	ГОСТ 5821
Альфа-Нафтиламин	ТУ 6-09-07-1703
Риванол, 0,1%-ный раствор	-
Альфа-Д-Лактоза	ТУ 6-09-2293
Раствор Люголя	-
Антитоксин диагностический дифтерийный очищенный ферментолизом и специфической сорбцией сухой	-
Бумажные диски с антитоксином дифтерийным	-
Глицерин	ГОСТ 6824
Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья	ГОСТ 5962
Масло иммерсионное для микроскопии	ГОСТ 13739
Вода дистиллированная	ГОСТ Р 58144

Приложение 6 к МУК 4.2.3852-23

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ <36>

<36> Примечание: допускается использование средств измерений, вспомогательного оборудования и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками; допускается использование реагентов, реактивов, расходных материалов, диагностических препаратов и тест-систем с аналогичными характеристиками, зарегистрированных и разрешенных к применению в установленном порядке.

Таблица 1

Средства измерений

Наименование средств измерения	Наименование документов
Цилиндры мерные 1 класса точности вместимостью 50 и 1000 см3	ГОСТ 1770
Механические или электронные одноканальные или многоканальные дозаторы переменного объема 5 — 50, 50 — 200 и 200 — 1000 мкл	ГОСТ 28311
Автоматический планшетный дозатор (по возможности)	-
Фотометр микропланшетный с фильтрами 450 нм и 620 — 650 нм	-

Таблица 2

Вспомогательные устройства и материалы

Наименование аппаратуры и материалов	Наименование документов
Холодильник фармацевтический, поддерживающий температуру плюс (2 — 8) °C	-
Морозильник фармацевтический, поддерживающий температуру минус (18 — 35) °C	-
Термостат, поддерживающий температуру плюс (36 +/- 1) °C	-
Термостат или водяная баня, поддерживающие температуру плюс (56 +/- 1) °C	-
Автоматический промыватель планшетов (по возможности)	-
Шейкер медицинский термостатируемый, поддерживающий температуру плюс (36 +/- 1) °C	-
Флаконы стеклянные	ГОСТ 34038
Пипетки градуированные стеклянные	ГОСТ 29227
Пробирки центрифужные	ГОСТ 25336
Штативы для пробирок	-
Планшет полимерный для иммунологических реакций однократного применения	-
Плашки для разведения образцов сыворотки	-
Бутыль для промывочного буфера	-
Кюветы для промывочного буфера, конъюгата, субстрата, стоп-раствора	-
Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и 1000 мкл	-
Бумага фильтровальная лабораторная	ГОСТ 12026

Таблица 3

Реактивы и диагностические препараты

Наименование реактивов и диагностических препаратов	Наименование документов
Набор реагентов для определения антител IgG к дифтерийному токсину	-
Диагностикум эритроцитарный дифтерийный антигенный жидкий (ДЭД)	-
Набор реагентов для выявления и полуколичественного определения дифтерийного антитоксина в реакции пассивной гемагглютинации «Диагностикум дифтерийный — РПГА»	-
Вода дистиллированная	ГОСТ Р 58144
0,9%-й раствор натрия хлорида (pH 7,0 +/- 0,2)	ГОСТ 4233

Приложение 7 к МУК 4.2.3852-23

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА ПЦР <37>

<37> Примечание: допускается использование средств измерений, вспомогательного оборудования и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками; допускается использование реагентов, реактивов, расходных материалов, диагностических препаратов и тест-систем с аналогичными характеристиками, зарегистрированных и разрешенных к применению в установленном порядке.

Таблица 1

Средства измерений

Наименование средств измерения	Наименование документов
Автоматические или электронные калиброванные дозаторы и многоканальные дозаторы (диапазоны объемов 5 — 50, 50 — 200 и 200 — 1000 мкл) и одноразовые сменные наконечники	ГОСТ 28311
Мерный цилиндр на 100 мл и на 1 л	ГОСТ 1770
Колба коническая из термостойкого стекла на 250 мл для плавления агарозы	ГОСТ 21400

Таблица 2

Вспомогательные устройства и материалы

Наименование аппаратуры и материалов	Наименование документов
Взятие биологического материала
Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки типа «Эппендорф» объемом 2,0 мл	-
Зонд из полистирола с вискозным тампоном в индивидуальной упаковке, стерильный	-
Универсальный велюр-тампон на пластиковом аппликаторе с нейлоновым наконечником и расстоянием до места слома 3 см в индивидуальной упаковке, стерильный	-
Ламинарный бокс, класс биологической безопасности II тип A	-
Экстракция ДНК
Твердотельный термостат для пробирок типа «Эппендорф» от плюс (25 — 100) °C	-
Настольная центрифуга для микропробирок типа «Эппендорф» объемом 1,5 — 2 мл до 16 тыс. об./мин	-
Микроцентрифуга/вортекс	-
Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости	-
В случае использования автоматизированной экстракции ДНК: автоматическая станция для выделения ДНК/РНК, зарегистрированная и разрешенная для применения в Российской Федерации в установленном порядке	-
Холодильник с камерами, поддерживающими температуру плюс (2 — 8) °C и не выше минус 16 °C (для хранения наборов, предназначенных для выделения нуклеиновых кислот). Возможно отдельное использование холодильника с камерой, поддерживающей температуру плюс (2 — 8) °C, и морозильника с камерой, поддерживающей температуру не выше минус 16 °C	-
Холодильник с камерой, поддерживающей температуру плюс (2 — 8) °C (для хранения препаратов нуклеиновых кислот — с морозильной камерой не выше минус 20 °C). Не допускается хранение препаратов нуклеиновых кислот в одном холодильнике с компонентами набора для выделения нуклеиновых кислот	-
Штативы для микропробирок объемом 1,5 мл и наконечников	-
Одноразовые полипропиленовые плотно закрывающиеся микропробирки типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл	-
Наконечники	-
Емкость для дезинфицирующего раствора	-
Емкость для 70%-го спирта этилового	-
ПЦР с детекцией флуоресценции в режиме реального времени или по конечной точке
Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс)	-
Приборы, рекомендованные в инструкциях и методических рекомендациях по применению используемых в лаборатории наборов реагентов для выявления ДНК возбудителей коклюша и заболеваний, обусловленных другими бордетеллами, методом ПЦР или ПЦР-РВ с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, или приборы, обеспечивающие аналогичные параметры проведения ПЦР и регистрации продуктов амплификации	-
Флуориметр (флуоресцентный детектор) — только при использовании учета продуктов амплификации с гибридизационно-флуоресцентным методом детекции по конечной точке	-
Микроцентрифуга/вортекс	-
Штативы для пробирок объемом 0,2 мл или 0,1 мл	-
Штативы для наконечников	-
Наконечники, пробирки типа «Эппендорф»	-
Холодильник плюс (2 — 8) °C с морозильной камерой не выше минус 16 °C для хранения выделенных проб ДНК	-
Емкость для сброса отработанных расходных материалов	-
С целью автоматизации процедуры приготовления реакционных смесей для амплификации допускается использование автоматизированного оборудования для раскапывания реагентов	-
ПЦР с детекцией методом электрофореза в агарозном геле
Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс)	-
Программируемый амплификатор (термоциклер), рекомендованный в инструкциях и методических рекомендациях по применению используемого набора реагентов для ПЦР с детекцией методом электрофореза	-
Микроцентрифуга/вортекс	-
Холодильник плюс (2 — 8) °C с морозильной камерой не выше минус 16 °C	-
Холодильник с камерой, поддерживающей температуру плюс (2 — 8) °C (для хранения наборов электрофоретической детекции)	-
Камера для горизонтального электрофореза объемом не более 400 мл	-
Источник постоянного тока с напряжением 150 — 460 В	-
Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей	-
Видеосистема с цифровой камерой для регистрации результатов и передачи изображения	-
Компьютер (должен быть связан через компьютерную сеть с компьютером, располагающимся в чистой зоне и предназначенным для анализа результатов электрофореза)	-
Аквадистиллятор	-
Микроволновая печь или другой нагревательный прибор для плавления агарозы	-
Столик и набор гребенок для приготовления геля	-
Штативы для наконечников и пробирок на 0,5 (0,2) мл	-
Наконечники, пробирки типа «Эппендорф»	-
Емкость для сброса отработанных расходных материалов в дезинфицирующий раствор	-
Пластиковая емкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия	-

Таблица 3

Реактивы и диагностические препараты

Наименование реактивов и диагностических препаратов	Наименование документов
0,9%-й раствор натрия хлорида (pH 7,0 +/- 0,2)	ГОСТ 4233
Транспортная среда для хранения и транспортировки респираторных мазков в аликвотах по 0,5 — 1,0 мл в стерильных пробирках объемом 1,5 — 2,0 мл	-
Набор реагентов для выделения нуклеиновых кислот из биологического материала	-
Набор реагентов для диагностики in vitro \text{АмплиСенс}^{®} Corynebacterium diphtheriae/tox-gen-FL	-
Набор реагентов для выявления ДНК Corynebacterium diphtheriae с дифференциацией токсигенных и нетоксигенных штаммов методом ПЦР в режиме реального времени (C. diphtheriae Tox)	-

Нормативные и методические документы

1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2. Федеральный закон от 21.11.2011 № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации».

3. Постановление Правительства Российской Федерации от 25.01.2022 № 46 «О лицензировании деятельности в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (за исключением случая, если указанная деятельность осуществляется в медицинских целях) и генно-инженерно-модифицированных организмов III и IV степеней потенциальной опасности, осуществляемой в замкнутых системах».

4. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий».

5. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

6. СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий».

7. Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации».

8. Приказ Минздрава России от 07.02.2000 № 45 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации».

9. Приказ Минздрава России от 26.05.2003 № 220 «Об утверждении отраслевого стандарта „Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов“.»

10. Приказ Минздрава России от 08.10.2015 № 707н «Об утверждении Квалификационных требований к медицинским и фармацевтическим работникам с высшим образованием по направлению подготовки „Здравоохранение и медицинские науки“.»

11. Приказ Минздрава России от 10.02.2016 № 83н «Об утверждении Квалификационных требований к медицинским и фармацевтическим работникам со средним медицинским и фармацевтическим образованием».

12. Приказ Минздрава России от 31.07.2020 № 785н «Об утверждении Требований к организации и проведению внутреннего контроля качества и безопасности медицинской деятельности».

13. Приказ Минздрава России от 18.05.2021 № 464н «Об утверждении Правил проведения лабораторных исследований».

14. Р 3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях».

15. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности».

16. МР 2.1.0246-21 «Методические рекомендации по обеспечению санитарно-эпидемиологических требований к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий».

17. Методические рекомендации по применению модифицированной среды Пизу и индикаторных бумажных дисков для идентификации, биохимического типирования и определения токсигенности дифтерийных микробов, утвержденные начальником Главного эпидемиологического управления Минздрава СССР № 28-6/31.

18. ГОСТ 61 «Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия».

19. ГОСТ 1027 «Реактивы. Свинец (II) уксуснокислый 3-водный. Технические условия».

20. ГОСТ 1770 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».

21. ГОСТ 2156 «Натрий двууглекислый. Технические условия».

22. ГОСТ 2493 «Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия».

23. ГОСТ 3118 «Реактивы. Кислота соляная».

24. ГОСТ 3771 «Реактивы. Аммоний фосфорно-кислый однозамещенный».

25. ГОСТ 4159 «Реактивы. Йод».

26. ГОСТ 4172 «Реактивы. Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12-водный».

27. ГОСТ 4198 «Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный».

28. ГОСТ 4217 «Реактивы. Калий азотнокислый».

29. ГОСТ 4232 «Реактивы. Калий йодистый».

30. ГОСТ 4233 «Реактивы. Натрий хлористый».

31. ГОСТ 4328 «Реактивы. Натрия гидроокись».

32. ГОСТ 5821 «Реактивы. Кислота сульфаниловая».

33. ГОСТ 5833 «Реактивы. Сахароза».

34. ГОСТ 5962 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья».

35. ГОСТ 6038 «Реактивы. D-глюкоза».

36. ГОСТ 6691 «Реактивы. Карбамид».

37. ГОСТ 6824 «Глицерин дистиллированный».

38. ГОСТ 9284 «Стекла предметные для микропрепаратов».

39. ГОСТ 10163 «Реактивы. Крахмал растворимый».

40. ГОСТ 12026 «Бумага фильтровальная лабораторная».

41. ГОСТ 13739 «Масло иммерсионное для микроскопии».

42. ГОСТ 13805 «Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей».

43. ГОСТ 20730 «Питательные среды. Бульон мясо-пептонный (для ветеринарных целей)».

44. ГОСТ 21241 «Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний».

45. ГОСТ 21400 «Стекло химико-лабораторное».

46. ГОСТ 24104 «Весы лабораторные».

47. ГОСТ 24363 «Реактивы. Калия гидроокись».

48. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные».

49. ГОСТ 27068 «Реактивы. Натрий серноватистокислый (Натрия тиосульфат) 5-водный».

50. ГОСТ 28311 «Дозаторы медицинские лабораторные».

51. ГОСТ 28489 «Микроскопы световые».

52. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1».

53. ГОСТ 34038 «Упаковка стеклянная. Флаконы. Допускаемые отклонения от номинальных размеров».

54. ГОСТ 12.1.019 «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».

55. ГОСТ Р 58144 «Вода дистиллированная. Технические условия».

56. ГОСТ Р 8.857 «pH-метры. Методика поверки».

57. ГОСТ Р 53133.2 «Контроль качества клинических лабораторных исследований. Часть 2».

58. ОСТ 91500.13.0001 «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов».

59. ТУ 6-09-246 «Натрий уксуснокислый плавленый (натрий ацетат)».

60. ТУ 6-09-716 «Хризоидин, индикатор (1,3-ДИАМИНО-4-(фенилазо)бензол, гидрохлорид)».

61. ТУ 6-09-2293 «Альфа-Д-Лактоза, 1-водная (4-О-Бета-Д-галактопиранозил-Альфа-Д-глюкопираноза)».

62. ТУ 6-09-3252 «Цистин-L квалификации чистый».

63. ТУ 6-09-3569 «Реактив Грисса чистый для анализа».

64. ТУ 6-09-3803 «Фуксин кислый (рубин с (S), фуксин с (S)) чистый».

65. ТУ 6-09-4119 «Кристаллический фиолетовый (N,N,N',N',N»,N»-гексаметилпарарозанилин хлористый) квалификации чистый для анализа».

66. ТУ 6-09-5170 «Феноловый красный, индикатор (фенолсульфофталеин) чистый для анализа».

67. ТУ 6-09-5207 «Крезоловый красный, индикатор (О-крезолсульфофталеин) чистый для анализа».

68. ТУ 6-09-07-1703 «1-Нафтиламин (1-Аминонафталин; альфа-Нафтиламин) чистый для анализа, чистый».

Библиографические ссылки

1. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней: в 2 т. / Н.И. Брико, Г.Г. Онищенко, В.И. Покровский. М.: МИА, 2019. Т. 1. С. 324 — 354.

2. Лабинская, А.С. Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций: учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования врачей / А.С. Лабинская, Н.Н. Костюкова, С.М. Иванова. М.: Бином, 2010. С. 175 — 196.

3. Харсеева, Г.Г. Дифтерия: микробиологические и иммунологические аспекты / Г.Г. Харсеева, Э.Л. Алутина, Т.Д. Гасретова [и др.]. М.: Практическая медицина, 2014. 241 с.

4. Алексеева, Е.А. Современные подходы к комплексным лабораторным исследованиям на дифтерию / Е.А. Алексеева, Г.Я. Ценева, Л.А. Липатова [и др.] // Инфекция и иммунитет. 2012. Т. 2. № 4. С. 729 — 734.

5. Борисова, О.Ю. Изучение молекулярных механизмов резистентности штаммов Corynebacterium diphtheriae к рифампицину / О.Ю. Борисова, И.А. Чагина, В.А. Алешкин // Молекулярная медицина. 2017. Т. 15. № 4. С. 43 — 49.

6. Борисова, О.Ю. Характеристика генотипа и фенотипа нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae subsp. lausannense, выделенных на территории России / О.Ю. Борисова, А.В. Чаплин, Н.Т. Гадуа [и др.] // Вестник РГМУ. 2020. № 2. С. 26 — 32.

7. Борисова, О.Ю. Состояние и проблемы бактериологической диагностики дифтерийной инфекции в Российской Федерации / О.Ю. Борисова, Н.Т. Гадуа, А.С. Пименова [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. 2020. Т. 65. № 11. С. 717 — 723.

8. Борисова, О.Ю. Характеристика токсигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных на территории России / О.Ю. Борисова, Н.Т. Гадуа, А.С. Пименова [и др.] // Инфекция и иммунитет. 2021. Т. 11. № 4. С. 683 — 691.

9. Борисова, О.Ю. Возможности практического применения разных питательных сред для первичного посева при лабораторной диагностике дифтерии / О.Ю. Борисова, Н.Т. Гадуа, А.С. Пименова [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. 2021. Т. 66. № 7. С. 428 — 437.

10. Борисова, О.Ю. Внешний контроль качества проведения бактериологического исследования при выделении Corynebacterium diphtheriae / О.Ю. Борисова, Н.Т. Гадуа, А.С. Пименова [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. 2021. Т. 66. № 8. С. 509 — 512.

11. Гадуа, Н.Т. Эффективность использования жидких транспортных сред в бактериологической диагностике дифтерийной инфекции / Н.Т. Гадуа, А.С. Пименова, О.Ю. Борисова [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. 2022. Т. 67. № 6. С. 350 — 354.

12. Жебрун, А.Б. Бактериологическая безопасность при дифтерии: от классических методов к современным миниатюрным устройствам специального микробиологического контроля / А.Б. Жебрун, Г.Я. Ценева, Г.Н. Хамдулаева [и др.] // Биотехносфера. 2012. № 1 (19). С. 20 — 24.

13. Краева, Л.А. Роль высокоавидных антитоксических антител в оценке невосприимчивости к дифтерийной инфекции / Л.А. Краева, Г.Я. Ценева, А.М. Николаева, Е.А. Алексеева // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2011. № 4. С. 27 — 31.

14. Краева, Л.А. Комплексные лабораторные исследования на дифтерию на современном этапе / Л.А. Краева, Е.А. Алексеева, Г.И. Беспалова // Бактериология. 2017. Т. 2. № 1. С. 20 — 24.

15. Краева, Л.А. Инфицированность трудовых мигрантов из Средней Азии и постоянных жителей Санкт-Петербурга возбудителями различных инфекционных заболеваний и восприимчивость к ним / Л.А. Краева, Н.К. Токаревич, И.Н. Лаврентьева [и др.] // Инфекция и иммунитет. 2018. Т. 8. № 1. С. 61 — 70.

16. Пименова, А.С. Влияние разных типов сухих тампонов и условий их хранения на высеваемость Corynebacterium diphtheriae / А.С. Пименова, Н.Т. Гадуа, О.Ю. Борисова [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. 2022. Т. 67. № 5. С. 296 — 300.

17. Шепелин, А.П. Отечественная питательная среда — Коринебакагар для выделения возбудителя дифтерии / А.П. Шепелин // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». 2012. № 4. С. 108 — 110.

18. Шепелин, А.П. Сравнительная характеристика питательных сред для выделения коринебактерий / А.П. Шепелин, О.В. Полосенко, О.Ю. Борисова, Н.Т. Гадуа // Клиническая лабораторная диагностика. 2016. № 1. С. 59 — 64.

19. Шепелин, А.П. Бактериологическая диагностика дифтерийной инфекции / А.П. Шепелин // Справочник заведующего КДЛ. 2016. № 6. С. 19 — 24.

20. Both, L. External quality assessments for microbiologic diagnosis of diphtheria in Europe / L. Both, S. Neal, A. De Zoysa, et al // Journal of clinical microbiology. 2014. Vol. 52. № 12. P. 4381 — 4384.

21. Tagini, F. Distinct genomic features characterize two clades of Corynebacterium diphtheriae: proposal of Corynebacterium diphtheriae subsp. diphtheriae subsp. nov. and Corynebacterium diphtheriae subsp. lausannense subsp. nov / F. Tagini, T. Pillonel, A. Croxatto, et al // Frontiers in microbiology. 2018. Vol. 9. Art 1743.