ГОСТ Р 50929-96. Государственный стандарт Российской Федерации. Премиксы. Методы определения витаминов группы B
(принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 29.07.1996 № 488)
Внимание
Документ утратил силу с 1 июля 2014 года в связи с изданием Приказа Росстандарта от 28.06.2013 № 304-ст. Взамен введен в действие ГОСТ 32042-2012. Документ утратил силу с 1 июля 2014 года в связи с изданием Приказа Росстандарта от 28.06.2013 № 304-ст. Взамен введен в действие ГОСТ 32042-2012. Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания» (ТР ТС 027/2012) и осуществления оценки (подтверждения) соответствия продукции (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 18.10.2012 № 191). Документ введен в действие с 1 января 1997 года.
ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ
flowchart LR n0["ГОСТ Р 50929-96"]:::rst click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-50929-96" "ГОСТ Р 50929-96. Государственный стандарт Российской Федерации. Премиксы. Методы определения витаминов группы B (принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 29" n1["ГОСТ 32042-2012"]:::doc click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-32042-2012" "ГОСТ 32042-2012. Межгосударственный стандарт. Премиксы. Методы определения витаминов группы B (введен в действие Приказом Росстандарта от 28.06.2013 N 304-ст)" n0 --> n1 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
от 29 июля 1996 г. № 488
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ ГРУППЫ B
Premixes. Methods for determination of vitamin B complex
1 января 1997 года
Предисловие
1. Разработан Акционерным обществом открытого типа «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (АООТ «ВНИИКП»);
Нижегородским государственным техническим университетом.
Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 «Комбикорма, БВД, премиксы».
2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 29 июля 1996 г. № 488.
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Настоящий стандарт распространяется на премиксы и устанавливает методы определения витаминов B_{1} , B_{2} холинхлорида, B_{5} химическими методами и высокоэффективной жидкостной хроматографией.
2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 246-76 Гидросульфит натрия технический. Технические условия
ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия
ГОСТ 2603-79 Ацетон. Технические условия
ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4109-79 Бром. Технические условия
ГОСТ 4139-75 Калий роданистый. Технические условия
ГОСТ 4166-76 Натрий серно-кислый. Технические условия
ГОСТ 4174-77 Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия
ГОСТ 4201-79 Натрий углекислый кислый. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4206-75 Калий железосинеродистый. Технические условия
ГОСТ 4234-77 Калий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 4530-76 Кальций углекислый. Технические условия
ГОСТ 6016-77 Спирт изобутиловый. Технические условия
ГОСТ 6217-74 Уголь активный древесный дробленый. Технические условия
ГОСТ 6552-80 Кислота ортофосфорная. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 9337-79 Натрий фосфорнокислый 12-водный. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
ГОСТ 19908-90 Тигли, чаши, стаканы, колбы, воронки, пробирки и наконечники из прозрачного кварцевого стекла. Общие технические условия
ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25664-83 Метол (4-метиламинофенол сульфат). Технические условия
ГОСТ 26573.0-85. Премиксы. Технические условия
ГОСТ 27067-86 Аммоний роданистый. Технические условия
ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 29228-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания
ГОСТ 29251-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 29252-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 2. Бюретки без времени ожидания
3. ОТБОР ПРОБ
Отбор проб по ГОСТ 13496.0.
Сущность метода заключается в извлечении витамина B_{1} (тиамина) из навески анализируемого продукта раствором серной кислоты, окислении его раствором железосинеродистого калия в тиохром, экстракции окисленной формы из водной фазы изобутиловым спиртом и измерении интенсивности флуоресценции.
4.1. Аппаратура, материалы и реактивы
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1.
Колбы мерные 2-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.
Воронки стеклянные типа В по ГОСТ 25336.
Пробирки П-1(2)-25-0,2 по ГОСТ 1770.
Шкаф сушильный с терморегулятором, обеспечивающий постоянство температуры (105 +/- 2) °C.
Воронки делительные типа ВД вместимостью 100 см3 по ГОСТ 25336.
Стаканы В-1-100ТХС по ГОСТ 25336.
Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Цилиндры 1(2, 3, 4)-25(50, 100) по ГОСТ 1770.
Фильтры обеззоленные (красная лента) по нормативному документу [3].
Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор молярной концентрации c(_{2}^{1}H_{2}SO_{4}) = 0,1\text{моль}/\text{дм}^{3} .
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор в соотношении 1:1 (по объему) и раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 10%.
Спирт изобутиловый по ГОСТ 6016.
Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.
Калий железосинеродистый (красная кровяная соль) по ГОСТ 4206, раствор с массовой долей 1%.
Хининсульфат или хининхлорид по нормативным документам [9, 10].
Тиаминбромид или тиаминхлорид по нормативным документам [16, 17].
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
4.2. Подготовка к испытанию
4.2.1 Приготовление окислительной смеси
1 см3 свежеприготовленного раствора железосинеродистого калия смешивают с 49 см3 раствора гидроокиси натрия.
Смесь готовят в день проведения анализа.
4.2.2 Приготовление основного стандартного раствора из хининсульфата
10 мг хининсульфата растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в растворе серной кислоты и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор хранится не более 1 года в склянке из темного стекла.
4.2.3 Приготовление рабочего стандартного раствора хининсульфата
Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом. Для этого 1 см3 основного стандартного раствора (4.2.2) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки раствором серной кислоты.
Концентрация хининсульфата — 1 мкг/см3.
4.2.4 Приготовление основного стандартного раствора из тиаминбромида
Взвешивают 10 мг кристаллического тиаминбромида, предварительно высушенного в сушильном шкафу в течение 2 — 3 ч при температуре 100 — 105 °C, растворяют его в мерной колбе вместимостью 100 см3 в растворе соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3 и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор содержит 100 мг тиамина в 1 см3.
Раствор хранят не более 1 мес в склянке из темного стекла в прохладном месте.
4.2.5 Приготовление рабочего стандартного раствора тиаминбромида
Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом.
1 см3 основного стандартного раствора тиаминбромида (4.2.4) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки дистиллированной водой.
Концентрация рабочего стандартного раствора тиаминбромида — 1 мкг/см3.
4.2.6. Контроль за содержанием витамина B_{1} в стандартном растворе проводят по 6.2.4.
4.3. Проведение испытания
Навеску премикса массой 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 5 г хлористого калия и приливают 70 см3 серной кислоты. Затем колбу с реактивами встряхивают на аппарате в течение 10 мин, доводят объем в колбе до метки раствором серной кислоты, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр, отбросив первую порцию фильтрата. Переносят 2 см3 фильтрата в мерную колбу вместимостью 50 см3 и доводят до метки раствором серной кислоты. Отбирают 20 см3 разбавленного фильтрата и переносят в делительную воронку, куда приливают 20 см3 изобутилового спирта, тщательно перемешивают в течение 2 мин. После расслоения верхний слой сливают, а нижний — переносят в градуированную пробирку и доводят до объема 20 см3 раствором серной кислоты, перемешивают.
Из пробирки берут 8 см3 раствора в делительную воронку, приливают 6 см3 окислительной смеси (4.2.1), перемешивают, добавляют 20 см3 изобутилового спирта и встряхивают 2 мин. После расслоения нижний водный слой отбрасывают, а верхний (спиртовый) — фильтруют через обеззоленный фильтр (красная лента), пропуская через слой безводного сернокислого натрия (4 — 5 г) в флуорометрическую пробирку и флуорометрируют.
Для окисления стандартного раствора берут 8 см3 рабочего стандартного раствора тиамина и проводят дальнейшую его обработку, как с испытуемой пробой.
Для гашения флуоресценции в испытуемом и стандартном растворах к ним добавляют по 1 — 2 капли раствора соляной кислоты в соотношении 1:1 (по объему), перемешивают и измеряют остаточную флуоресценцию.
Если в качестве стандартного раствора используют раствор хининсульфата (или хининхлорида), то его не окисляют и не гасят, так как он имеет одно и то же значение по флуорометру, равное 72.
По стандартному раствору хининхлорида (хининсульфата) настраивают (по инструкции) прибор на деление прибора 80.
4.4. Обработка результатов испытания
Содержание витамина B_{1} , X в премиксе, г/т, вычисляют по формуле
где A — показание флуорометра для испытуемого раствора до гашения;
A_{1} — показание флуорометра для испытуемого раствора после гашения;
V — первоначальный объем раствора, см3;
V_{1} , V_{2} — разведения, см3;
C — масса витамина в стандартном растворе, мкг;
F — показания флуорометра для стандартного раствора до гашения;
F_{1} — показания флуорометра для стандартного раствора после гашения;
V_{3} — объем испытуемого раствора, взятый на испытание, см3.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.
Примечание. При использовании в качестве стандартного раствора хининсульфата (хининхлорида) в расчетную формулу вместо выражения (F - F_{1}) подставляют цифру 72.
Сущность метода заключается в извлечении витамина B_{2} (рибофлавина) из навески путем кислотного гидролиза и измерении интенсивности флуоресценции.
5.1. Аппаратура, материалы и реактивы
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
pH-метр по нормативному документу [8].
Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу [3].
Колбы мерные 2-50(100, 1000)-1(2) по ГОСТ 1770.
Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1, 6(7)-1(2)-25 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Цилиндры 1(2, 3, 4)-100 по ГОСТ 1770.
Витамин B_{2} по нормативному документу [11].
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор с массовой долей 5% и раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 15%.
Натрий двууглекислый по ГОСТ 4201.
Натрия гидросульфит по ГОСТ 246.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
5.2. Подготовка к испытанию
5.2.1 Приготовление основного стандартного раствора витамина B_{2}
40 мг витамина B_{2} растворяют в дистиллированной воде, подкисленной 10 см3 ледяной уксусной кислоты, при нагревании до 50 °C в мерной колбе вместимостью 1000 см3. Доводят объем до метки дистиллированной водой. В 1 см3 раствора содержится 40 мкг рибофлавина.
Раствор хранят в прохладном, темном месте в склянке из темного стекла не более 2 мес.
5.2.2 Приготовление рабочего стандартного раствора рибофлавина
1 см3 основного стандартного раствора рибофлавина переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки дистиллированной водой, подкисленной раствором соляной кислоты с массовой долей 5% до pH 5,5 — 6,0.
В 1 см3 раствора содержится 0,4 мкг рибофлавина.
Раствор готовят перед употреблением.
5.2.3. Контроль за содержанием витамина B_{2} в стандартном растворе проводят по 6.2.4.
5.3. Проведение испытания
Навеску премикса массой 2 — 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, приливают 75 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3, смывая частицы премикса со стенок колбы. Колбу помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. Содержимое колбы периодически перемешивают.
После охлаждения колбы pH раствора доводят до значения 5,5 — 6,0 раствором гидроокиси натрия. Затем объем в колбе доводят дистиллированной водой до метки, хорошо перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин при 8000 об/мин.
Из полученного фильтрата готовят раствор с нужным разведением (например, 1 см3 фильтрата разводят в мерной колбе вместимостью 50 см3) и определяют интенсивность флуоресценции, помещая в одну флуорометрическую пробирку 12 — 15 см3 испытуемого раствора, в другую — такое же количество рабочего стандартного раствора. Затем в эти же пробирки добавляют 2 — 3 раза по 0,1 г двууглекислого натрия и по 0,1 г гидросульфита натрия или 4 — 6 капель раствора гидроокиси натрия. Содержимое пробирок осторожно перемешивают, фильтруют, если раствор мутный, и снова измеряют интенсивность флуоресценции на приборе.
5.4. Обработка результатов испытания
Содержание витамина B_{2} , X в премиксе, г/т, вычисляют по формуле
где A — показания флуорометра для испытуемого раствора до гашения флуоресценции;
A_{1} — показания флуорометра для испытуемого раствора после гашения флуоресценции;
C — содержание витамина B_{2} в рабочем стандартном растворе, мкг/см3;
V — первоначальный объем раствора, см3;
V_{2} — окончательный объем разведения, см3;
F — показания флуорометра для стандартного раствора до гашения флуоресценции;
F_{1} — показания флуорометра для стандартного раствора после гашения флуоресценции;
V_{1} — объем раствора, взятый для разведения, см3.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.
Сущность метода заключается в экстракции витаминов B_{1} (тиамина) и B_{2} (рибофлавина) из навески раствором соляной кислоты и определении их на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором с использованием обращенно-фазного режима элюирования.
Метод применим в диапазоне содержания витамина B_{1} от 0,05 до 0,5 г/кг в премиксе, витамина B_{2} — от 0,1 до 2 г/кг в премиксе.
6.1. Аппаратура, материалы и реактивы
Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором и систематической погрешностью измерений не выше 10%. Допускается использовать хроматографы «Цвет-306», «Цвет-3006 со спектрофотометрическим детектором» и «Милихром».
Колонка хроматографическая стальная или стеклянная высотой 150 мм и диаметром 4 мм с числом теоретических тарелок не менее 2000, заполненная сорбентом «Силасорб С-18» или «Сепарон С-18».
Спектрофотометр СФ-26 или СФ-46 (спектральный диапазон 186 — 1100 нм).
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Линейка измерительная металлическая по ГОСТ 427.
Секундомер механический по нормативному документу [15].
Сорбент «Силасорб С-18» зернением 7 мкм.
pH-метр по нормативному документу [8].
Центрифуга лабораторная ЦЭ-2 с числом оборотов 6000 в мин.
Иономер ЭБ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ-62-07.
Микрошприц МШ-10 или микропипетка МП-2.
Колбы конические со шлифом вместимостью 100 см3 по ГОСТ 25336.
Колбы мерные 2-25(50, 100, 200)-1(2) по ГОСТ 1770.
Воронка ВФ-1-56(75)ХС или ВФ-2-75(110)ХС со стеклянным фильтром ПОР 100 по ГОСТ 25336.
Пипетки градуированные 6(7)-1(2)-10 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
Ацетонитрил по нормативному документу [7].
Натрия октилсульфонат, хроматографически чистый (изготовление Германия, фирма Pylver).
Триэтиламин, перегнанный по нормативному документу [4].
Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552.
Кислота соляная по ГОСТ 3118 концентрированная и раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3.
Витамин B_{2} по нормативному документу [11].
Витамин B_{1} по нормативным документам [16, 17].
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
6.2. Подготовка к испытанию
6.2.1 Приготовление элюента
Для приготовления 1 дм3 элюента смешивают 120 см3 ацетонитрила с 880 см3 дистиллированной воды, добавляют 2,5 см3 триэтиламина, 0,5 г октилсульфоната натрия и приливают ортофосфорную кислоту до pH 7,6 по pH-метру. Полученную смесь фильтруют через стеклянный фильтр для удаления механических примесей.
Срок хранения элюента — не более 1 мес.
6.2.2 Приготовление раствора-экстрагента
К 1 дм3 дистиллированной воды прибавляют 0,8 см3 концентрированной (37%-ной) соляной кислоты, pH раствора 2 +/- 0,2.
6.2.3 Приготовление основных стандартных растворов витаминов B_{1} и B_{2}
Для приготовления основных стандартных растворов витаминов B_{1} и B_{2} берут навески 0,1 г тиаминхлорида и 0,01 г рибофлавина. Навеску тиаминхлорида растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см3, а рибофлавина — в мерной колбе вместимостью 200 см3, при нагревании до температуры 70 — 80 °C и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы содержат в 1 см3 1 мг витамина B_{1} и 0,05 мг витамина B_{2} соответственно.
Срок хранения основных стандартных растворов витаминов B_{1} и B_{2} — не более 2 недель в холодильнике.
6.2.4 Контроль за содержанием витаминов B_{1} и B_{2} в основных стандартных растворах
Контроль за содержанием витаминов в основных стандартных растворах осуществляют спектрофотометрически по значениям молярных коэффициентов светопоглощения.
Для этого основные стандартные растворы разбавляют дистиллированной водой в 50 раз и измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см.
Массовую концентрацию витаминов B_{1} и B_{2} , c, рассчитывают по формуле
l — толщина слоя раствора, 1 см.
Массовую концентрацию витаминов B_{1} , c_{1} , и B_{2} , c_{2} , мг/см3, рассчитывают соответственно по формулам:
где 205 — молярный коэффициент светопоглощения тиаминхлорида при рабочей длине волны 268 нм;
324 — молярный коэффициент светопоглощения рибофлавина при рабочей длине волны 445 нм.
6.2.5 Приготовление рабочего стандартного раствора витаминов B_{1} и B_{2}
Из основных стандартных растворов готовят рабочие стандартные растворы с содержанием витаминов B_{1} — 0,02 мг и B_{2} — 0,025 мг в 1 см3.
Для этого в мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают 1 см3 основного стандартного раствора тиаминхлорида (6.2.3) и 25 см3 основного стандартного раствора рибофлавина (6.2.3), доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.
Рабочий стандартный раствор готовят в день испытаний.
6.3. Проведение испытания
6.3.1 Экстракция витаминов B_{1} и B_{2}
Навеску премикса массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 см3 и приливают 10 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3. Колбу ставят на магнитную мешалку с включением нагрева. Перемешивание и нагрев осуществляют в течение 10 мин. Полученную суспензию переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 5000 — 6000 об/мин в течение 3 мин. Центрифугат сливают в мерную колбу вместимостью 25 см3. Коническую колбу с остатком раствора смывают небольшим количеством (около 5 см3) раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3, сливают раствор в центрифужную пробирку и снова центрифугируют. Центрифугат соединяют с первым в той же мерной колбе. Промывание центрифугированием повторяют 3 — 4 раза, каждый раз сливая промывные воды в ту же колбу. После этого раствор в мерной колбе доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют или дополнительно центрифугируют для очищения от механических примесей и взвешенных частиц. Приготовленный раствор используют для хроматографического анализа.
6.3.2 Хроматографирование
Хроматографирование осуществляют в следующих условиях. Разделение проводят на колонке 4 x 150 мм, заполненной сорбентом (6.2.4).
Подвижная фаза — элюент (6.2.1).
Рабочая длина волны спектрофотометрического детектора хроматографа 254 нм. Скорость элюирования — 1,2 см3/мин. Время удерживания для витамина B_{1} составляет 6 мин, а для витамина B_{2} — 8 мин. Объем загрузки анализируемого раствора — 10 мкдм3. Для насыщения колонки в начале работы производится 3 — 5 загрузок, отмечая высоты пиков. При достижении постоянной высоты можно приступить к испытаниям. Анализируемые растворы хроматографируют каждый по три раза в одинаковых условиях. В этих же условиях хроматографируют рабочие стандартные растворы витаминов B_{1} и B_{2} .
Измеряют высоты пиков как расстояние от вершины пика до линии, проведенной в основании пика (Приложение А, рисунок А.1, и Приложение Б, рисунок Б.1).
6.4. Обработка результатов испытания
Содержание витаминов B_{1} и B_{2} , X_{1} и X_{1} в премиксе, г/т, вычисляют по формуле
где h_{\text{х}} — высота пика витамина на хроматограммах экстракта из премикса, мм;
c_{\text{ст}} — массовая концентрация витамина в рабочем стандартном растворе, мг/см3;
V_{\text{к}} — объем премикса с экстрактом, см3;
h_{\text{ст}} — высота пика витамина на хроматограммах рабочего стандартного раствора, мм;
m — масса навески премикса, г.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.
7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛИНХЛОРИДА
Сущность метода заключается в экстракции холинхлорида дистиллированной водой, образовании в присутствии трехзамещенного фосфата натрия комплекса рейнеката холинхлорида и измерении интенсивности окраски его ацетоновых растворов спектрофотометрически.
7.1. Аппаратура, материалы и реактивы
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Фотоэлектроколориметр — ФЭК-56М, КФК или спектрофотометр типа СФ-26.
Насос вакуумный по ГОСТ 25336.
Колбы конические вместимостью 50 — 100 см3 по ГОСТ 25336.
Эксикатор вакуумный по ГОСТ 25336.
Стаканы химические вместимостью 200 — 250 см3 по ГОСТ 25336.
Колбы конические с притертой пробкой вместимостью 100 и 250 см3 по ГОСТ 25336.
Воронка ВФО-40-ПОР-16 (Шотта № 2) по ГОСТ 25336.
Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1.
Колбы мерные 2-25(100)-1(2) по ГОСТ 1770.
Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-2, 6(7)-1(2)-5(10, 25) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Цилиндр мерный 1(2, 3, 4)-100 по ГОСТ 1770.
Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу [3].
Холинхлорид кристаллический по нормативному документу [18].
Натрий фосфорнокислый 12-водный по ГОСТ 9337, раствор с массовой долей 0,1%.
Спирт изопропиловый по нормативному документу [1].
Рейнекат аммония по нормативному документу [5].
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
7.2. Подготовка к испытанию
7.2.1 Приготовление осаждающего реактива
2 г рейнеката аммония растворяют в 100 см3 этилового спирта в конической колбе при нагревании на водяной бане при температуре (40 +/- 2) °C в течение 20 мин. После охлаждения раствор фильтруют через обеззоленный складчатый фильтр. Раствор готовят в день определения.
7.2.2 Приготовление стандартного раствора холинхлорида
0,1 г кристаллического холинхлорида высушивают до постоянной массы в вакуум-эксикаторе и растворяют его в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см3. Доводят до метки дистиллированной водой. Стандартный раствор содержит 1 мг холинхлорида в 1 см3.
Допускается приготовление стандартного раствора из 70%-ного раствора холинхлорида с пересчетом на 100%-ную активность.
7.2.3 Построение градуировочного графика
В 5 конических колб вместимостью 50 см3 помещают 1, 2, 5, 7, 10 см3 стандартного раствора холинхлорида соответственно, добавляют 10 см3 раствора фосфата натрия и 5 см3 раствора рейнеката аммония и далее проводят все испытания по 7.2.4. Интенсивность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром или спектрофотометре при длине волны 526 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно ацетона и на основании его показаний строят градуировочный график.
7.2.4 Проведение испытания
Навеску премикса массой 1 — 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, приливают 50 см3 дистиллированной воды, нагревают до 80 °C и встряхивают на аппарате 15 мин. Охлаждают колбу, объем доводят до метки дистиллированной водой и фильтруют через обеззоленный складчатый фильтр в стакан. Отбирают 5 — 20 см3 фильтрата в колбу с притертой пробкой, приливают 10 см3 раствора фосфорнокислого натрия и 5 см3 раствора рейнеката аммония. Колбу с содержимым встряхивают и оставляют на 2 ч при температуре 4 °C. После выпадения кристаллов холинхлорида раствор фильтруют на воронке Шотта № 2 с асбестовым слоем, используя вакуумный насос. Кристаллы, оставшиеся на фильтре, промывают 4 — 5 порциями (по 5 см3) охлажденного изопропилового спирта (спирт хранится в холодильнике до полного использования). Меняют колбу и растворяют кристаллы ацетоном, приливая его в три приема по 7 см3, каждый раз осторожно размешивая верхний асбестовый слой с осадком.
Содержимое колбы фильтруют в мерную колбу вместимостью 25 см3. Объем доводят в колбе ацетоном до метки. Интенсивность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром или спектрофотометре при длине волны 526 нм в кюветах толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно ацетона.
7.3. Обработка результатов испытания
Содержание 70%-ного холинхлорида, X в премиксе, г/т, рассчитывают по формуле
где K — масса холинхлорида, найденная по градуировочному графику, мм;
1,43 — коэффициент пересчета на 70%-ный раствор холинхлорида;
V — общий объем экстракта, см3;
V_{1} — объем раствора, взятый на проведение анализа, см3.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.
Сущность метода заключается в кислотном гидролизе связанных форм витамина B_{5} (никотиновой кислоты), очистке гидролизата, получении окрашенного раствора и колориметрическом определении в сравнении со стандартным раствором.
8.1. Аппаратура, материалы и реактивы
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Фотоэлектроколориметр типа ФЭК-56, КФК или спектрофотометр типа СФ-26 или аналогичные с диапазоном длин волн 400 — 440 нм.
Воронка Бюхнера № 3 или № 4 по ГОСТ 9147.
Стакан химический вместимостью 1 и 2 дм3 по ГОСТ 25336.
Колбы конические вместимостью 250 дм3 по ГОСТ 25336.
Бюретка 1-2-25 по ГОСТ 29251 и ГОСТ 29252.
Фильтры обеззоленные (красная и синяя ленты) по нормативному документу [3].
Колбы мерные 2-100(500, 1000)-1(2) по ГОСТ 1770.
Воронки стеклянные по ГОСТ 25336.
Пипетки 1(2, 4, 5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10, 25) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Пробирки с притертой пробкой вместимостью 15 см3 по ГОСТ 1770.
Цилиндры мерные 1(2, 3, 4)-50(100, 500) по ГОСТ 1770.
Бром по ГОСТ 4109.
Калий роданистый по ГОСТ 4139 или аммоний роданистый по ГОСТ 27067, растворы с массовыми долями 1 и 10%.
Кальций углекислый по ГОСТ 4530.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,5 моль/дм3 (0,5 н.).
Кислота серная по ГОСТ 4204, растворы с молярными концентрациями c(_{2}^{1}H_{2}SO_{4}) = 2\text{моль}/\text{дм}^{3} и c(_{2}^{1}H_{2}SO_{4}) = 10\text{моль}/\text{дм}^{3} .
Витамин B_{5} по нормативному документу [12].
Метол по ГОСТ 25664, раствор с массовой долей 6%.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, растворы молярных концентраций c(NaOH) = 4 моль/дм3 и c(NaOH) = 10 моль/дм3.
Уголь активный по ГОСТ 6217.
Фенолфталеин по нормативному документу [6].
Цинк сернокислый по ГОСТ 4174, раствор с массовой долей 80%.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. и ч.д.а.
8.2. Подготовка к испытанию
8.2.1 Перекристаллизация метола
500 см3 раствора серной кислоты молярной концентрации c(_{2}^{1}H_{2}SO_{4}) = 0,1\text{моль}/\text{дм}^{3} нагревают до кипения, добавляют 100 г метола и снова доводят до кипения. Если раствор сильно окрашен, к нему добавляют 10 г активного угля. Кипящий раствор быстро фильтруют через предварительно нагретую (кипящей водой) воронку Бюхнера, фильтрат переносят в большой химический стакан, приливают 0,7 дм3 этилового спирта (96°), размешивают, помещают в ледяную баню и оставляют на несколько часов в темном месте.
Выпавшие в осадок кристаллы отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают на фильтре 2 — 3 раза этиловым спиртом, порциями по 30 — 40 см3 и высушивают на воздухе в темном месте.
Подготовленный метол хранят в склянке из темного стекла в холодильнике до полного использования.
8.2.2 Приготовление раствора метола
Навеску перекристаллизированного метола массой (8 +/- 0,002) г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем до метки раствором соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,5 моль/дм3. Раствор готовят перед употреблением.
8.2.3 Приготовление бромной воды
В темную склянку с притертой пробкой 100 см3 дистиллированной воды, добавляют в вытяжном шкафу 4 — 5 см3 брома, хорошо встряхивают и оставляют на 1 — 3 сут для лучшего насыщения воды бромом. Бромную воду охлаждают в емкости со льдом в течение 30 мин.
8.2.4 Приготовление роданбромидного раствора
К 30 см3 охлажденной бромной воды по каплям прибавляют раствор роданистого калия или роданистого аммония с массовой долей 10% до светло-желтого окрашивания. Затем по каплям прибавляют эти же растворы с массовой долей 1% до полного обесцвечивания бромной воды. К обесцвеченному раствору постепенно, небольшими порциями, по 20 — 50 мг, добавляют углекислый кальций до прекращения выделения пузырьков газа.
Раствор фильтруют от осадка через обеззоленный фильтр с синей лентой в склянку из темного стекла с притертой пробкой и хранят на холоде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
8.2.5 Приготовление основного стандартного раствора витамина B_{5}
(500 +/- 0,002) мг витамина B_{5} помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, добавляют 200 см3 дистиллированной воды, 5 см3 раствора серной кислоты молярной концентрации c(_{2}^{1}H_{2}SO_{4}) = 10\text{моль}/\text{дм}^{3} и после растворения кристаллов доводят объем дистиллированной водой до метки.
В 1 см3 раствора содержится 1000 мкг витамина B_{5} .
Раствор годен к употреблению в течение 6 мес при хранении в холодильнике.
8.2.6 Приготовление рабочего стандартного раствора витамина B_{5}
5 см3 основного стандартного раствора витамина B_{5} разводят дистиллированной водой в колбе вместимостью 1 дм3, доводят до метки этой же водой и тщательно перемешивают. В 1 см3 раствора содержится 5 мкг витамина B_{5} . Раствор готовят в день проведения анализа.
8.3. Проведение испытания
Навеску массой 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, смывая горлышко колбы 60 — 65 см3 раствора серной кислоты молярной концентрации c(_{2}^{1}H_{2}SO_{4}) = 2\text{моль}/\text{дм}^{3} . Содержимое перемешивают и колбу помещают в кипящую водяную баню на 40 мин, периодически перемешивая содержимое. По окончании гидролиза колбу охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбрасывая первые 5 — 10 см3 фильтрата.
Отбирают 10 — 20 см3 фильтрата в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем до метки дистиллированной водой. Затем 25 см3 полученного раствора помещают в цилиндр вместимостью 50 см3, добавляют 1 — 2 капли раствора фенолфталеина и нейтрализуют, внося по каплям раствор гидроокиси натрия молярной концентрации c(NaOH) = 10 моль/дм3 до получения слабо-розового окрашивания. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации c(_{2}^{1}H_{2}SO_{4}) = 2\text{моль}/\text{дм}^{3} , добавляя по каплям до исчезновения розового окрашивания. Раствор охлаждают, добавляют 2 см3 раствора сернокислого цинка и 1 — 2 капли этилового спирта (для устранения пены).
Из пипетки по каплям добавляют раствор гидроокиси натрия молярной концентрацией c(NaOH) = 4 моль/дм3, одновременно перемешивая палочкой до образования осадка и появления бледно-розового окрашивания раствора. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации c(_{2}^{1}H_{2}SO_{4}) = 2\text{моль}/\text{дм}^{3} (до исчезновения розового окрашивания) и оставляют стоять в течение 10 мин, периодически перемешивая. Палочку вынимают, обмывают над цилиндром дистиллированной водой и доводят объем до 50 см3, перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр.
Цветную реакцию проводят в восьми пробирках с притертыми пробками: в одну пробирку вносят 5 см3 дистиллированной воды (контроль на реактивы, B_{1} ); в три пробирки вносят по 5 см3 рабочего стандартного раствора, B; в четыре пробирки вносят по 5 см3 полученного фильтрата, из них 2 пробирки с испытуемым раствором A; две — поправка на аминореагирующие вещества, A_{1} .
Все пробирки, кроме A_{1} , помещают на 5 мин в водяную баню при температуре (50 +/- 2) °C. После этого в 2 пробирки (A_{1}) вносят по 2 см3 дистиллированной воды, а во все остальные пробирки — по 2 см3 роданбромидного раствора из бюретки в вытяжном шкафу. Пробирки закрывают пробками, перемешивают и помещают в баню при той же температуре на 10 мин. По истечении этого времени пробирки вынимают, охлаждают водой до комнатной температуры и ставят на 10 мин в темное место. Затем в каждую пробирку приливают по 3 см3 раствора метола, перемешивают и оставляют на 1 ч в темном месте при комнатной температуре. По истечении этого времени растворы фильтруют через бумажный складчатый фильтр, если они мутные, и колориметрируют на фотоэлектроколориметре (синий светофильтр) или спектрофотометре при длине волны 400 — 440 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно дистиллированной воды.
8.4. Обработка результатов испытания
Содержание витамина B_{5} , X в премиксе, г/т, рассчитывают по формуле
где A — оптическая плотность испытуемого раствора (среднее из двух параллельных определений);
A_{1} — оптическая плотность раствора — поправки на аминореагирующие вещества (среднее из двух параллельных определений);
V_{2} — объем разведения, см3;
V_{4} — объем раствора после обработки сернокислым цинком, см3;
C — масса витамина B_{5} в измеряемом стандартном растворе, мкг;
B — оптическая плотность стандартного раствора (среднее из трех параллельных определений);
B_{1} — оптическая плотность раствора — контроль на реактивы;
m — масса навески премикса, г;
V_{1} — объем, взятый на дополнительное разведение, см3;
V_{3} — объем гидролизата, взятый на обработку сернокислым цинком, см3;
V_{5} — объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см3.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.
9.1. Определение витамина B_{5} с применением жидкостного микроколоночного хроматографа отечественного производства марки «Милихром»
Сущность метода заключается в экстракции витамина B_{5} (никотиновой кислоты) из навески премикса раствором соляной кислоты и последующем определении его содержания в испытуемом растворе с помощью хроматографа «Милихром».
9.1.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Хроматограф жидкостный микроколоночный «Милихром» со спектрофотометрическим детектором (спектральный диапазон от 190 до 360 нм).
Колонка хроматографическая размером 2 x 120 мм с числом теоретических тарелок не менее 4000, заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С18, Силасорб SPHC 18, Сепарон С18.
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Колбы конические КН-100, КН-200 по ГОСТ 19908.
Баня водяная с терморегулятором.
Пипетки 2-1(2)-1, 2-1(2)-5, 2-1(2)-10 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Колбы мерные 2-50-1(2), 2-100-1(2), 2-200-1(2) по ГОСТ 1770.
Воронка ВФ-1-40-ПОР 16-ХС по ГОСТ 25336.
Воронка 71 по ГОСТ 19908.
Стакан ВН-50, ВН-200 по ГОСТ 19908.
pH-метр по нормативному документу [8]
Цилиндр мерный 2-50, 2-100 по ГОСТ 1770.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 40%.
Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор молярной концентрации c(_{2}^{1}H_{2}SO_{4}) = 5\text{моль}/\text{дм}^{3} .
Кислота уксусная по ГОСТ 61 с массовой долей 95%.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3.
Витамин B_{5} по нормативному документу [12].
Фенолфталеин по нормативному документу [6].
Триметиламин по нормативному документу [2].
Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
9.1.2 Подготовка к испытанию
9.1.2.1 Приготовление элюента для хроматографии
Трехкомпонентный элюент готовят смешиванием уксусной кислоты, дистиллированной воды и триметиламина в объемном соотношении 3:95:2. Для этого в мерную колбу вместимостью 500 см3 вносят пипеткой 15 см3 концентрированной уксусной кислоты, затем цилиндром вносят 100 см3 дистиллированной воды и перемешивают. Добавляют 10 см3 триметиламина, перемешивают, доводят до метки дистиллированной водой и снова тщательно перемешивают. Приготовленный раствор фильтруют через стеклянный фильтр ПОР 16 и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой. Полученный элюент хранят не более 1 мес в холодильнике.
9.1.2.2 Подготовка хроматографической колонки
Через колонку пропускают элюент в количестве 20 — 30 свободных объемов колонки, т.е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мкдм3/мин, а затем 100 мкдм3/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.
После стабилизации колонки проводят ее насыщение витамином B_{5} . Для этого выполняют 7 — 10 анализов более концентрированного градуировочного раствора витамина B_{5} . Насыщение колонки прекращают, когда расхождение между последовательными определениями не превышает 3,0%.
9.1.2.3. Приготовление раствора серной кислоты молярной концентрации c(_{2}^{1}H_{2}SO_{4}) = 5\text{моль}/\text{дм}^{3} .
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 30 — 40 см3 дистиллированной воды и добавляют 14,2 см3 концентрированной серной кислоты. Осторожно перемешивают и добавляют еще 35 — 40 см3 дистиллированной воды. Когда раствор остынет до комнатной температуры, осторожно доводят объем дистиллированной водой до метки.
9.1.2.4 Построение градуировочного графика
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,1 г витамина B_{5} и приливают 70 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3. Колбу помещают в водяную баню и нагревают в течение 10 мин при температуре 75 °C. Затем охлаждают и содержимое количественно переносят в химический стакан вместимостью 200 см3. Добавляют 1 — 2 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина, раствор гидроокиси натрия с массовой долей 40% до образования розового окрашивания, избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации c(_{2}^{1}H_{2}SO_{4}) = 5\text{моль}/\text{дм}^{3} . Раствор фильтруют через бумажный фильтр с синей полосой в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем до метки дистиллированной водой. Получают основной стандартный раствор витамина B_{5} массовой концентрации 1 мг/см3. Из этого раствора готовят рабочие растворы, содержащие 0,4; 0,8; 1,0, 1,5; 2,0; 3,0 мг витамина B_{5} в 50 см3. Для этого соответственно 0,4; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0 и 3,0 см3 основного раствора помещают в 6 мерных колб вместимостью 50 см3 и доводят до метки дистиллированной водой.
Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:
хроматографическая колонка 2 x 120 мм;
сорбент — Силасорб С 18, Силасорб SPH С 18, Сепарон С 18;
трехкомпонентный элюент на основе уксусной кислоты;
скорость подачи элюента — 80 — 100 мкдм3/мин;
Удерживаемый объем пика витамина B_{5} — 560 — 580 мкдм3 (может меняться в зависимости от длины колонки и плотности ее заполнения). Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 150 — 200 мкдм3 элюента до выхода на нулевую линию.
Значение средних высот хроматографических пиков (в единицах оптической плотности е.о.п.) откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс — количество витамина в 50 см3 раствора.
Градуировочный график строят так же, откладывая по оси ординат средние высоты хроматографических пиков, выраженные в единицах длины (миллиметрах).
Построение градуировочного графика можно заменить расчетом коэффициентов наклона K, мг/е.о.п., по формуле
где K_{i} — коэффициент наклона градуировочного графика для i-го градуировочного раствора, мг/е.о.п.;
n — количество точек, по которым строится градуировочный график.
Значение коэффициента наклона градуировочного графика K, мг/е.о.п. или мг/мм, вычисляют по формуле
где C_{i} — содержание витамина в соответствующем i-м градуировочном растворе;
h_{i} — высота i-го хроматографического пика, е.о.п. или мм.
9.1.2.5 Проверка градуировочного графика
Градуировочный график контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1 — 2 рабочих раствора витамина следует анализировать, как указано в 9.1.2.4.
Отклонение полученных результатов от измеренных в момент построения градуировочного графика a, %, определяют по формуле
где h_{1} , h_{2} — высота хроматографического пика, определенная при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно, е.о.п. или мм.
При отклонении результатов более чем на 5% строят новый градуировочный график.
Градуировочные растворы хранят в холодильнике в стеклянной посуде с притертой пробкой. Срок годности растворов не более 1 мес.
9.1.3 Проведение кислотного гидролиза
Навеску премикса массой 1 — 5 г, взятую с погрешностью не более 0,001 г, помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3 и добавляют 3 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм3. Колбу нагревают на водяной бане при температуре (75 +/- 1) °C в течение 10 мин, охлаждают, содержимое колбы количественно переносят в химический стакан вместимостью 200 см3. Добавляют 1 — 2 капли спиртового раствора фенолфталеина с массовой долей 1% и раствор гидроокиси натрия с массовой долей 40% до образования розового окрашивания. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации c(_{2}^{1}H_{2}SO_{4}) = 5\text{моль}/\text{дм}^{3} . После 10-минутного выдерживания раствор фильтруют через обеззоленный фильтр с синей лентой в мерную колбу вместимостью 50 см3 и доводят объем до метки дистиллированной водой.
9.1.4 Хроматографирование
Полученный экстракт хроматографируют, как в 9.1.2.4. Для определения содержания витамина B_{5} в премиксах проводят 2 параллельных анализа, начиная со взятия навески. Каждый экстракт хроматографируют два раза, находят среднеарифметическое значение высоты пиков в единицах оптической плотности или миллиметрах и по градуировочному графику определяют содержание витамина в миллиграммах, Приложение В, рисунок В.1.
9.1.5 Обработка результатов испытания
Содержание витамина B_{5} , X в премиксе, мг/кг, вычисляют по формуле
где C — содержание витамина, найденное по градуировочному графику, мг;
При использовании коэффициента наклона K вместо градуировочного графика содержание витамина B_{5} в премиксе, мг/г, вычисляют по формуле
где K — коэффициент наклона градуировочного графика, мг/е.о.п.;
A — высота хроматографического пика, е.о.п.;
m — масса навески премикса, г.
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.
9.2 Определение витамина B_{5} с применением жидкостных хроматографов импортного производства
Сущность метода заключается в экстракции витамина B_{5} из навески премикса раствором соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3 и хроматографическом анализе его содержания в испытуемом растворе с использованием жидкостного хроматографа со спектрофотометрическим детектором.
Метод применим в диапазоне содержания витамина B_{5} от 0,2 до 4 г/кг премикса.
9.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором при спектральном диапазоне от 200 до 300 нм. Возможно использование детектора при постоянной длине волны 254 нм.
Колонка хроматографическая стальная или стеклянная высотой 150 — 200 мм и диаметром 2,6 — 4,6 мм с числом теоретических тарелок не менее 3000 на 1 м, заполненная сорбентом «Силасорб С-18» или «Сепарон С-18» с зернением 7,5 мкм.
Весы лабораторные не ниже 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Центрифуга лабораторная ЦЭ-2 с числом оборотов 6000 в минуту.
Колбы мерные 2-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.
Иономер ЭВ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ-63-07.
Пипетка 4-1(2)-1 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
Ацетонитрил по нормативному документу [7].
Тетрабутиламмоний хлористый по нормативному документу [14].
Тетрабутиламмоний бромистый по нормативному документу [13].
Витамин B_{5} по нормативному документу [12].
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
1. Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
9.2.2 Подготовка к испытанию
9.2.2.1 Приготовление элюента для хроматографии
В колбе вместимостью 1 дм3 смешивают 120 см3 ацетонитрила с 880 см3 дистиллированной воды, добавляют (2 +/- 0,002) г хлористого (бромистого) тетрабутиламмония. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр для удаления механических примесей и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой.
Полученный раствор можно хранить в течение 1 мес.
9.2.2.2 Приготовление раствора экстрагента
Для экстракции витамина B_{5} используют раствор соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3, который готовят прибавлением к 1 дм3 дистиллированной воды 0,6 см3 концентрированной 37%-ной соляной кислоты. Значение pH должно быть 2 +/- 0,2.
9.2.2.3 Приготовление основного стандартного раствора витамина B_{5}
Навеску витамина B_{5} массой 0,1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см3 и доводят до метки этой же водой. Полученный раствор содержит 1 мг витамина B_{5} в 1 см3.
Раствор хранят в холодильнике до полного использования.
9.2.2.4 Приготовление рабочего стандартного раствора витамина B_{5}
Рабочий стандартный раствор никотиновой кислоты готовят в зависимости от предполагаемого содержания ее в премиксе по таблице 1. Рабочий стандартный раствор готовят в день проведения контроля.
9.2.3 Проведение испытания
9.2.3.1 Экстрагирование
Навеску премикса массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, приливают 2/3 объема раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,01 моль/дм3, перемешивают и оставляют стоять в течение 20 мин, несколько раз при этом перемешивая, после чего доводят до метки тем же раствором. Полученную суспензию перемешивают и часть отливают в центрифужную пробирку, центрифугируют в течение 5 мин при 6000 об/мин. Полученный центрифугат используют для хроматографического анализа.
9.2.3.2 Хроматографирование
Хроматографирование осуществляют при следующих условиях: колонка, заполненная сорбентом, подвижная фаза — элюент по 9.2.2.1, рабочая длина волны спектрофотометрического детектора 262 нм (или 254 нм), скорость элюирования — 1,5 см3/мин, температура — комнатная. При данных условиях проводят 3 — 5 загрузок стандартного раствора по 5 мкдм3, отмечая время выхода пика витамина B_{5} в секундах и высоту пика относительно базисной линии. При достижении постоянной высоты можно приступать к контролю. Загружают по 3 раза в одинаковых условиях 5 — 10 мкдм3 стандартного раствора витамина массовой концентрации 0,01 — 0,04 мг в 1 см3 в зависимости от состава премикса (10 мкдм3 раствора массовой концентрации 0,01 — 0,02 мг/см3 или 5 мкдм3 раствора массовой концентрации 0,04 мг/см3) и экстракт премикса после центрифугирования. По времени выхода определяют пик витамина B_{5} в экстракте и измеряют высоту пика как расстояние от вершины пика до линии, проведенной в основании пика (Приложение Г, рисунок Г.1). Измеряя и сравнивая высоты пиков на хроматограммах, вычисляют содержание витамина B_{5} в премиксах.
9.2.3.3 Обработка результатов испытания
Содержание витамина B_{5} , X в премиксе, г/кг, вычисляют по формуле
где c_{\text{ст}} — концентрация витамина B_{5} в рабочем стандартном растворе, мг/см3;
h_{\text{х}} — высота пика витамина B_{5} на хроматограмме испытуемого раствора, мм;
V — общий объем экстракта, см3;
h_{\text{ст}} — высота пика витамина B_{5} на хроматограмме рабочего стандартного раствора, мм;
Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15%.
10. ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1. Работы с концентрированными кислотами, щелочами и др. летучими веществами должны проводиться в вытяжном шкафу.
10.2. Необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с электроприборами.
ХРОМАТОГРАММА ЭКСТРАКТА ВИТАМИНА B_{5} ИЗ ПРЕМИКСА
Рисунок В.1. Хроматограмма экстракта витамина B_{5} из премикса
ХРОМАТОГРАММЫ РАСТВОРОВ ВИТАМИНА B_{5}
Рисунок Г.1. Хроматограммы: а — стандартного раствора;
б — экстракта из премикса
1. ТУ 6-09-402-87 2-пропанол (изопропиловый спирт) химически чистый
2. ТУ 6-09-11-2021-87 Триметиламин
3. ТУ 6-09-1678-86 Фильтры обеззоленные (белая, красная, синяя ленты)
4. МРТУ 6-09-2437-65 Триэтиламин
5. ТУ 6-09-08-944-83 Рейнекат аммония
6. ТУ 6-09-53-60-87 Фенолфталеин (индикатор)
7. ТУ 6-09-06-1092-83 Ацетонитрил. Технические условия
8. ТУ 25-7416-0171-88 pH-метр типа pH-155
9. ГФ СССР-X ст. 149 Хининсульфат
10. ГФ СССР-X ст. 147 Хинингидрохлорид
11. ГФ СССР-X ст. 585 Рибофлавин (витамин B_{2} )
12. ГФ СССР-X ст. 19 Никотиновая кислота (витамин B_{5} )
13. МРТУ 6-09-105-62 Тетрабутиламмоний бромистый
14. МРТУ 6-09-5351-68 Тетрабутиламмоний хлористый
15. ТУ 25-1894.003-90 Секундомер СОС ПР-2А-3-000
16. ГФ СССР-X ст. 673 Тиаминбромид
17. ГФ СССР-X ст. 674 Тиаминхлорид
18. ГФ X ст. 42-1997-93 Холинхлорид
------------------------------------------------------------------