МУК 4.2.2008-05. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Пищевые продукты и пищевые добавки. Метод идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 17.10.2005)

17 октября 2005 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ

МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ (ГМО) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

с момента утверждения

1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян — руководитель, Е.Ю. Сорокина, О.Н. Чернышева, Н.А. Кашина); ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзор России (Т.В. Воронцова, Т.Н. Потапова); Инновационная корпорация «Биозащита» (И.В. Панкин).

2. Рекомендован к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г. Онищенко 17 октября 2005 г.

4. Введены впервые.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания подготовлены для идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (далее — ГМО) растительного происхождения в пищевых продуктах с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе и его последующей обработки на аппаратно-программном комплексе «ДЕГМИГЕН-001».

1.2. Методические указания разработаны в соответствии с Федеральным законом от 30.03.1999 № 52-ФЗ (в редакции от 09.05.2005 № 45-ФЗ) «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения», Законом Российской Федерации от 07.02.1992 № 2300-1 (в редакции от 21.12.2004 № 171-ФЗ) «О защите прав потребителей», Постановления Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 № 322 «Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека», Постановления Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 № 569 «О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации», Постановления Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 № 554 (в редакции от 15.09.2005 № 569) «Об утверждении Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании».

1.3. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также других испытательных лабораторий, аккредитованных в порядке, установленном Правительством Российской Федерации.

1.4. Методические указания разработаны для одновременного определения в одном лабораторном испытании пяти различных маркеров рекомбинантной ДНК при проведении скрининга с целью выявления ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах, в том числе в продовольственном сырье.

2. Общие положения

Методические указания содержат описание метода определения ГМО

растительного происхождения в пищевых продуктах с  помощью  набора
реагентов  для  выявления  и   идентификации   ГМО   растительного
происхождения с применением ферментного анализа  на  биологическом
микрочипе. Метод основан на  идентификации  рекомбинантной  ДНК  с
использованием метода  асимметричной  мультиплексной  полимеразной
цепной  реакции  (далее  -  амПЦР)  и  последующей   гибридизацией
продуктов  этой  амПЦР  с  применением  ферментного   анализа   на
биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает  наличие
или отсутствие в  анализируемой  пробе  не  менее  пяти  различных
рекомбинантных последовательностей ДНК: трех регуляторных  (35  S,
nos и ocs) и двух селективных  (gus,  nptII).  Идентификация  этих
последовательностей позволяет проводить  предварительную  проверку
пищевых продуктов  на  наличие  ГМО  растительного  происхождения.

                                 -12

Чувствительность метода — не менее 10 г (1пг) ДНК.

3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы

3.1 Аппаратура и инструменты.

3.1.1. Амплификатор ДНК типа «Терцик-мс-2» под микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2, 0,5 куб. см со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с ТУ 9642-001-4648062-98.

3.1.2. Комплекс аппаратно-программный для анализа биологических микрочипов типа «ДЕГМИГЕН-001» ТУ 9443-001-02699501-2003.

3.1.3. Компьютерная программа «Аrrа» для анализа изображений, полученных с помощью комплекса «ДЕГМИГЕН-001».

3.1.4. Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами ТУ 4320-002-71321417-2004 (Приложение 1 А).

3.1.5. Термостат суховоздушный типа ТВ3-25 с рабочей температурой 42 °С, рабочий диапазон от 20 °С до 60 °С, точность поддержания температуры +/- 1 °С ТУ 42-61961.

3.1.6. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-01 2-го класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +/- 0,0001 г.

3.1.7. Термостат типа «TERMO 24-15» под пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120 °С, количество гнезд — не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры — 0,2 °С, разность температур между соседними ячейками — не более 0,5.

3.1.8. Камера морозильная по ГОСТ 26678-85, обеспечивающая температуру минус 20 °С.

3.1.9 Холодильник бытовой по ГОСТ 26678-85.

3.1.10 Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф с частотой

                        -1

вращения не менее 13000 мин.

3.1.11 Аппарат для встряхивания типа «Вортекс», скорость

                    -1

вращения 250 — 3000 мин. .

3.1.12. Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72.

3.1.13. Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5 — 10,0 куб. мм (шаг — 0,1 куб. мм, точность +/- 2,5% — 10,0%, воспроизводимость 3% — 7%); 0,5 — 50,0 куб. мм (шаг — 0,5 куб. мм, точность +/- 2,0% — 5,0%, воспроизводимость 2,5% — 5%); 20,0 — 200,0 куб. мм (шаг — 1,0 куб. мм, точность +/- 1,5% — 2,0%, воспроизводимость 2% — 3%); 100 — 1000 куб. мм (шаг — 5 куб. мм, точность +/- 1,0% — 1,5%, воспроизводимость 1% — 2%); 2000 — 10000 куб. мм (шаг — 10 куб. мм, воспроизводимость 1% — 2%).

3.1.14. Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 ТУ 16-535-84 или других видов.

Примечание: Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с аналогичными техническими характеристиками, разрешенных для применения в установленном порядке.

3.2 Лабораторная посуда и материалы.

3.2.1. Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76.

3.2.2. Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82. Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 куб. см, ГОСТ 12738-77.

3.2.3 Чашки Петри по ГОСТ 25336-82.

3.2.4. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100, 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

3.2.5. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 куб. см.

3.2.6. Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000; 10000 куб. мм.

3.3 Реактивы и реагенты.

3.3.1 Додецилсульфат натрия (SDS).

3.3.2 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77.

3.3.3. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х.ч. ТУ 6-09-11-1721-83.

3.3.4. Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА). Корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № В 4287.

3.3.5 Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-00.

3.3.6 Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.

3.3.7 Вода деионизованная ОСТ 11.029.003-80.

3.3.8. 3%-ный раствор пероксида водорода.

Примечание: Допускается использование других реактивов с аналогичными техническими характеристиками; препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.

3.3.9. Набор реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного происхождения на биологическом микрочипе состоит из набора для выделения ДНК, набора для проведения амПЦР и набора для ДНК гибридизации и ферментного анализа. Наборы рассчитаны на сто реакций.

3.3.10. Набор реагентов для пробоподготовки (бисер — 30 г, лизирующий реагент — 60 куб. см (2 флакона), сорбент — 2 куб. см (2 пробирки), солевой буфер (10-кратный) — 10 куб. см, экстракционный раствор — 10 куб. см) ТУ 2643-003-71321417-2004. Порядок приготовления рабочего раствора солевого буфера описан в 4.1. Остальные реагенты готовы к использованию.

3.3.11. Набор реагентов для амПЦР ТУ 2643-003-71321417-2004 (включает в себя: сухие смеси реагентов (100 пробирок, каждая пробирка содержит Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед., 200 мкМ и 2,5 мМ, а также оптимизированную буферную систему для проведения одной стандартной ПЦР); растворитель; минеральное масло; «+» контроль амплификации — 1 пробирка, 0,5 куб. см, праймеры на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:

• 35S_п 5' CGG СТА СТС CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT ТТС AGA AGA (39 н.о.);
• 35S_o* 5' CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG A (40 н.о.);

праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:

• gus_ 5' АСС GTA ССТ CGC АТТ АСС СТТ ACG CTG AAG AGA (33 н.о.);
• gus_o* 5' TGC CCG СТТ CGA AAC CAA TGC СТА AAG AGA (30 н.о.);

праймеры на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

• nos_п 5' GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG АСА GA (32 н.о.);
• nos_o* 5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35 н.о.);

праймеры на маркерный ген nptII из транспозона Тn5 бактериального происхождения:

• npt_п 5' GTG АСС CAT GGC GAT GCC TGC TTG С (25 н.о.);
• npt_o* 5' АСС CAG CCG GCC АСА GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.);

праймеры на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

• ocs_п 5' AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC СТА ААА GA (32 н.о.);
• ocs_o* 5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32 н.о.).

Праймеры расфасованы в 10 пробирках по 0,5 куб. см.

Примечание: 35S_п; gus_п; nos_п; nptII_п; ocs_п — обозначают прямые праймеры; 35S_o*; gus_o*; nos_o; nptII_o*; ocs_o* — обозначают обратные праймеры, меченные биотином; н.о. — нуклеотидные остатки.

3.3.12. Набор реагентов для ДНК гибридизации и ферментного анализа ТУ 2643-003-71321417-2004: 20xSSC — 50 куб. см; диаминобензидин (ДАБ) — 100 таблеток; конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином — 0,1 куб. см с концентрацией 1 мг/куб. см, 1 пробирка.

Примечание: Срок годности набора реагентов — 12 месяцев со дня изготовления. Основную часть реагентов, упакованную в картонную коробку, хранят в сухом темном месте при температуре от +2 °С до +8 °С. В отдельных пластиковых пакетах при температуре -20 °С хранят праймеры, положительный контроль и конъюгат стрептавидин-пероксидазы.

4. Подготовка к анализу. Приготовление растворов

4.1 Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).

В мерной колбе на 100 куб. см растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 куб. см дистиллированной воды. Раствором 30%-ной гидроокиси довести рН раствора до 8,0, дистиллированной водой — объем раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до года.

4.2 Приготовление 10%-ного раствора SDS.

Растворить 10 г SDS в 90 куб. см дистиллированной воды. Хранить при комнатной температуре не более 1 года.

4.3 Приготовление рабочего раствора солевого буфера.

Содержимое флакона с 10-кратным солевым буфером (10 куб. см) (из набора реагентов) перенести из флакона в цилиндр, довести бидистиллированной водой до отметки 100 куб. см и 96%-ным этиловым спиртом — до отметки 300 куб. см и перемешать. Рабочий раствор солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4 °С.

5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа

Отбор проб проводят по государственным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции: ГОСТ 5904-82, 9163-90, 12292-00, 10852-86, 12430-66, 13979-86, 26313-84, 22617.0-77, 27668-88, 26312-84, 9792-73, 7631-85, 12036-85, 51447-99, 135869.3-86, 13440-89, 17109-88, 19341-73, 26809-86, 27668-88, 27853-88, 28741-90, 29142-91, 13634-90, 15877-70, 17110-71, 17109-88, ГОСТ Р 50436-92, 50437-92, 51926-02, ГОСТ Р ИСО 2170-97.

6. Проведение анализа. Выделение ДНК

6.1. В одноразовые центрифужные пробирки типа eppendorf на 1,5 куб. см внести 300 мг бисера и 70 — 80 мг анализируемого материала. Добавить 0,5 мл 5 мМ Na2-cоль ЭДТА и термостатировать при 65 °С в течение 30 — 60 мин. Время инкубации составляет 30 минут для процессированных продуктов (мука, чипсы, детское питание и др.) и до 60 мин. для зерна. Через каждые 10 — 15 минут гомогенизировать пробу срезанным наконечником (для каждой пробы использовать индивидуальный наконечник).

6.2. К содержимому пробирки добавить 400 куб. мм лизирующего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до максимально однородного состояния. Пробу термостатировать при 65 °С 60 — 120 мин.

6.3. После термостатирования пробу, при необходимости, еще раз гомогенизировать, добавить 500 куб. мм бидистиллированной воды и перемешать на вортексе.

6.4. Центрифугировать пробу 1 мин. при 5000 g (12000 об./мин.). Прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку.

6.5. Добавить 20 куб. мм сорбента из набора реагентов (перед использованием сорбент следует интенсивно встряхнуть на вортексе). Пробирку поместить на ротатор и перемешивать на вортексе 10 минут (10 — 20 об./мин.).

6.6 Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.

6.7. Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант. К осадку добавить 200 куб. мм лизирующего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до однородного состояния. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.

6.8. Удалить супернатант. К осадку добавить 1 куб. см рабочего раствора солевого буфера из набора реагентов, перемешать содержимое пробирки переворачиванием 5 — 10 раз. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.

6.9 Удалить супернатант не задевая осадка.

6.10. К осадку добавить 1 куб. см рабочего раствора солевого буфера, перемешать на вортексе, центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g и осторожно удалить супернатант.

6.11 Повторить предыдущий пункт еще раз.

6.12 Подсушить осадок при 65 °С в течение 4 — 5 минут.

6.13. К осадку добавить 50 куб. мм экстракционного раствора из набора реагентов. Отбор раствора из исходного флакона проводить при постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок гранул ионообменной смолы.

6.14. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5 — 10 секунд до гомогенного состояния, затем термостатировать 10 минут при 65 °С.

6.15. Еще раз суспендировать пробу на вортексе, центрифугировать 1 мин. при 5000 g.

6.16. Супернатант, содержащий очищенную ДНК, перенести в чистую пробирку и хранить при -20 °С до проведения ПЦР анализа. При отборе раствора ДНК необходимо избегать захвата осадка, содержащего сорбент.

Примечание: Кроме описанного выше сорбционного метода выделения ДНК, возможно использование метода выделения с помощью СТАВ (гексадецилтриметиламмониум бромид), описанного в методических указаниях по определению генетически модифицированных источников в продуктах питания растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции (МУК 4.2.1902-04 «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции»).

7. Амплификация

7.1. Перед проведением реакции вынуть из холодильника необходимое количество микропробирок с сухими реагентами из набора реагентов. Промаркировать соответствующим образом: «-» контроль», «исследуемые пробы», «+» контроль».

7.2 Добавить во все пробирки по 5 куб. мм праймеров.

7.3 Добавить во все пробирки по 10 куб. мм растворителя.

7.4. В пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить 5 куб. мм бидистиллированной воды. В опытные пробирки добавить по 5 куб. мм исследуемой ДНК. В пробирку с положительным контролем добавить 5 куб. мм раствора контрольной ДНК.

7.5. Добавить во все пробирки по 20 куб. мм минерального масла (масло не используется в случае, если амплификатор имеет термостатируемую крышку).

7.6. Подготовленные для проведения реакции пробирки перенести в термоблок программируемого термостата и запустить программу амплификации в соответствии с режимами, приведенными в таблице 1.

Таблица 1

ПРОГРАММА ПРОВЕДЕНИЯ АМПЦР

Шаг программы	Температура °С	Время инкубации, сек.	Количество циклов
1.	94	180	1
2.	94	30	42
3.	62,5	30
4.	72	180	1

Примечание: Для пипетирования жидкостей без примесей рекомбинантной ДНК (праймеры, растворитель, вода) необходимо иметь отдельный комплект микродозаторов, не используемых при пробоподготовке или работах с ДНК-содержащими препаратами. При подготовке смесей для проведения амПЦР каждую пробирку открывают только перед отбором или внесением проб, а по окончании манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микропробирок с пробами и оставлять их открытыми на длительное время.

7.7. После завершения реакции микропробирки необходимо передать в помещение, в котором будет проводиться гибридизация. Отбор пробы для гибридизации проводится из-под слоя минерального масла, в случае его использования.

7.8. Подготовка проб для амПЦР и их гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе в одном помещении не допускается. Реакционные смеси после амплификации содержат в высоких концентрациях фрагменты ДНК, контаминация которыми помещений, оборудования и реактивов может привести к получению ложноположительных результатов.

8. Проведение ДНК гибридизации

8.1. Приготовить рабочие разведения раствора 20xSSC (3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,4): 2xSSC, 0,l% SDS; 0,lxSSC; 0,lxSSC, 0,1% SDS; 0,01xSSC. Для приготовления 100 куб. см раствора можно воспользоваться таблицей 2.

Таблица 2

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ SSC

Раствор	20хSSC	10%-ный SDS	Н О дист. 2
2xSSC, 0,1% SDS	10 куб. см	1 куб. см	89 куб. см
0,1хSSC	0,5 куб. см	-	99,5 куб. см
0,1xSSC, 0,1% SDS	0,5 куб. см	1 куб. см	98,5 куб. см
0,01хSSC	0,05 куб. см	-	99,95 куб. см

8.2. Микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать 1 — 2 секунды для сбора пробы на дне пробирки и держать далее только в вертикальном положении. Добавить в каждую микропробирку 5 куб. мм 20хSSC и 0,2 куб. мм 10% SDS, перемешать и центрифугировать 1 — 2 секунды. Распределить полученную смесь по поверхности микрочипа, содержащей зоны иммобилизованных олигонуклеотидов.

8.3. Поместить микрочип во влажную камеру (например, в чашку Петри со смоченным дистиллированной водой бумажным фильтром) и поставить на 1 час в воздушный термостат с температурой 42 °С.

8.4. По окончании реакции капли смыть буфером 2хSSC, 0,1% SDS и затем тщательно промыть чип следующими растворами:

• 2xSSC, 0,l% SDS — 1 раз 5 минут;
• 0,1хSSC, 0,1% SDS — 2 раза по 5 минут;
• 0,1хSSC — 5 раз по 1 минуте;
• 0,01хSSC в течение 10 секунд.

9. Проведение ферментного анализа

9.1. Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200 раз буфером 1хSSC, содержащим 1% BSA (бычий сывороточный альбумин), из расчета 25 куб. мм на микрочип. Например, необходимо проанализировать 5 микрочипов. Для этого потребуется 25 х 5 = 125 куб. мм раствора конъюгата. Готовят с небольшим избытком, 150 куб. мм раствора. Для этого 1,5 мг BSA растворяют в 150 куб. мм 1хSSC, а затем добавляют 0,75 куб. мм исходного конъюгата.

9.2. Нанести 25 — 30 куб. мм разведенного конъюгата на рабочую зону микрочипа и поместить его на 30 минут во влажную камеру при комнатной температуре.

9.3 Смыть конъюгат раствором 1хSSC.

9.4 Залить микрочип раствором 2xSSC и промыть 5 минут.

9.5 Промыть микрочип раствором 1хSSC.

9.6. Непосредственно перед применением приготовить раствор субстрата — диаминобензидина (ДАБ). Для этого растворить таблетку ДАБ в 1 куб. см буфера 0,1хSSC, добавить 30 куб. мм 3%-ного раствора пероксида водорода и перемешать. Раствор использовать немедленно.

9.7. Залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата и выдержать от 2 до 10 минут при комнатной температуре. В случае положительной реакции появляются коричневые пятна окисленного субстрата.

9.8. Промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли воды и поместить в термостат 42 °С на 5 — 10 минут. После сушки микрочип с окрашенными зонами необходимо хранить в темном месте.

10. Сканирование биологических микрочипов

10.1. В соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым в комплекте с аппаратно-программным комплексом «ДЕГМИГЕН-001», подготовить сканер микрочипов к работе.

10.2. Поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать его и закрыть рамку.

10.3. Запустить программу сканирования, функционирующую в диалоговом режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к сканированию и только после этого вставить рамку с микрочипом в приемное окно детектора.

10.4. После завершения сканирования микрочипа необходимо сохранить изображение (Приложение 1 Б), присвоив файлу соответствующее имя.

10.5. Для завершения работы с программой сканирования следует нажать в диалоговом окне клавишу «ВЫХОД».

11. Анализ изображений биочипов

11.1 Запустить программу обработки изображения микрочипа «Аrrа».

11.2. Ввести оцифрованное изображение в программу, для этого нужно выбрать опцию меню «Файл», и затем открыть изображение. В появившемся диалоговом окне выбрать формат, в котором представлены изображения, и выбрать в списке нужный файл, после чего изображение появится в основном окне программы.

11.3. Провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого выбрать опцию меню «Анализ» и затем — «Разметка матрицы». Разметка начинается с рисования прямоугольника, боковые стороны которого проходят через центры узлов крайних столбцов. Для этого нужно щелкнуть левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки. Затем, держа кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину появившегося прямоугольника в центр нижнего правого узла.

11.4. В результате предварительной разметки на экране появится четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно, в соответствии с заданным числом столбцов матрицы.

11.5. Чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно нажать клавишу «Принять».

11.6. После завершения базовой разметки проводят автоматическую коррекцию положения зондов. Для этого в меню выбирается опция «Настройки/Автоматическая подстройка».

11.7. Для анализа результатов нужно выбрать опцию меню «Анализ» — «Показать результаты».

11.8. По окончании измерений программа предоставляет возможность подготовки и распечатки протокола испытаний (Приложение 2). Для этого нужно выбрать опцию меню «Файл» и затем — «Заполнить протокол». После этого появится окно с формой для заполнения. После того как она будет заполнена, нажать кнопку «Выход».

12. Интерпретация результатов

12.1. Появление регистрируемого компьютерной программой Аrrа оптического сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах гибридизации, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии ГМО растительного происхождения в анализируемом образце (пробе).

12.2. Отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на не содержание рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о том, что анализируемый образец (проба) не имеет ГМО растительного происхождения.

12.3. Появление оптического сигнала в зоне гибридизации при использовании отрицательного контроля амплификации, свидетельствует о получении ложноположительного результата. Причиной может быть загрязнение реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1 H соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.

12.4. Отсутствие оптического сигнала при использовании положительного контроля амплификации свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.

13. Организация рабочих мест

Организация рабочих мест для проведения исследований, описанных в настоящих методических указаниях, проводится в соответствии с МУК 4.2.1902-04 «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции».

Приложение 1

НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ

А

┌─────────────────────────────────────────────────┬──────────────┐
<pre class="legal-pre">│     35S      gus      nos     nрtII     ocs     │     М.П.     │
│                                                 │              │
│    ┌────┐   ┌────┐   ┌────┐   ┌────┐   ┌────┐   │              │
│    │    │   │    │   │    │   │    │   │    │   │              │
│    └────┘   └────┘   └────┘   └────┘   └────┘   │              │
│    ┌────┐   ┌────┐                              │              │
│    │K(-)│   │K(-)│                              │              │
│    └────┘   └────┘                              │              │
│    ┌────┐   ┌────┐   ┌────┐   ┌────┐   ┌────┐   │              │
│    │K(+)│   │K(+)│   │K(+)│   │K(+)│   │K(+)│   │              │
│    └────┘   └────┘   └────┘   └────┘   └────┘   │              │
│                                                 │              │</pre>
└─────────────────────────────────────────────────┴──────────────┘

Б

┌─────────────────────────────────────────────────┬──────────────┐
<pre class="legal-pre">│     35S      gus      nos     nрtII     ocs     │     М.П.     │
│                                                 │              │
│    ┌────┐            ┌────┐                     │              │
│ ОП │    │            │    │                     │              │
│    └────┘            └────┘                     │              │
│                                                 │              │
│ К-                                              │              │
│                                                 │              │
│    ┌────┐   ┌────┐   ┌────┐   ┌────┐   ┌────┐   │              │
│ К+ │    │   │    │   │    │   │    │   │    │   │              │
│    └────┘   └────┘   └────┘   └────┘   └────┘   │              │
│                                                 │              │</pre>
└─────────────────────────────────────────────────┴──────────────┘

А — схема негелевого биологического микрочипа для идентификации ГМИ растительного происхождения;

Б — гибридизационная картина на экране компьютера, полученная в результате анализа генетически модифицированной сои, содержащей промотор 35S и терминатор nos.

Приложение 2

АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ

ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ Серия АБ № 0000000 N _________ от «__» __________ 200_ г.

Продукция ____________________________________________________
Производитель сырья или продукции ____________________________
Предъявитель сырья или продукции _____________________________
Отбор проб произведен в соответствии с нормативным документом
на соответствующую группу сырья или продукции ________________
Акт отбора проб и техническое задание на испытания N __ от ___
Испытания проведены на основании требований
Номер образца ________________________________________________

    Характеристика   испытуемого    образца    (маркировка,  вид и
    состояние  упаковки,  этикетки,   штрих-кода)

в образцах N ____ отсутствует, а в образце N ____ присутствует
Маркировка: __________________________________________________
Годен до ________________ Штриховой код ______________________

Результаты испытаний

Номер образца	Трансгенные последовательности
	35S	gus	nos	nptII	ocs

Результаты анализа ___________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ Исполнители:

    _____________________                  _____________________
          (подпись)                              (подпись)
    _____________________                  _____________________
          (подпись)                              (подпись)

Руководитель испытательной лаборатории _______________________
                                              (подпись)

        М.П.                           _______________________
                                         (Фамилия, инициалы)

Заключение распространяется на образец, представленный на испытания.

НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ (в редакции от 09.05.2005 № 45-ФЗ) «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2. Закон Российской Федерации от 07.02.1992 № 2300-1 (в редакции от 21.12.2004 № 171) «О защите прав потребителей».

3. Постановление Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 № 554 (в редакции от 15.09.2005 № 569) «Об утверждении Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании».

4. Постановление Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 № 569 «О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации».

5. Постановление Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 № 322 «Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека».

6. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 08.11.2000 № 14 «О порядке проведения санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников».

7. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31.12.2004 № 13 «Об усилении надзора за пищевыми продуктами, полученными из ГМИ».

8. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Продовольственное сырье и пищевые продукты. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

9. ГОСТ 5904-82с «Изделия кондитерские. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб».

10. ГОСТ 9163-90 «Консервы мясные и мясорастительные „Сосиски“. Технические условия».

11. ГОСТ 12292-2000 «Консервы рыбные с растительными гарнирами. Технические условия».

12. ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».

13. ГОСТ 12430-66 «Продукция сельскохозяйственная. Методы отбора проб при карантинном досмотре и экспертизе».

14. ГОСТ 26313-84 «Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб».

15. ГОСТ 22617.0-77 «Семена сахарной свеклы. Правила приемки и методы отбора проб».

16. ГОСТ 27668-88 «Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб».

17. ГОСТ 26312.1-84 «Крупа. Правила приемки и методы отбора проб».

18. ГОСТ 9792-73 «Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб».

19. ГОСТ 7631-85 «Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний».

20. ГОСТ 12036-85 «Семена сельскохозяйственных культур. Правила приемки и методы отбора проб».

21. ГОСТ Р 51447-99 «Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб».

22. ГОСТ 17109-88 «Соя. Требования при заготовках и поставках».

23. ГОСТ 19341-73 «Консервы рыбные. Печень рыб с растительными добавками. Технические условия».

24. ГОСТ 26809-86 «Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу».

25. ГОСТ 27668-88 «Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб».

26. ГОСТ 27853-88 «Овощи соленые и квашеные, плоды и ягоды моченые. Приемка, отбор проб».

27. ГОСТ 28741-90 «Продукты питания из картофеля. Приемка, подготовка проб и методы испытаний».

28. ГОСТ 29142-91 «Семена масличных культур. Отбор проб».

29. ГОСТ 13634-90 «Кукуруза. Требования при заготовках и поставках».

30. ГОСТ 15877-70 «Кукуруза сахарная консервированная. Технические условия».

31. ГОСТ 17110-71 «Соя (промышленное сырье). Требования при поставках. Технические условия».

32. ГОСТ 17109-88 «Соя. Требования при заготовках и поставках».

---