МУК 4.1.2996-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флуопирама в плодовых семечковых (яблоня, груша), плодовых косточковых (персик, нектарин, абрикос, вишня, слива), ягодах (клубника), томатах, перце, огурцах, бананах, винограде, виноградном соке, орехах методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 19.03.2012)
Примечание
Документ введен в действие с 19.03.2012.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
19 марта 2012 года
с момента утверждения
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЛУОПИРАМА В ПЛОДОВЫХ СЕМЕЧКОВЫХ (ЯБЛОНЯ, ГРУША), ПЛОДОВЫХ КОСТОЧКОВЫХ (ПЕРСИК, НЕКТАРИН, АБРИКОС, ВИШНЯ, СЛИВА), ЯГОДАХ (КЛУБНИКА), ТОМАТАХ, ПЕРЦЕ, ОГУРЦАХ, БАНАНАХ, ВИНОГРАДЕ, ВИНОГРАДНОМ СОКЕ, ОРЕХАХ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2996-12
Свидетельство об аттестации МВИ от 25.11.2011 № 0108.25.11.11.
Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения остаточных количеств флуопирама в плодовых семечковых (яблоня, груша), плодовых косточковых (персик, нектарин, абрикос, вишня, слива), ягодах (клубника), томатах, перце, огурцах, бананах, винограде, виноградном соке, орехах в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг.
Название вещества по ИСО: флуопирам.
Название вещества по ИЮПАК: {}^{N -}{^{2 - [3 - \text{хлор} - 5(\text{трифторметил}) - 2 - \text{пиридил}]\text{этил}}}^{- \alpha,\alpha,\alpha - \text{трифтор} - \text{о} - \text{толуамид}} .
Эмпирическая формула: C_{16}H_{11}ClF_{6}N_{2}O .
Белое кристаллическое вещество без запаха. Плотность 1,53 (при 20 °C). Температура плавления: 117,5 °C. Давление паров: 3,1 \times 10^{- 3}\text{мПа} (при 25 °C). Растворимость в органических растворителях при 20 °C (г/дм3): ацетон — > 250; диметилсульфоксид — > 250; дихлорметан — > 250; н-гептан — 0,66; метанол — > 250; толуол — 62,2; этилацетат — > 250. Растворимость в воде при 20 °C (мг/дм3): 16,0. Коэффициент распределения н-октанол/вода K_{ow}logP = 3,3 (40 °C). Стабилен в водной среде при pH 4 — 9. pK_{a} = 0,5 при 23 °C.
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность (LD_{50}) для крыс — > 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD_{50}) для крыс — > 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC_{50}) для крыс — > 5112 мг/дм3 (4 ч).
Флуопирам — системный фунгицид широкого спектра действия, относится к классу пиридинэтиланилидов, эффективен против поверхностной и внутренней семенной инфекции, защищает проростки от плесневения, почвенных патогенов и аэрогенной инфекции.
1. Погрешность измерений
При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости сигма , % r | Предел повторяемости r, % | Предел воспроизводимости R, % |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Плодовые семечковые | от 0,01 до 0,1 вкл. | 50 | 3,5 | 14 | 20 |
| Плодовые косточковые | от 0,01 до 0,1 вкл. | 50 | 3,1 | 12 | 17 |
| Ягоды (клубника) | от 0,01 до 0,1 вкл. | 50 | 3,7 | 14 | 20 |
| Томаты | от 0,01 до 0,1 вкл. | 50 | 2,9 | 11 | 15 |
| Перец | от 0,01 до 0,1 вкл. | 50 | 3,2 | 12 | 17 |
| Огурцы | от 0,01 до 0,1 вкл. | 50 | 3,2 | 12 | 17 |
| Бананы | от 0,01 до 0,1 вкл. | 50 | 3,7 | 14 | 20 |
| Виноград | от 0,01 до 0,1 вкл. | 50 | 2,9 | 11 | 20 |
| Виноградный сок | от 0,01 до 0,1 вкл. | 50 | 2,7 | 10 | 14 |
| Орехи | от 0,01 до 0,1 вкл. | 50 | 3,3 | 13 | 18 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| предел обнаружения, мг/кг | диапазон определяемых концентраций, мг/кг | полнота извлечения вещества, % | стандартное отклонение S, % | доверительный интервал среднего результата +/-, % | |
| Плодовые семечковые | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 89,0 | 3,4 | 1,8 |
| Плодовые косточковые | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 88,8 | 3,1 | 1,6 |
| Ягоды (клубника) | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 88,1 | 3,6 | 1,9 |
| Томаты | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 87,0 | 2,7 | 1,4 |
| Перец | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 87,4 | 2,9 | 1,6 |
| Огурцы | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 87,3 | 2,8 | 1,5 |
| Бананы | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 87,2 | 3,4 | 1,8 |
| Виноград | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 87,1 | 2,6 | 1,4 |
| Виноградный сок | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 86,9 | 2,5 | 1,3 |
| Орехи | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 85,5 | 3,1 | 1,7 |
2. Метод измерений
Методика основана на определении флуопирама с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с электронозахватным детектором (ЭЗД) после экстракции из анализируемых проб смесью ацетонитрил — вода, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с флоризилом. Пробы орехов дополнительно очищают окислением экстракта в щелочной среде.
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
3.1 Средства измерений
Газовый хроматограф «Кристалл-2000М», снабженный электронозахватным детекторам с пределом детектирования по линдану 5 \times 10^{- 14}\text{г}/\text{с} , предназначенный для работы с капиллярной колонкой Номер в Госреестре СИ 14516-08
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-01
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,005 г ГОСТ 24104-01
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 100, 200, 250, 500 и 1000 см3 ГОСТ 1770-74
Микропипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 0,1 см3 ГОСТ 29227-91
Микрошприц SGE-Cromatec вместимостью 10 мм3 Номер в Госреестре СИ 39206-08
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см3 ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100 и 250 см3 ГОСТ 1770-74
Примечание. Допускается использование средств измерений иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
Флуопирам, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 99,4%, аттестованное значение погрешности +/- 1% (CAS No 658066-35-4)
Азот, осч (99,999%), из баллона ГОСТ 9293-74
Ацетонитрил, осч «УФ-210 нм» ТУ 6-09-14-2167-84
Вода для лабораторного анализа (деионизованная, бидистиллированная) ГОСТ Р 52501-05
Калий марганцовокислый (перманганат калия) ГОСТ 20490-75
Калий углекислый (калия карбонат, поташ) безводный ГОСТ 4221-76
Кальций хлористый (хлорид), насыщенный водный раствор ГОСТ 450-77
Кислота серная (концентрированная), хч ГОСТ 4204-77
Метилен хлористый (дихлорметан), хч ГОСТ 12794-84
Натрий серно-кислый (сульфат) безводный, хч ГОСТ 4166-78
Натрий углекислый (карбонат), хч ГОСТ 83-79
Натрий хлористый (хлорид), хч, насыщенный водный раствор ГОСТ 4233-77
н-Гексан, хч ТУ 6-09-06-657-84
Флоризил, для колоночной хроматографии (60 — 100 меш) фирм «SERVA», «MERK» (Германия) или аналогичный
Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид фосфора) ТУ 6-09-7173-85
Этиловый эфир уксусной кислоты ректификованный (этилацетат) ГОСТ 22300-76
Примечание. Возможно использование реактивов иных производителей более высокой квалификации, которые не требуют выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).
3.3 Вспомогательные устройства, материалы
Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с или орбитальный шейкер OS-10, диапазон регулировки оборотов 50 — 200 об./мин, орбита до 10 мм ТУ 64-1-2851-78
Барометр-анероид с диапазоном измерений от 79,5 до 106,5 и ценой деления 0,1 кПа типа М-98 ТУ 25-11-1316-76
Бумажные фильтры «красная лента» обеззоленные или фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ ТУ 2642-001-05015242-07
Воронки делительные вместимостью 100 и 250 см3 ГОСТ 9737-93
Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм ГОСТ 25336-82
Гигрометр с диапазоном измерений относительной
влажности от 30 до 90% типа ВИТ-2 ТУ 25-11-1645-84 Груша резиновая ТУ 9398-005-0576-9082-03
Колбы плоскодонные вместимостью 100, 250, 400 — 500 см3 ГОСТ 9737-93
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 100, 150 и 250 см3 ГОСТ 9737-93
Колонка стеклянная для препаративной хроматографии длиной 25 см, внутренним диаметром 10 — 12 мм
Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 25336-82
Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 30
Ротационный вакуумный испаритель B-169 фирмы Buchi, Швейцария
Стаканы химические с носиком вместимостью 100, 150 и 250 см3 ГОСТ 25336-82
Термометр с диапазоном измерений от 0 до 55 °C и ценой деления 0,1 °C ГОСТ 28498-90
Установка для перегонки растворителей
Хроматографическая колонка капиллярная НР-35 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм
Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений и устройств иных производителей, технические характеристики которых не уступают указанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.
4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением», ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе, освоивших данную методику и подтвердивших экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности по п. 13.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов и раствора внесения, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для экстракции и очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с флоризилом, проверка хроматографического поведения флуопирама на ней.
7.1 Очистка органических растворителей
7.1.1 Гексан
Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над безводным карбонатом калия.
7.1.2 Этилацетат
7.1.2.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.
7.1.2.2. Очистка растворителей. Растворитель промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.
7.1.3 Ацетонитрил
Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм3 ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм3 ацетонитрила 10 г карбоната калия).
7.1.4 Ацетон
Ацетон перегоняют над небольшим количеством KMnO_{4} и безводным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.
7.2 Приготовление градуировочных растворов и раствора внесения
7.2.1. Исходный раствор флуопирама для градуировки (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,01 г флуопирама, растворяют в 50 — 60 см3 этилацетата, доводят этилацетатом до метки, тщательно перемешивают.
Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °C в течение месяца.
7.2.2. Раствор № 1 флуопирама для градуировки (концентрация 5,0 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 5,0 см3 исходного раствора флуопирама с концентрацией 100 мкг/см3 (п. 7.2.1), разбавляют этилацетатом до метки.
Градуировочный раствор № 1 хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °C в течение месяца.
7.2.3. Рабочие растворы № 2 — 5 флуопирама для градуировки (концентрация 0,005 — 0,05 мкг/см3). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см3 градуировочного раствора № 1 с концентрацией 5,0 мкг/см3 (п. 7.2.2), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрациями флуопирама 0,005; 0,01; 0,025 и 0,05 мкг/см3.
Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °C в течение 14 дней.
7.2.4. Рабочий раствор № 6 флуопирама для внесения (концентрация 0,5 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10,0 см3 градуировочного раствора № 1 с концентрацией 5,0 мкг/см3 (п. 7.2.2), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор № 6 с концентрацией флуопирама 0,5 мкг/см3.
Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °C в течение 14 дней.
Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено — найдено» и контроля качества результатов измерений методом добавок.
7.3 Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика (\text{мВ } \cdot \text{с}) от концентрации флуопирама в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.
В испаритель хроматографа вводят по 1 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков (\text{мВ } \cdot \text{с}) флуопирама.
7.4 Приготовление смеси ацетонитрил — вода для экстракции (объемное соотношение 9:1)
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 100 см3 дистиллированной воды, доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают.
7.5 Приготовление смесей гексан — этилацетат для очистки экстрактов на колонке с флоризилом
7.5.1. Смесь гексан — этилацетат (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 200 см3 помещают 40 см3 этилацетата, доводят до метки гексаном, перемешивают.
7.5.2. Смесь гексан — этилацетат (объемное соотношение 6:4). В мерную колбу вместимостью 200 см3 помещают 80 см3 этилацетата, доводят до метки гексаном, перемешивают.
7.6 Подготовка колонки с флоризилом для очистки экстрактов
Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 — 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г флоризила в 20 см3 гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия массой 1 г. Колонка готова к работе.
7.7 Проверка хроматографического поведения флуопирама на колонке с флоризилом
В круглодонную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,1 см3 раствора № 1 для градуировки с концентрацией флуопирама 5,0 мкг/см3 (п. 7.2.2), добавляют 0,4 см3 этилацетата, затем 5 см3 гексана, перемешивают и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают дважды гексаном по 2,5 см3, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 30 см3 гексана, 30 см3 смеси гексан — этилацетат (8:2 по объему), элюаты отбрасывают.
Затем колонку промывают 60 см3 смеси гексан — этилацетат (6:4, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Фракционно (по 15 см3) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 см3 этилацетата, анализируют по п. 9.5.
Фракции, содержащие флуопирам, объединяют и вновь анализируют.
Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.
Примечание. Проверку хроматографического поведения флуопирама следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.
7.8 Приготовление раствора гидроксида калия с молярной концентрацией 2 моль/дм3 (2 М раствор)
В мерную колбу вместимостью 250 см3 помещают 28 г гидроксида калия, растворяют в 100 — 150 см3 деионизованной воды, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.
7.9 Приготовление раствора марганцовокислого калия с массовой долей 0,1% (0,1%-й раствор)
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,1 г марганцовокислого калия, растворяют в 50 — 70 см3 деионизованной воды, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.
8. Отбор и хранение проб
Отбор проб проводят в соответствии с требованиями ГОСТ: плодовые семечковые культуры: 16270-70 «Яблоки свежие ранних сортов созревания. Технические условия», 21122-75 «Яблоки свежие поздних сортов созревания. Технические условия», 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки», 21713-76 «Груши свежие ранних сортов созревания. Технические условия», 21714-76 «Груши свежие поздних сортов созревания. Технические условия»; плодовые косточковые культуры: 21832-76 «Абрикосы свежие. Технические условия», 21833-76 «Персики свежие. Технические условия», 21921-76 «Вишня свежая. Технические условия», 21920-76 «Слива и алыча крупноплодная свежие. Технические условия»; клубника: 6828-89 «Земляника свежая. Требования при заготовках, поставках и реализации»; овощные культуры: 1725-85 «Томаты свежие. Технические условия», Р 51810-2001 «Томаты свежие, реализуемые в розничной торговой сети. Технические условия», 1726-85 «Огурцы свежие. Технические условия», 13908-68 «Перец сладкий свежий. Технические условия»; виноград: 28472-90 «Виноград свежий ручной уборки для консервирования. Требования при заготовках и поставках», 25896-83 «Виноград свежий столовый. Технические условия»; виноградный сок: 26313-84 «Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб»; орехи: 16525-70 «Орехи каштана съедобного», 16830-71 «Орехи миндаля сладкого. Технические условия», 16831-71 «Ядро миндаля сладкого. Технические условия», 16832-71 «Орехи грецкие. Технические условия», 16833-71 «Ядро ореха грецкого. Технические условия», 16834-71 «Орехи фундука. Технические условия», 16835-71 «Ядро орехов фундука. Технические условия», 17111-88 «Арахис. Требования при заготовках и поставках», 5531-70 «Орехи лещины», Р 53216-08 «Орехи фисташковые неочищенные. Технические условия», 29048-91 «Пряности. Мускатный орех. Технические условия», Р 52827-07 «Орехи кедровые очищенные. Технические условия» и Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (от 21.08.79 № 2051-79).
Отобранные пробы плодовых семечковых, плодовых косточковых, клубники, огурцов, томатов, перца, бананов, ягод винограда, орехов хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 5 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.
Перед анализом образцы измельчают с помощью гомогенизатора.
9. Выполнение определения
9.1 Экстракция
9.1.1 Плоды косточковых, семечковых культур, томатов, огурцов, перца, ягоды (клубника), ягоды винограда, бананы, орехи
Измельченный образец массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 см3, вносят 50 см3 смеси ацетонитрил — вода (9:1, по объему), помещают на встряхиватель на 40 мин. Полученный экстракт (надосадочная жидкость) осторожно декантируют, фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр «красная лента» под вакуумом. Осадок на фильтре возвращают в колбу и повторяют экстракцию дополнительной порцией смеси ацетонитрил — вода (9:1, по объему) объемом 30 см3, выдерживая на встряхивателе 5 мин. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через бумажный фильтр «красная лента», осадок на фильтре промывают 20 см3 этой же смеси, объединенный экстракт переносят в мерный цилиндр на 250 см3.
Доводят общий объем раствора в цилиндре до 200 см3 смесью ацетонитрил — вода (9:1, по объему), перемешивают. Аликвоту раствора объемом 20 см3 (соответствующую 2 г анализируемого образца) переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 см3, добавляют 15 см3 бидистиллированной воды, концентрируют на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C до водного остатка (около 20 см3) и подвергают очистке по п. 9.2.
9.1.2 Виноградный сок
К образцу сока массой 20 г, находящемуся в конической колбе (с пришлифованной пробкой) вместимостью 250 см3, добавляют 100 см3 ацетонитрила, интенсивно встряхивают в течение 5 мин, помещают в холодильник (4 °C) на 1 ч. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр «красная лента» под вакуумом, дважды промывая остаток на фильтре 20 см3 ацетонитрилом. Полученный экстракт переносят в мерный цилиндр на 250 см3.
Доводят общий объем раствора в цилиндре до 200 см3 ацетонитрилом, перемешивают. Аликвоту раствора объемом 20 см3 (соответствующую 2 г анализируемого образца) переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 см3, добавляют 20 см3 бидистиллированной воды, концентрируют на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C до водного остатка (около 20 см3) и подвергают очистке по п. 9.2.
9.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Водный остаток, полученный по п. 9.1.1 или 9.1.2, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3. Колбу ополаскивают 80 см3 бидистиллированной воды, которую также переносят в делительную воронку. Вносят в воронку 20 см3 насыщенного водного раствора хлористого натрия, 30 см3 гексана, интенсивно встряхивают в течение 5 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруя через безводный сульфат натрия (5 г), помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 150 см3. Водную фракцию возвращают в делительную воронку и операцию экстракции повторяют дважды новыми порциями гексана объемом 30 см3, встряхивая в течение 5 мин. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C до объема 0,5 — 1,0 см3 и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.
9.3 Очистка экстракта на колонке с флоризилом
К остатку в круглодонной колбе, полученному по п. 9.2, добавляют 0,5 см3 этилацетата и 5 см3 гексана, перемешивают. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают дважды гексаном порциями по 2,5 см3, которые также наносят на колонку, скорость прохождения растворителя через колонку 1 — 2 капли в секунду. Промывают колонку последовательно 30 см3 гексана, 30 см3 смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему), элюаты отбрасывают.
Флуопирам элюируют с колонки 45 см3 смеси гексан — этилацетат (6:4, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 см3, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C. При анализе проб плодовых семечковых (яблоня, груша), плодовых косточковых (персик, нектарин, абрикос, вишня, слива), ягод (клубника), томатов, перца, огурцов, бананов, винограда, виноградного сока сухой остаток растворяют в 4 см3 этилацетата и анализируют на содержание флуопирама в условиях хроматографирования по п. 9.5. Пробы орехов дополнительно очищают окислением и перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.4.
9.4 Очистка экстракта окислением и перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
При анализе проб орехов остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют в 20 см3 гексана, выдерживая 30 с на ультразвуковой бане, переносят в делительную воронку вместимостью 100 см3, колбу обмывают 10 см3 гексана, растворы объединяют в воронке. Добавляют 10 см3 2 М водного раствора KOH и 5 см3 0,1%-го водного раствора KMnO_{4} , интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 3 мин, нижний водный слой отбрасывают, верхний гексановый слой собирают, фильтруя через безводный сульфат натрия, помещенный на бумажном фильтре «красная лента» в конусной воронке, и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3.
К гексановому раствору в воронке добавляют 30 см3 ацетонитрила, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, собирая в круглодонную колбу вместимостью 100 см3. Экстракцию повторяют дважды порциями ацетонитрила по 25 и 20 см3.
Объединенный ацетонитрильный экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 4 см3 этилацетата и анализируют на содержание флуопирама в условиях хроматографирования по п. 9.5.
9.5 Условия хроматографирования
Газовый хроматограф, снабженный электронозахватным детектором.
Колонка капиллярная НР-35 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм.
Температура: — детектора: 300 °C; - испарителя: 260 °C.
Температура термостата колонки программированная. Начальная температура — 160 °C, выдержка 2 мин, нагрев колонки со скоростью 25 °C в минуту до температуры 235 °C, затем нагрев колонки со скоростью 3 °C в минуту до температуры 250 °C, затем нагрев колонки со скоростью 20 °C в минуту до температуры 270 °C, выдержка 9 мин.
Газ 1 (азот): давление 72,1 кПа, 32,5 см/с, поток 1,5 см3/мин.
Газ 2: деление потока 1:3; сброс 4,5 см3/мин.
Ориентировочное время выхода флуопирама ~ 12,8 мин.
Хроматографируемый объем: 1 мм3.
Линейный диапазон детектирования: 0,005 — 0,05 нг.
Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор флуопирама с концентрацией 0,05 мкг/см3, разбавляют этилацетатом (не более чем в 50 раз).
10. Обработка результатов анализа
Содержание флуопирама в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:
X = \frac{A \cdot V \cdot K}{m} ,
где X — содержание флуопирама в пробе, мг/кг;
A — концентрация флуопирама, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см3;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г;
K — коэффициент, учитывающий объем аликвоты экстракта, взятый для анализа (равен 10).
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , (1)
где X_{1} , X_{2} — результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8\sigma_{r} .
При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta) или мг/кг при вероятности P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание флуопирама в пробе менее 0,01 мг/кг» <*>.
<*> 0,01 мг/кг — предел обнаружения флуопирама в плодовых семечковых (яблоня, груша), плодовых косточковых (персик, нектарин, абрикос, вишня, слива), ягодах (клубника), овощных культурах (томаты, перец, огурцы), бананах, винограде и виноградном соке, орехах.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание флуопирама в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,005 до 0,05 мкг/см3.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
A = \frac{(X - C) \cdot 100}{C} \leq 6 ,
где X — концентрация флуопирама в пробе при контрольном измерении, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора флуопирама, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
6% — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 6%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флуопирама, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.3.
Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки C_{\text{д}} должна удовлетворять условию:
C_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime} ,
где \pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta ,
где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры K_{\text{к}} рассчитывают по формуле:
K_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - C_{\text{д}} ,
где \overline{X}\prime , \overline{X} , C_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле
K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} .
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_{\text{к}}) с нормативом контроля (K).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R)
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , (3)
где X_{1} , X_{2} — результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
14. Разработчики
Ракитский В.Н., Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Горячева Л.В., Мухина Л.П. (ФБУН «Федеральный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана»).