МР 2.3.2.2327-08. 2.3.2. Пищевые продукты и пищевые добавки. Методические рекомендации по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности (с атласом значимых микроорганизмов)

(утв. Роспотребнадзором 07.02.2008)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["Инструкция по микробиологическому контролю... (от 28.12.1987)"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/instruktsiya-po-mikrobiologicheskomu-kontrolyu-gosagroprom-sssr" "Инструкция по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности (утв. Госагропромом СССР 28.12.1987)"
  n1["МР 2.3.2.2327-08"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/mr-2-3-2-2327-08" "МР 2.3.2.2327-08. 2.3.2. Пищевые продукты и пищевые добавки. Методические рекомендации по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях молочной промыш"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации Г. Г. Онищенко 7 февраля 2008 года

Введены в действие: с момента утверждения

2.3.2 ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОРГАНИЗАЦИИ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ НА ПРЕДПРИЯТИЯХ МОЛОЧНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ (С АТЛАСОМ ЗНАЧИМЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ)

МР 2.3.2.2327-08

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ РАЗРАБОТАНЫ:

ГНУ ВНИИМС Россельхозакадемии — Ю.Я. Свириденко, Г.М. Свириденко, Г.Д. Перфильев, М.Б. Захарова, Л.С. Матевосян, Д.С. Мягконосов, О.А. Шатрова, Н.Н. Оносовская, Е.Г. Сёмова

ФГУН ЦНИИ эпидемиологии — С.Ш. Рожнова

ОАО «Вимм-Билль-Данн» — Н.Г. Меркулова

при организационном и техническом содействии Российского союза предприятий молочной отрасли — В.В. Лабинова, Т.И. Крикун, Л.В. Абдуллаевой

ЭКСПЕРТИЗА ДОКУМЕНТА ПРОВЕДЕНА:

Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека — О.И. Аксеновой, Л.В. Чикиной, И.В. Свяховской

ГУ НИИ питания РАМН — С.А. Шевелевой

Введение

Гарантия выпуска высококачественной и безопасной продукции — соблюдение предприятиями санитарно-гигиенических требований на всех этапах производства, начиная с сырья и заканчивая готовым продуктом.

Это требование наиболее значимо именно для предприятий молочной промышленности, где из-за специфики сырья, технологического процесса, особенностей готовой продукции и условий ее хранения в высшей степени важен микробиологический контроль всей технологической цепи.

В мировой практике выпуск гарантированно безопасной и качественной молочной продукции обеспечивается внедрением в практику производств внутренних систем контроля безопасности и качества, интегрируемых в процесс производства, в частности системы ХАССП, функционирующей в соответствии с международными стандартами серии ИСО.

В практике отечественного производства молочных продуктов для организации и проведения микробиологического контроля отсутствует единый руководящий документ, содержащий всю необходимую информацию о приемах, принципах, методах, средствах контроля, нормах содержания микроорганизмов, подлежащих контролю и периодичности контроля потенциально опасных микроорганизмов.

Данные методические рекомендации созданы на основе обобщения результатов научных исследований последних лет и их широкого внедрения в практике отечественного производства молока и продуктов его переработки.

Документ включает положения, нормы, требования, методы контроля действующих законов и подзаконных документов, межгосударственных и национальных стандартов, а также ряда технических документов (инструкции, МУК, МР, МУ, ТУ).

Материалы, представленные в методических рекомендациях, являются основой системы микробиологического контроля на молочных предприятиях, обеспечивающей выпуск гарантированно безопасной и качественной продукции, многократно проверенной на практике.

Методические рекомендации также содержат в полном объеме материалы, необходимые для разработки индивидуальных, адаптированных к условиям конкретного производства, программ производственного контроля.

Документ соответствует действующим нормативным и техническим документам и максимально гармонизирован с международными стандартами.

Методические рекомендации разработаны взамен Инструкции по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности, утвержденной Госагропромом СССР 28.12.1987, и Инструкции по порядку и периодичности контроля за содержанием микробиологических и химических загрязнителей в молоке и молочных продуктах на предприятиях молочной промышленности, утвержденной Минсельхозпродом РФ 29.12.1995 (в части микробиологических показателей).

1 Область применения

Настоящие методические рекомендации устанавливают требования к организации и порядок проведения микробиологического контроля в условиях производственных лабораторий на предприятиях молочной промышленности.

Требования настоящих методических рекомендаций используют для инспекционного контроля органы надзора.

2 Нормативные ссылки

ФЗ № 29-ФЗ О качестве и безопасности пищевых продуктов

ФЗ № 52-ФЗ О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения (с изменениями от 30 декабря 2001 г.; 10 января, 30 июня 2003 г.; 22 августа 2004 г.; 9 мая, 31 декабря 2005 г.)

Проект ФЗ Технический регламент на молоко и продукты его переработки

ГОСТ Р 51232-98 Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества

ГОСТ Р 51446-99 Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований

ГОСТ Р 51600-2000 Молоко. Методы определения наличия антибиотиков

ГОСТ Р 51705-2001 Системы качества. Управление качеством пищевых продуктов на основе принципов ХАССП. Общие требования

ГОСТ Р 51921-2002 Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes

ГОСТ Р 52054-2003 Молоко натуральное коровье — сырье. Технические условия

ГОСТ Р 52738-2007 Молоко и продукты переработки молока. Термины и определения

ГОСТ Р ИСО 9001-2001 Система менеджмента качества. Требования

ГОСТ Р ИСО 14001-98 Системы управления окружающей средой. Требования и руководство по применению

ГОСТ 3622-68 Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка их к испытанию

ГОСТ 3623-73 Молоко и молочные продукты. Методы определения пастеризации

ГОСТ 3624-92 Молоко и молочные продукты. Титриметрические методы определения кислотности

ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 10444.11-89 Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов

ГОСТ 10444.12-88 Продукты пищевые. Методы определения дрожжей и плесневых грибов

ГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу

ГОСТ 18963-73 Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа

ГОСТ 23453-90 Молоко. Методы определения количества соматических клеток

ГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ

ГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения соды

ГОСТ 24066-80 Молоко. Метод определения аммиака

ГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водорода

ГОСТ 25102-90 Молоко и молочные продукты. Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий

ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26781-85 Молоко. Метод измерения pH

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

ГОСТ 30347-97 Молоко и молочные продукты. Методы определения Staphylococcus aureus

ГОСТ 30519-97 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella

ОСТ 10-213-97 Сыворотка молочная. Технические условия

ОСТ 10 287-2001 Пахта — вторичное молочное сырье. Технические условия

СанПиН 2.3.4.551-96 Санитарные правила и нормы. Производство молока и молочных продуктов

СанПиН 2.1.4.1074-01 Санитарные правила и нормы. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества

СанПиН 2.3.2.1078-01 Продовольственное сырье и пищевые продукты. Гигиенические требования безопасности пищевой ценности пищевых продуктов

СП 1.1.1058-01 Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением противоэпидемических (профилактических) мероприятий

МУК 4.2.1018-01 Методические указания. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды

МУ 2.3.975-00 Методические указания. Применение ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздушной среды помещений организаций пищевой промышленности, общественного питания и торговли продовольственными товарами

МУ ВНИИМС 4.1.002-97 Методические рекомендации по проведению фагового мониторинга на сыродельных предприятиях

СП 1.2.731-99 Санитарные правила. Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами

Р 3.5.1904-04 Руководство. Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях

ТУ 9811-152-04610209-2004 Сливки-сырье

ТУ 9811-153-04610209-2004 Молоко-сырье для сыроделия

3 Термины, определения, обозначения и сокращения

3.1 Производственная лаборатория: структурное подразделение предприятия-изготовителя, осуществляющее контроль сырья, технологического процесса, готовой продукции и санитарно-гигиенического состояния производства в соответствии со схемой производственного контроля. В производственной лаборатории не проводят работ с заквасочными микроорганизмами, в том числе по приготовлению производственных заквасок.

3.2 Санитарно-показательные микроорганизмы: микроорганизмы, не являющиеся причиной инфекционных заболеваний и токсикоинфекций, но используемые для косвенной оценки микробиологической безопасности продукта.

3.3 Технически вредные микроорганизмы: микроорганизмы, не влияющие на безопасность продукта, но оказывающие влияние на качество, вызывая микробиологическую порчу продуктов.

3.4 Боксированное помещение [бокс]: изолированное помещение с тамбуром (предбоксником), оборудованное соответствующим образом для обеспечения повышенной стерильности при проведении микробиологических анализов.

3.5 «Заразная» зона: помещение или группа помещений лаборатории, где проводятся работы с анализируемыми объектами и микробиологические анализы.

3.6 «Чистая» зона: помещение или группа помещений лаборатории, где не проводятся работы с анализируемыми объектами и микробиологические анализы.

3.7 Питательные среды: комплекс ростовых веществ, обеспечивающих размножение, рост и развитие определенных микроорганизмов.

3.8 Сухие питательные среды: порошкообразные или гранулированные питательные среды стандартного состава, предназначенные для приготовления рабочих питательных сред, промышленного производства, соответствующие утвержденным документам, а также зарубежного производства, имеющие разрешения уполномоченных органов на их применение.

3.9 Рабочая питательная среда: среда, подготовленная для выполнения микробиологических посевов.

3.10 Плотная (твердая) питательная среда: рабочая питательная среда, содержащая микробиологического агара более 0,8%.

3.11 Полужидкая (полутвердая) питательная среда: рабочая питательная среда, содержащая микробиологического агара от 0,3% до 0,8%.

3.12 Жидкая питательная среда: рабочая питательная среда, содержащая микробиологического агара менее 0,3%.

3.13 Основная питательная среда (общего назначения): среда, предназначенная для выращивания различных микроорганизмов.

3.14 Элективная (накопительная) питательная среда: среда, предназначенная для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенной группы (вида) из объектов, содержащих разнообразную микрофлору.

3.15 Дифференциально-диагностическая питательная среда: среда, предназначенная для разграничения отдельных групп (видов) микроорганизмов.

3.16 Признак роста: внешнее изменение питательной среды, свидетельствующее о росте и развитии микроорганизмов.

3.17 Выборка: совокупность единиц продукции, отобранной для контроля партии. Размер выборки определяется видом продукции, объемом партии, видом упаковочной тары (потребительская или транспортная).

3.18 Объединенная проба: проба, составленная из серии точечных проб, помещенных в одну емкость.

3.19 Точечная проба: проба, взятая из определенной части нештучной продукции (фляги, цистерны, монолит масла в ящике и т.д.).

3.20 Ингибирующие вещества (ИВ): вещества различной химической природы, оказывающие ингибирующее (подавляющее) действие на развитие микроорганизмов, в том числе заквасочных.

3.21 Бактерии группы кишечных палочек (БГКП, коли-формы) — бесспоровые, грамотрицательные, каталазоположительные, оксидазоотрицательные, аэробные и факультативно-анаэробные, чаще подвижные палочки с закругленными концами. БГКП являются представителями семейства энтеробактерий родов эшерихия, цитробактер, энтеробактер, клебсиелла, серратия, сбраживающих лактозу с образованием кислоты и газа.

3.22 Общие колиформные бактерии (ОКБ): грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 — 48 ч.

3.23 Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ): общие колиформные бактерии, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44 +/- 1) °C в течение 24 ч.

3.24 Стерилизация: процесс термической обработки при температуре выше 100 °C, обеспечивающий полное уничтожение всех видов патогенных и сапрофитных микроорганизмов, включая их споры.

3.25 Термизация: процесс термической обработки молока и продуктов переработки молока, осуществляемый при температуре от 60 до 68 °C с выдержкой до 30 с, при сохранении активности щелочной фосфатазы молока.

3.26 Пастеризация (низкотемпературная, высокотемпературная): процесс термической обработки молока и продуктов переработки молока, осуществляемый при различных режимах (температура/время) в диапазоне температур от 63 до 120 °C с выдержкой в течение времени, обеспечивающей снижение количества любых патогенных микроорганизмов в молоке и продуктах его переработки до уровня, при котором они не наносят существенного вреда здоровью человека.

Низкотемпературная пастеризация проводится при температуре не выше 76 °C и сопровождается инактивацией щелочной фосфатазы.

Высокотемпературная пастеризация проводится при различных режимах (температура/время) в диапазоне температур от 77 до 120 °C и сопровождается инактивацией как щелочной фосфатазы, так и пероксидазы.

3.27 Стерилизация продукта: процесс термической обработки, осуществляемой в герметично укупоренной потребительской упаковке при температурах выше 120 °C с выдержкой, обеспечивающей соответствие продукции требованиям промышленной стерильности.

3.28 Дезинфекция: обработка материала каким-либо дезинфектантом с целью полного уничтожения патогенных микроорганизмов.

3.29 Ферментированный продукт: молочный или молочный составной, или молокосодержащий продукт, изготовленный сквашиванием молока и/или смесей молока с молочными и/или немолочными компонентами с использованием заквасочных микроорганизмов.

3.30 Производственный контроль: комплекс обязательных мероприятий, направленных на обеспечение контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемиологических (профилактических) мероприятий в целях обеспечения безопасности и/или безвредности для человека и среды обитания в процессе производства, хранения, транспортировки и реализации продукции и товаров, при выполнении работ и оказании услуг, в том числе путем проведения лабораторных испытаний, исследований и измерений, осуществляемых индивидуальными предпринимателями и юридическими лицами.

3.31 Программа производственного контроля: документ предприятия-изготовителя, определяющий порядок и периодичность контроля сырья, производственного процесса, готового продукта и санитарно-гигиенического состояния производства.

3.32 Нормальный (стандартный) контроль: контроль санитарно-гигиенического состояния производства, сырья, производственного процесса и готовой продукции, обеспечивающий гарантию безопасности и качества выпускаемого продукта. Контроль нормируемых показателей проводится в определенных точках и с определенной периодичностью, внесенной в программу производственного контроля.

3.35 Усиленный контроль: контроль санитарно-гигиенического состояния производства, сырья, производственного процесса и готовой продукции проводится в случае:

• обнаружения превышения установленных требований микробиологической безопасности по одному или нескольким показателям относительно допустимых норм;
• при появлении специфических органолептических пороков готового продукта и для выявления возможных причин микробиологической порчи продукта;
• при изменении технологии производства или источников получения сырья;
• в случае возникновения нештатных ситуаций (аварий), способных привести к выпуску опасной для здоровья человека продукции.

При усиленном контроле может увеличиваться количество показателей и/или количество точек, подлежащих контролю, изменяться периодичность контроля (вплоть до сплошного).

3.36 Входной контроль: контроль основного и вспомогательного сырья, поступающего на предприятие, на соответствие показателям безопасности и качества, условиям и срокам хранения, заложенным в нормативные и/или технические документы на конкретный вид сырья.

3.37 Выходной контроль: контроль продукции при отгрузке ее потребителю на соответствие показателям безопасности и качества, заложенным в нормативные и/или технические документы на конкретный вид продукта.

Сокращения:

НВЧ — наиболее вероятное число клеток.

КМАФАнМ — количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Среда КМАФАнМ — среда для количественного определения мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

БГКП — бактерии группы кишечных палочек (коли-формы).

ГПС — глюкозопептонная среда.

ЛПС — лактозопептонная среда.

АЖФК — агар желчный фиолетово-красный.

БК — бактериальный концентрат.

БКЛ, БКП — моновидовые бактериальные концентраты лейконостоков и Lbc. plantarum.

БЗ — бактериальная закваска.

4 Требования к организации работы производственной лаборатории

Производственный контроль проводится в производственных лабораториях, имеющих разрешение на работу, выданное федеральными органами исполнительной власти в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Производственный контроль включает контроль санитарно-гигиенического состояния производства, контроль основного и вспомогательного сырья, производственного процесса и готовой продукции.

Схемы контроля различных групп молочных продуктов приведены в приложении А.

Производственные лаборатории молочных предприятий, осуществляющие работы с санитарно-показательными микроорганизмами, получают лицензию на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний IV группы патогенности или III — IV группы патогенности, в территориальных органах Роспотребнадзора.

В условиях производственных лабораторий контролю подлежат:

• санитарно-показательные микроорганизмы;
• технически вредная микрофлора, вызывающая микробиологическую порчу молочных продуктов;
• заквасочные микроорганизмы, в том числе пробиотические культуры, в частности, бифидобактерии, уровень развития которых контролируется при получении ферментированных молочных продуктов.

В производственных лабораториях, размещенных в одном производственном корпусе с основными цехами, не допускается проведение работ с условно-патогенными и патогенными микроорганизмами. Эти работы проводятся в лабораториях, лицензированных на соответствующий вид деятельности и аккредитованных в установленном порядке.

Нормы содержания и рекомендуемый порядок контроля условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, контролируемых в лабораториях, лицензированных на работу с патогенными микроорганизмами, представлены в приложении Б.

Руководитель производственной микробиологической лаборатории несет ответственность за разработку программы производственного контроля и ее выполнение.

4.1 Подготовка помещений для микробиологических исследований

Специфика микробиологических работ требует, чтобы помещение, отведенное под лабораторию, было изолировано от производственных помещений и, по возможности, располагалось в отдельно стоящем здании.

Состав, расположение и размеры помещений, выделяемых для производственной лаборатории, должны обеспечивать:

• безопасные условия труда;
• необходимый уровень защиты анализируемого объекта от загрязнения микроорганизмами из окружающей среды;
• охрану окружающей среды от загрязнения микрофлорой из анализируемых объектов и их посевов.

Лаборатория должна быть снабжена холодным и горячим водоснабжением, канализацией, приточно-вытяжной вентиляцией.

Помещения должны быть достаточными для обеспечения безопасного проведения работ. Рекомендуемый объем лабораторного помещения на одного работающего — не менее 15 м3, площадь — не менее 4,5 м2.

Внутренняя отделка помещений должна быть выполнена в соответствии с их функциональным назначением. Поверхность пола, стен, потолка в лабораторных помещениях должна быть гладкой, без щелей, легко обрабатываемой, устойчивой к действию моющих и дезинфицирующих средств, полы не должны быть скользкими.

Каждая комната должна иметь естественное и искусственное освещение.

Комнаты, мебель и оборудование должны быть промаркированы с указанием их назначения по зонам.

Лаборатория должна быть снабжена всеми нормативными, техническими и методическими документами в сфере их деятельности, общими инструкциями по технике безопасности и инструкциями по эксплуатации приборов.

Приборы, оборудование и средства измерений, используемые в работе лаборатории, должны быть исправны, аттестованы (прошедшие метрологическую экспертизу в установленные сроки) и иметь технический паспорт.

Лаборатория должна обеспечивать единство измерений (испытаний) с применением методов измерений (испытаний), аттестованных в соответствующем порядке.

Запрещается входить в лабораторию в верхней одежде и головных уборах, вносить и хранить посторонние предметы и вещи.

Работники микробиологической лаборатории должны находиться и работать в халатах и специальном головном уборе (косынке, шапочке и т.д.), сменной обуви. Запрещается использование лабораторной спецодежды вне лабораторных и производственных помещений. Спецодежда работников микробиологической лаборатории при необходимости должна быть продезинфицирована.

В помещениях лаборатории запрещается принимать пищу, курить.

Каждый работник лаборатории должен иметь постоянное рабочее место.

Помещения лаборатории должны быть разделены на «заразную» и «чистую» зоны.

В «чистой» зоне располагаются:

• помещение для спецодежды;
• помещение руководителя и/или комната для работы с документами;
• моечная, оборудованная для мытья посуды;
• помещение, оборудованное для приготовления питательных сред;
• стерилизационная;
• подсобные помещения для хранения реактивов, посуды, аппаратуры и хозяйственного инвентаря.

Помещение руководителя и/или комната для работы с документами — комнаты, оборудованные рабочими столами, компьютерами и т.д. В комнатах проводят работы по ведению журналов, сбору материалов, составлению отчетов и т.д.

Моечная должна быть оборудована:

• двухсекционной мойкой (одна секция — для замачивания грязной посуды, вторая — для мойки и ополаскивания) с подводкой горячей и холодной воды;
• столом или стеллажом для чистой посуды;
• столом или стеллажом для использованной посуды;
• шкафами для хранения чистой посуды;
• шкафами для хранения моющих средств и инвентаря;
• электрической (газовой) плиткой для кипячения посуды;
• бактерицидными лампами.

Примечание - Допускается использование посудомоечной машины.

Помещение для приготовления сред должно быть оборудовано:

• pH-метром;
• дистиллятором;
• весами;
• холодильником;
• плитами электрическими или газовыми;
• раковиной с подводкой горячей и холодной воды;
• столами для приготовления питательных сред;
• шкафами для хранения реактивов, сухих питательных сред, других необходимых материалов;
• посудой (колбы, воронки, мерные стаканы, ступки, кастрюли, бачки и т.д.);
• бактерицидными лампами.

Стерилизационная должна быть оборудована:

• стерилизаторами паровыми (автоклавами);
• стерилизаторами суховоздушными для стерилизации посуды (необязательное оборудование);
• сушильным шкафом для подсушивания стерильной посуды из автоклава;
• бактерицидными лампами;
• столом для нестерильного материала;
• столом для стерильного материала.

Подсобные помещения должны быть снабжены закрытыми шкафами для хранения реактивов, посуды, аппаратуры и хозяйственного инвентаря.

В «заразной» зоне располагаются:

• лабораторная(ые) комната(ы) для микробиологических исследований;
• боксированное помещение;
• автоклавная, оборудованная автоклавами для обеззараживания отработанного материала и зараженной посуды.

Примечание - В случае невозможности выделения отдельного помещения для автоклавной допускается его совмещение со стерилизационной, при условии наличия отдельного автоклава для обеззараживания и разделения потоков.

Не исключается возможность использования одного автоклава при условии принятия адекватных мер для разделения предметов, предназначенных для стерилизации и обеззараживания, и наличия документированной процедуры обработки автоклава.

Лабораторная(ые) комната(ы) предназначена для проведения анализов молока-сырья (определение редуктазной пробы, ингибирующих веществ, соматических клеток, сычужно-бродильной пробы и т.д.), закваски (определение газо- и ароматообразующей активности, приготовление микропрепарата и его микроскопирование) и т.д. и должна быть оборудована:

• раковиной с подводкой горячей и холодной воды;
• лабораторными столами для стационарной установки приборов: микроскопа, весов и другого оборудования;
• рабочими столами для проведения анализов, снабженными различными типами горелок;
• термостатами;
• электрической (газовой) плитой;
• холодильником;
• закрытыми шкафами для хранения стерильной посуды и готовых питательных сред;
• смесителями для приготовления десятичных разведений (необязательное оборудование);
• водяной баней (необязательное оборудование);
• микроволновой печью для расплавления сред (необязательное оборудование);
• бактерицидными лампами и/или другим оборудованием, обеспечивающим обеззараживание.

Боксированное помещение (бокс) предназначено для проведения микробиологических анализов (посевов), оно комплектуется из двух отделений: собственно бокса и предбоксника.

Предбоксник служит для одевания специальной санитарной одежды (халаты, колпаки или косынки, тапочки) и должен быть оснащен:

• столом для временного размещения вносимых материалов;
• вешалкой с плечиками;
• бактерицидными лампами.

Бокс должен быть оборудован:

• столом для проведения анализов;
• весами;
• бактерицидными лампами и/или другим оборудованием, обеспечивающим обеззараживание.

Допускается размещать шкафы для посуды и холодильники.

@Боксированное помещение необходимо снабдить звуковым или световым сигналом для возможности оповещения при возникновении неординарных ситуаций.@

При входе в лабораторию и боксированное помещение должен быть дезинфицирующий коврик.

При отсутствии специального бокса допускается проведение посевов в лабораторной комнате, которая предварительно должна быть обработана аналогично боксу или оборудована ламинарным шкафом.

Расчет необходимого количества бактерицидных ламп проводят с учетом их мощности, объема помещения, категории помещения в соответствии с требованиями Р 3.5.1904 и МУ 2.3.975.

Лабораторная мебель должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств. Поверхность столов не должна иметь швов и трещин.

Перед началом работы рабочее место для проведения микробиологических анализов необходимо освободить от ненужных предметов и продезинфицировать (70% этиловым спиртом). При смене характера работы также должна быть проведена уборка и дезинфекция рабочего места.

Стол, одежду и другие предметы, случайно загрязненные при выполнении работ анализируемым материалом, необходимо подвергнуть мойке и дезинфекции.

По окончании работ необходимо привести рабочее место в порядок и продезинфицировать.

Для поддержания в лабораторном помещении надлежащих санитарно-гигиенических условий текущая уборка помещений проводится ежедневно влажным способом после окончания рабочего дня: в «чистой» зоне лаборатории с применением моющих средств, в «заразной» зоне — с применением моющих и дезинфицирующих средств.

В боксированных помещениях проводится еженедельная генеральная уборка с применением дезинфицирующих средств путем протирания поверхностей и стен (на высоту до 2 м). После влажной уборки включают бактерицидные лампы или озонаторы, или применяют иные способы дезинфекции.

Стеклянные поверхности бактерицидных ламп протирают ветошью, смоченной спиртом, не реже 1 раза в неделю с соблюдением техники безопасности.

Внутреннее оконное остекление и рамы протирают и моют по мере загрязнения, но не реже одного раза в месяц, с наружной стороны — не реже двух раз в год (весной и осенью).

4.2 Подготовка посуды и материалов для микробиологических исследований

4.2.1 Мойку посуды необходимо проводить с использованием моющих средств, предназначенных для этих целей.

Всю новую посуду, предназначенную для бактериологических работ, перед использованием кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты объемной долей 1 — 2%) в течение 15 мин, тщательно ополаскивают проточной водой.

Посуда с питательными средами после снятия результатов обеззараживается перед мойкой путем стерилизации в автоклаве при 121 °C в течение 30 мин. Посевы в пробирках можно обеззараживать кипячением в течение 1 ч.

Остатки агаровых питательных сред с посуды счищают в специальную емкость, снабженную крышкой. Освобожденную посуду ополаскивают и замачивают в растворе с моющим средством. После замачивания посуду тщательно моют и ополаскивают проточной водой.

Использованные пипетки вертикально погружаются в емкость (стакан) с дезинфицирующим раствором до уровня возможного микробного загрязнения.

Порядок мойки пипеток:

• освобождают от ватных тампонов;
• ополаскивают теплой водой для удаления остатков посевного материала;
• замачивают в моющем растворе на 20 — 30 мин (если внутри пипеток остались загрязненные места, их можно зачистить с помощью длинной проволоки с накрученной на конце ватой);
• сильно загрязненные пипетки погружают в хромовую смесь на 20 — 30 мин;
• тщательно ополаскивают проточной теплой водой.

4.2.2 Вымытую и высушенную посуду стерилизуют:

• сухим жаром. Стерилизация сухим жаром проводится в сушильном шкафу. Подготовленный к стерилизации материал кладут на полки так, чтобы он не соприкасался со стенками. Шкаф закрывают и после этого включают нагрев. Продолжительность стерилизации при температуре 150 °C — 2 ч; при 165 °C — 1 ч, при 180 °C — 40 мин, при 200 °C — 10 — 15 мин, считая с момента достижения указанной температуры. Стерильную посуду вынимают из стерилизационного шкафа после его охлаждения ниже 60 °C;
• паром под давлением. Лабораторную посуду и материалы, разрушающиеся при температуре выше 160 °C, стерилизуют в автоклаве при (121 +/- 1) °C в течение (30 +/- 1) мин с последующим подсушиванием.

Перерасчет давления, показываемого манометром автоклава, в температуру проводится по следующей шкале:

0,5 атм — 112 °C;

0,7 атм — 116 °C;

0,8 атм — 118 °C;

1,0 атм — 121 °C;

2,0 атм — 134 °C.

Чашки Петри, пипетки и др. посуду стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических и стеклянных пеналах.

Для обеспечения безопасности и «чистоты» посева в конец пипетки перед стерилизацией вкладывают кусочек ваты.

Резиновые пробки стерилизуют в автоклаве завернутыми в бумагу.

При отсутствии аппаратов для стерилизации посуду, пипетки и пробки (для определения редуктазы и сычужно-бродильной пробы) непосредственно перед испытанием кипятят в дистиллированной воде не менее 30 мин.

Стерильную посуду хранят или в плотно закрывающихся шкафах, или в бюксах не более 30 сут.

4.2.3 Подготовка и стерилизация посуды и материалов для смывов

Ватные или марлевые тампоны заворачивают каждый в отдельности в бумагу и стерилизуют.

Отдельно стерилизуют пробирки с 5 см3 раствора хлористого натрия при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

Тампон может быть закреплен на проволоке или деревянной палочке, пропущенной через ватную пробку. В этом случае его вместе с пробкой вставляют в пробирку с 5 см3 раствора хлористого натрия или 5 см3 среды Кесслер таким образом, чтобы тампон не касался раствора, и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

4.2.4 Требования к обслуживанию автоклавов

Автоклавирование проводится персоналом, имеющим свидетельство об окончании специальных курсов.

Автоклав должен быть оборудован манометром. Манометры ежегодно поверяются в территориальных органах Ростехрегулирования. Ежеквартально работа манометров проверяется метрологической службой предприятия с соответствующей регистрацией результатов проверки в журнале.

Для контроля эффективности процесса стерилизации используют температурные индикаторы с диапазоном температур от 110 до 134 °C.

4.3 Приготовление растворов для разведений

4.3.1 Для приготовления разведений необходимо использовать термостойкие пробирки диаметром (21 +/- 2) мм, высотой (200 +/- 2) мм (П1-21-200ТС или П2-21-200ТС).

4.3.2 Подготовка воды (далее — вода)

4.3.2.1 Питьевую воду рекомендуется предварительно выдержать на свету в течение суток, прокипятить в открытом сосуде 30 мин и охладить до комнатной температуры. Необходимо контролировать активную кислотность воды, которая должна составлять 7,2 — 7,6 ед. pH.

Подготовленную воду используют для приготовления питательных сред и растворов для разведений.

4.3.2.2 Использование дистиллированной воды для приготовления растворов, реактивов и питательных сред должно быть оговорено в каждом конкретном случае и сопровождаться обязательным контролем pH.

4.3.2.3 При использовании воды для приготовления разведений ее разливают в пробирки по 10 см3 или в колбы по 93 см3 и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.

4.3.3 Приготовление раствора хлористого натрия (физиологический раствор)

8,5 г хлористого натрия растворяют в 1 дм3 воды, разливают раствор в пробирки по 10 см3 или в колбы по 93 см3 и стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение (20 +/- 1) мин. После стерилизации в пробирках должно остаться 9 см3, а в колбах 90 см3 раствора хлористого натрия.

4.3.4 Приготовление раствора фосфатного буфера

Сначала готовят концентрированный раствор фосфатного буфера. Для этого 34 г однозамещенного фосфорнокислого калия растворяют в 500 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1 дм3. Доводят активную кислотность раствора до 7,2 ед. pH раствором гидроокиси натрия массовой концентрацией 20% и добавляют дистиллированную воду в мерную колбу до объема 1 дм3.

1,25 см3 концентрированного раствора фосфатного буфера вносят в мерную колбу вместимостью 1 дм3, доводят объем до метки дистиллированной водой. Затем разливают в пробирки по 10 см3 или в колбы по 93 см3 и стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.

4.3.5 Приготовление раствора лимоннокислого натрия (для разведений сыра)

20 г трехзамещенного лимоннокислого натрия растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды, разливают в пробирки по 10 см3 или в колбы по 93 см3 и стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.

4.4 Приготовление растворов реактивов

4.4.1 Приготовление реактивов для окраски по Граму

4.4.1.1 Приготовление насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового

10 г кристаллического фиолетового растворяют в 100 см3 этилового спирта.

4.4.1.2 Приготовление водно-спиртового раствора кристаллического фиолетового

1 см3 насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового по 4.4.1.1 растворяют в 10 см3 дистиллированной воды.

4.4.1.3 Приготовление раствора Люголя

2 г йодида калия растворяют в 5 — 10 см3 дистиллированной воды, затем прибавляют 1 г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного его растворения. Затем приливают остальное количество дистиллированной воды. Для приготовления раствора используют 300 см3 дистиллированной воды.

4.4.1.4 Приготовление карболового раствора фуксина Циля

1 г основного кристаллического фуксина растирают в фарфоровой ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и несколькими каплями глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 96% этиловый спирт в количестве 10 см3. После того как краситель хорошо разотрется, приливают при постоянном помешивании 100 см3 дистиллированной воды. Раствор красителя фильтруют через влажный бумажный фильтр. Фуксин Циля очень стойкий и может храниться долгое время в посуде из темного стекла с притертой пробкой.

4.4.1.5 Приготовление водно-спиртового раствора фуксина (раствора Пфейфера)

К 1 части карболового фуксина Циля приливают 9 частей дистиллированной воды. Раствор очень нестойкий, поэтому его готовят непосредственно перед использованием.

4.4.2 Приготовление реактивов из метиленового голубого

4.4.2.1 Приготовление основного спиртового раствора метиленового голубого для окрашивания микропрепаратов

10 г метиленового голубого смешивают со 100 см3 96% раствора этилового спирта. Раствор ставят в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 24 ч, затем фильтруют в термостате при той же температуре.

Срок хранения основного раствора метиленового голубого в термостате при температуре (37 +/- 1) °C не более 3 мес.

4.4.2.2 Приготовление краски для препаратов

К 30 см3 основного спиртового раствора метиленового голубого прибавляют 100 см3 дистиллированной воды и 1 см3 раствора гидроокиси калия с массовой концентрацией 10 г/дм3.

4.4.3 Приготовление раствора резазурина для постановки редуктазной пробы и определения ингибирующих веществ

Основной раствор резазурино-натриевой соли готовят следующим образом: 0,1 г резазурино-натриевой соли переносят в мерную колбу вместимостью 200 см3 и доводят до метки прокипяченной и охлажденной до (25 +/- 2) °C дистиллированной водой. Смесь тщательно перемешивают.

Срок хранения основного раствора не более 30 сут при температуре 8 — 10 °C.

Основной раствор резазурино-натриевой соли используется для приготовления рабочего раствора для постановки редуктазной пробы и при определении ингибирующих веществ.

Рабочий раствор резазурино-натриевой соли готовят разбавлением основного раствора прокипяченной и охлажденной до (25 +/- 2) °C дистиллированной водой в соотношении 1:2,5 (например, к 10 см3 основного раствора прибавляют 25 см3 воды). Массовая доля резазурина в рабочем растворе — 0,014%.

Хранят рабочий раствор не более 3 сут при температуре 0 — 5 °C.

Основной и рабочий растворы хранят в светонепроницаемой посуде.

4.5 Приготовление растворов антибиотиков

Водные растворы антибиотиков готовят непосредственно перед использованием.

4.5.1 Приготовление раствора пенициллина

Во флакон с пенициллином, содержащим 500000 ед/см3, добавляют от 5,0 до 7,0 см3 стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивают для растворения. Содержимое флакона переносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки стерильной дистиллированной водой при температуре от 35 до 40 °C. Получают раствор пенициллина, содержащий 5000 ед/см3.

При использовании пенициллина другой активности делают соответствующий пересчет.

4.5.2 Приготовление раствора стрептомицина

0,4 г стрептомицина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют от 10 до 20 см3 стерильной дистиллированной воды при температуре от 35 до 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая концентрация стрептомицина в растворе — 4,0 г/дм3.

4.5.3 Приготовление раствора левомицетина (хлорамфеникол)

0,4 г левомицетина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют от 10 до 20 см3 стерильной дистиллированной воды при температуре от 35 до 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая концентрация стрептомицина в растворе — 4,0 г/дм3.

4.5.4 Приготовление раствора неомицина

0,5 г неомицина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют от 10 до 20 см3 стерильной дистиллированной воды при температуре от 35 до 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая концентрация неомицина в растворе — 5,0 г/дм3.

4.5.5 Приготовление растворов антибиотиков для учета бифидобактерий в смешанных культурах

4.5.5.1 Приготовление раствора неомицина

0,5 г неомицина (сульфата или основания) растворяют в 500 см3 стерильной дистиллированной воды и кипятят в течение 2 — 3 мин. При использовании неомицина в таблетированной форме его предварительно тщательно растирают в профламбированной ступке. Массовая концентрация неомицина в растворе — 1,0 г/дм3.

4.5.5.2 Приготовление раствора диклоксациллина

0,025 г диклоксациллина растворяют в 50 см3 дистиллированной воды, полученный раствор стерилизуют фильтрацией. Срок хранения раствора — 15 сут при 4 °C.

4.5.6 Водные растворы антибиотиков добавляют к расплавленной и охлажденной до (46 +/- 1) °C питательной среде.

4.6 Питательные среды

4.6.1 Рабочие питательные среды для посевов готовят из сухих питательных сред путем их растворения в воде с последующей стерилизацией в соответствии с инструкцией по приготовлению, приведенной на этикетке или в сопроводительных документах.

Для приготовления рабочих питательных сред используют водопроводную или дистиллированную воду. Водопроводную воду рекомендуется готовить по 4.3.2.1. Использование дистиллированной воды оговаривается в соответствующих пунктах при приготовлении конкретной рабочей среды.

4.6.1.1 Определение активной кислотности (pH) питательных сред

Определение активной кислотности (pH) питательных сред проводят потенциометрическим методом с помощью анализатора потенциометрического для контроля pH по прилагаемым инструкциям.

Ориентировочное определение активной кислотности (pH) питательных сред может проводиться с помощью индикаторных бумажек или готового универсального индикатора.

4.6.1.2 Контроль качества рабочих питательных сред

Качество вновь приготовленных питательных сред проверяют путем параллельного посева одних и тех же проб на новую среду и ранее используемую. Результат считается удовлетворительным при получении данных одного порядка.

Контроль стерильности рабочих питательных сред осуществляют путем термостатирования пробы среды при 37 °C в течение 48 ч. Если после термостатирования на средах отсутствуют признаки роста, то среда считается стерильной.

4.6.1.3 Хранение рабочих питательных сред

Если особые условия хранения конкретной рабочей питательной среды не оговорены в инструкции по ее применению, то среды хранят в холодильнике не более 3 мес или при температуре 18 — 23 °C не более 1 мес при условии сохранения внешнего вида среды.

4.6.2 Основные питательные среды, необходимые для проведения производственного контроля

Для проведения микробиологического контроля необходимо располагать комплексом питательных сред, обеспечивающим контроль всех значимых групп микроорганизмов. Выбор питательной среды для контроля конкретной группы микроорганизмов определяется специалистами предприятия, проводящими микробиологический контроль и отвечающими за безопасность и качество выпускаемой продукции.

Основное требование, предъявляемое к питательным средам, — обеспечение ростовых характеристик и специфичности на уровне арбитражных сред, т.е. сред, использование которых регламентировано нормативными документами (национальными стандартами).

4.6.2.1 Среда КМАФАнМ — плотная основная среда для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Приготовление

(50 +/- 5) г сухой среды вносят в (1000 +/- 50) см3 холодной воды. Смесь тщательно перемешивают, кипятят 3 — 5 мин, не допуская пригорания, и фильтруют через ватно-марлевый фильтр (при наличии осадка). В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20 — 30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до pH (7,3 +/- 0,1) ед. Среду вновь доводят до кипения, разливают в колбы или пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.

Готовую питательную среду проверяют на стерильность. Отсутствие изменений в питательной среде после выдержки 72 ч при (30 +/- 1) °C свидетельствует о стерильности питательной среды.

Использование

Рабочую среду непосредственно перед применением расплавляют, помещая посуду со средой в водяную баню. Расплавленную среду осторожно охлаждают до температуры 40 — 45 °C, не допуская вспенивания. В чашку Петри питательную среду вносят в количестве, необходимом для создания слоя среды не менее 2 мм (обычно требуется 10 — 15 см3 агаровой среды).

О наличии роста судят по появлению на питательной среде видимых колоний микроорганизмов.

Рекомендации к применению

Среда используется для оценки санитарно-гигиенического состояния молока и молочных продуктов, материалов и компонентов, воды, оборудования, воздуха

Изменяя условия культивирования на среде КМАФАнМ, определяют следующие группы микроорганизмов:

• общее количество мезофильных микроорганизмов (режимы культивирования: температура — 29 — 31 °C, продолжительность — 72 ч);
• общее количество термофильных микроорганизмов (режимы культивирования: температура — 42 — 45 °C, продолжительность — 72 ч);
• общее количество психротрофных микроорганизмов (режимы культивирования: температура — 7 °C, продолжительность — 7 - 10 сут).

Среда может быть использована для определения:

• липолитических микроорганизмов (режимы культивирования: температура — 20 — 23 °C, продолжительность — 5 - 6 сут).

Для определения липолитических микроорганизмов среду КМАФАнМ используют в качестве основы, при этом предварительно на дно чашки Петри наливают стерильный расплавленный говяжий жир до образования сплошного тонкого слоя. Колонии липолитических бактерий, разлагающих жир, образуют на среде зоны просветления;

• протеолитических микроорганизмов (режимы культивирования: температура — 30 °C, продолжительность — 48 ч).

Для определения протеолитических микроорганизмов среду КМАФАнМ используют в качестве основы, при этом предварительно на дно чашки Петри наливают 1 см3 стерильного обезжиренного молока. Колонии протеолитических бактерий, разлагающих белок, образуют на среде зоны просветления;

• споровых аэробных микроорганизмов (режимы культивирования: температура — 30 °C, продолжительность — 48 — 72 ч).

Для определения споровых аэробных микроорганизмов необходимо перед посевом прогреть посевной материал или соответствующие разведения при температуре 87 °C в течение 10 мин;

• молочнокислых микроорганизмов в кисломолочных продуктах и закваске;
• ароматообразующих (цитратсбраживающих) заквасочных микроорганизмов (режимы культивирования: температура — 30 °C, продолжительность — 48 — 72 ч).

Для определения ароматообразующих (цитратсбраживающих) заквасочных микроорганизмов к 1 дм3 среды КМАФАнМ перед стерилизацией добавляют 10 г цитрата кальция. После термостатирования вокруг колоний ароматообразующих заквасочных микроорганизмов образуются зоны просветления.

4.6.2.2 Среда Кесслер для определения БГКП

А Жидкая среда Кесслер

Приготовление

16 г сухой среды Кесслер растворяют в 1 дм3 питьевой водой. Смесь размешивают и кипятят при помешивании 2 — 5 мин. Разливают в пробирки с поплавками по 5 см3 или колбочки с поплавками по 40 — 50 см3 и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (11 +/- 1) мин. Готовая для применения среда должна иметь темно-фиолетовый цвет. Допускается наличие небольшого осадка.

Признаком роста является наличие газа, образование которого в поплавке определяется визуально.

Рекомендации к применению

Используется для индикации и количественного учета БГКП в молоке и молочных продуктах по ГОСТ 9225, в смывах с оборудования, рук и халатов персонала, во время приемо-сдаточных испытаний.

Б Плотная среда Кесслер

Приготовление

16 г сухой среды Кесслер и 8 г агара помещают в колбу и вносят 1 дм3 воды. Смесь размешивают и кипятят при перемешивании 2 — 5 мин до полного расплавления агара. Расплавленную среду разливают по 7 — 8 см3 по пробиркам и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (11 +/- 1) мин.

Признаком роста является наличие газа, образование которого определяется визуально по разрывам столбика со средой.

Рекомендации к применению

Используется для индикации и количественного учета БГКП в молоке и молочных продуктах, в смывах с оборудования, рук и халатов персонала при внутрипроизводственном контроле при отсутствии поплавков, необходимых для посева на жидкую среду Кесслер.

4.6.2.3 Среда Кода — жидкая элективная среда для определения БГКП в объектах окружающей среды.

Приготовление

30 г сухой среды растворяют в 1 дм3 воды. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20 — 30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до 7,4 — 7,6 ед. pH. Среду кипятят 5 мин при постоянном перемешивании. Готовую среду разливают в стерильные пробирки по 5 см3.

Цвет среды должен быть зеленым.

Признаком роста лактозоположительных энтеробактерий (БГКП) является изменение цвета среды с темно-зеленого до ярко-желтого; лактозоотрицательных энтеробактерий (шигелл, сальмонелл) — помутнение среды без изменения цвета.

Рекомендации к применению

Среда применяется при контроле санитарно-гигиенического состояния производства и определении БГКП в смывах.

4.6.2.4 Глюкозопептонная среда (ГПС) или лактозопептонная среда (ЛПС) — жидкие элективные среды для определения БГКП в воде.

Приготовление

Среду готовят двух видов: концентрированную и нормальную.

Концентрированная среда

К 20 г сухой среды при постоянном перемешивании добавляют 100 см3 воды с температурой 90 — 95 °C. Контролируют активную кислотность готовой питательной среды и в случае необходимости корректируют ее 20 — 30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до величины 7,2 — 7,6 ед. pH. Готовую среду разливают по 10 см3 в колбы и по 1 см3 в пробирки с ватными пробками или тампонами.

Среда нормальной концентрации

К 10 см3 концентрированной питательной среды добавляют 90 см3 воды. Готовую среду разливают по 10 см3 в пробирки с поплавками или комочками ваты.

Среды стерилизуют в автоклаве при 112 °C (0,5 атм) в течение 12 мин.

Признаками роста БГКП является помутнение, газообразование и изменение окраски сред с буровато-зеленой (для концентрированной) или голубой (среда нормальной концентрации) на желтую.

Рекомендации к применению

Среды служат для определения БГКП в воде в соответствии с ГОСТ Р 51232, ГОСТ 18963 и МУК 4.2.1018.

4.6.2.5 Среда АЖФК (агар желчный фиолетово-красный) — плотная элективная среда для количественного определения БГКП в молоке и молочных продуктах.

Приготовление

35 г сухой среды вносят в 1 дм3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают, затем нагревают и кипятят при помешивании 5 мин. Среду готовят непосредственно перед посевом.

Готовая среда должна иметь фиолетово-красный цвет.

Допускается хранение среды, разлитой в пробирки или флаконы, прокипяченной в водяной бане или пастеризованной текучим паром в автоклаве (30,0 +/- 0,5) мин, в течение 7 сут.

Перед выполнением анализа среду расплавляют на водяной бане (или пользуются свежеприготовленной средой), охлаждают до (50,0 +/- 0,5) °C и разливают в стерильные чашки Петри примерно по (11 +/- 1) см3, чтобы дно чашки было покрыто равномерно. Чашки оставляют полуоткрытыми на (60 +/- 5) мин для подсушивания. Затем их закрывают, маркируют и используют среду для анализа.

Посев на среду можно проводить двумя способами — поверхностным и глубинным.

При поверхностном посеве БГКП образуют розовато-фиолетовые колонии диаметром больше 0,5 мм с более светлым по сравнению с центром ореолом.

При глубинном посеве БГКП образуют мелкие до 0,5 мм колонии красного цвета (вокруг колоний обычно образуется красный ореол).

Рекомендации к применению

Среда применяется для количественного учета КОЕ БГКП и визуальной оценки характера образующихся колоний.

Среда рекомендуется при проведении контроля производственного процесса выработки сыров и сырных продуктов.

4.6.2.6 Среда Эндо — плотная дифференциально-диагностическая среда для дифференциального определения и идентификации БГКП при контроле санитарного состояния производства и качества готового продукта на предприятиях пищевой промышленности.

Приготовление

40 г сухой среды вносят в 1 дм3 дистиллированной воды, тщательно размешивают, затем нагревают и кипятят в течение 3 — 5 мин, не допуская пригорания. После охлаждения до 40 — 50 °C среду разливают в стерильные чашки Петри и подсушивают в термостате.

Рекомендации к применению

Посев на среду проводят исключительно с накопительных сред (Кесслер, Кода, ГПС, ЛПС), давших признаки роста БГКП.

По характеру колоний на среде Эндо судят о принадлежности микроорганизмов, давших рост на накопительных питательных средах, к лактозоположительным или лактозоотрицательным энтеробактериям.

Характерным ростом для БГКП является образование красных или темно-красных колоний с металлическим блеском.

4.6.2.7 Среда агаровая для определения дрожжей и плесеней — плотная элективная среда для определения дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочных продуктах, а также для микробиологического контроля санитарного состояния производства.

Приготовление

60 г сухой среды вносят в 1 дм3 дистиллированной воды, нагревают до полного растворения, при наличии осадка фильтруют. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20 — 30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до 4,6 — 4,7 ед. pH, разливают в пробирки и стерилизуют 15 мин при температуре 121 °C.

Чашки выдерживают при температуре 20 — 23 °C в течение 3 — 5 сут. Подсчитывают отдельно типичные колонии дрожжей и плесеней.

Рекомендации к применению

Среду можно применять без антибиотиков. Дрожжи на этой среде формируют блестящие, чаще белые, колонии круглой формы с гладкой поверхностью и ровным краем. Рост плесневых грибов сопровождается образованием мицелия. Молочнокислые микроорганизмы из-за низкого содержания азотистых соединений в среде и низкого уровня pH могут давать точечные колонии в виде пыли, не подлежащие учету.

4.6.2.8 Среда Сабуро — плотная питательная среда основного характера для анализа консервов на стерильность и определения дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочных продуктах.

Приготовление

70 г сухой среды вносят в 1 дм3 дистиллированной воды и оставляют на 30 мин для набухания. Среду нагревают до расплавления агара. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20 — 30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до (5,8 +/- 0,1) ед. pH, разливают в колбы и стерилизуют 30 мин при 112 °C (0,5 атм).

Непосредственно перед применением среду расплавляют, помещая посуду со средой в водяную баню, и вносят растворы антибиотиков согласно таблице 1.

Рекомендации к применению

При анализе продуктов на стерильность среда используется без применения антибиотиков, а для определения дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочных продуктах — с обязательным использованием антибиотиков.

Для повышения селективности сред, используемых для определения дрожжей и плесеней по 4.6.2.7 и 4.6.2.8, к средам добавляют антибиотики, приготовленные согласно 4.5, в объемах, указанных в таблице 1.

Таблица 1

Схема добавления антибиотиков в питательные среды

Водные растворы антибиотиков вносят перед использованием в расплавленную и охлажденную до (46 +/- 1) °C питательную среду.

4.6.2.9 Среда СДА — полужидкая среда основного характера для определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий при контроле молока, сухого молока, при исследовании сыров.

Приготовление

(50 +/- 5) г сухой среды вносят в 1 дм3 воды, тщательно перемешивают, нагревают и кипятят 3 — 5 мин, не допуская пригорания. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20 — 30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной или соляной кислоты до значения (7,3 +/- 0,1) ед. pH. Готовую среду разливают в пробирки по (12 +/- 1) см3, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.

Признаками роста являются изменение окраски среды с красной на желтую и образование газа.

Рекомендации к применению

При посеве избегают взбалтывания среды и попадания внутрь среды воздуха для обеспечения анаэробных условий.

4.6.2.10 Среда ЛАССА — полужидкая дифференциально-диагностическая среда для определения спор и вегетативных клеток лактатсбраживающих маслянокислых бактерий.

Приготовление

(50 +/- 5) г сухой среды вносят в 1 дм3 воды, тщательно перемешивают, нагревают и кипятят 3 — 5 мин, не допуская пригорания. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20 — 30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до значения (5,7 +/- 0,1) ед. pH. Готовую среду разливают в пробирки по (12 +/- 1) см3, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.

Признаками роста являются изменение окраски среды с малиновой на соломенно-желтую и газообразование.

Рекомендации к применению

При посеве избегают взбалтывания среды и попадания внутрь среды воздуха для обеспечения анаэробных условий.

4.6.2.11 Среда для определения бифидобактерий — плотная питательная среда основного характера для определения бифидобактерий в ферментированных молочных продуктах, бифидосодержащих бактериальных концентратах и заквасках.

Приготовление

(50 +/- 5) г сухой среды вносят в 1 дм3 холодной воды, тщательно перемешивают, нагревают, не допуская пригорания, и кипятят 3 — 5 мин. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20 — 30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до значения (7,4 +/- 0,2) ед. pH. Среду разливают в пробирки по 20 см3, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.

Непосредственно перед применением пробирки с рабочей средой нагревают в водяной бане до кипения и выдерживают в течение (25 +/- 5) мин. По окончании тепловой обработки среду быстро охлаждают до температуры 40 — 45 °C. Посевы культивируют (72 +/- 2) ч при температуре (37 +/- 1) °C.

Рекомендации к применению

Среда предназначена для определения бифидобактерий в ферментированных молочных продуктах, содержащих наряду с бифидобактериями молочнокислые микроорганизмы. Поэтому при проведении посева необходимо создавать анаэробные условия, проводя посев «в высокий столбик», и избегать взбалтывания среды и попадания внутрь столбика среды воздуха из пипетки.

Бифидобактерии на данной среде образуют непрозрачные белесые колонии в виде «дисков» или «гречишных зерен».

При определении бифидобактерий в продуктах со смешанной микрофлорой в готовые среды перед расплавлением рекомендуется вносить на 20 см3 среды 0,2 см3 раствора неомицина, приготовленного по 4.5.5.

4.6.2.12 Среда для культивирования бифидобактерий — полутвердая среда основного характера для культивирования бифидобактерий и дальнейшего их использования при производстве ферментированных молочных продуктов.

Приготовление

50 г сухой среды вносят в 1 дм3 воды. Среду тщательно перемешивают, нагревают, не допуская пригорания, кипятят 3 — 5 мин. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20 — 30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до значения (7,4 +/- 0,2) ед. pH. Среду разливают в пробирки или колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.

Непосредственно перед применением пробирки или колбы со средой нагревают в водяной бане до кипения и выдерживают в течение (25 +/- 5) мин. По окончании тепловой обработки среду охлаждают до (45 +/- 2) °C.

Посевы культивируют (48 +/- 2) ч при температуре (37 +/- 1) °C.

Рекомендации к применению

При посеве избегают взбалтывания среды и попадания внутрь среды воздуха для обеспечения анаэробных условий.

Признаками роста бифидобактерий являются образование колоний в виде «комет», «гвоздиков», «кучевых облаков» различной степени четкости.

4.6.2.13 Водный агар

Приготовление

20 г микробиологического агара вносят в 1 дм3 воды. Среду тщательно перемешивают, нагревают, не допуская пригорания, кипятят 3 — 5 мин. Среду разливают в пробирки или колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (11 +/- 1) мин.

Рекомендации к применению

Применяют при определении микроорганизмов, обладающих протеолитической активностью, а также для создания анаэробных условий при определении споровых анаэробных микроорганизмов.

4.6.2.14 Стерильное обезжиренное молоко

Приготовление

Обезжиренное молоко разливают в пробирки по 10 см3 (возможно использование 10% восстановленного обезжиренного молока), закрывают ватными пробками и стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение (11 +/- 1) мин.

Рекомендации к применению

Применяют при определении молочнокислых микроорганизмов, а также микроорганизмов, обладающих протеолитической активностью.

4.6.2.15 Среда для определения цитратсбраживающих ароматообразующих микроорганизмов — плотная питательная среда на основе среды КМАФАнМ, предназначенная для количественного определения цитратсбраживающих ароматообразующих микроорганизмов.

Приготовление

(50 +/- 5) г сухой среды КМАФАнМ вносят в (1000 +/- 50) см3 воды. Смесь тщательно перемешивают, затем нагревают и кипятят 3 — 5 мин, не допуская пригорания. При наличии осадка фильтруют через ватно-марлевый фильтр. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20 — 30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до значения (7,3 +/- 0,1) ед. pH. В расплавленную среду добавляют 10 г цитрата кальция, предварительно хорошо растертого в ступке. Среду, периодически перемешивая до равномерного распределения осадка, разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.

Рекомендации к применению

Применяют при определении цитратсбраживающих ароматообразущих молочнокислых микроорганизмов закваски, БК и ферментированных молочных продуктов. При определении ароматообразующих микроорганизмов вокруг их колоний образуются зоны просветления.

4.6.2.16 Молочно-солевой агар — плотная питательная среда, предназначенная для определения солеустойчивых микроорганизмов.

Приготовление

115 г сухой основы вносят в 1 дм3 дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают, кипятят 3 — 5 мин, не допуская пригорания. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости устанавливают ее 20 — 30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты на уровне (7,2 +/- 0,1) ед. pH. Среду разливают мерно в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (20 +/- 1) мин.

Использование рабочей среды: перед посевом к расплавленной и охлажденной до (45 +/- 1) °C среде добавляют 10% (по объему) стерильного обезжиренного молока, хорошо перемешивают и разливают по 15 — 20 см3 среды в чашки Петри. Чашки могут храниться в холодильнике не более 5 сут.

Рекомендации к применению

Применяют при выявлении солеустойчивых микроорганизмов, включающих микрококки, стафилококки, энтерококки, споровые аэробные палочки.

Для выделения среди солеустойчивой микрофлоры микрококков и стафилококков (каталазоположительные кокки, расположенные поодиночке, парами, неправильными скоплениями) необходимо:

• выполнить пробу на каталазу по 6.3;
• приготовить микропрепарат по 6.4.1.

При выявлении на молочно-солевом агаре каталазоположительных кокков, дающих при рассмотрении микропрепаратов типичную картину для стафилококков, количество которых превышает допустимую норму, определяемую для сырья, продукта или рассола, необходимо:

• в молоке-сырье (105 КОЕ/см3) — искать источник стафилококковой инфекции (мастит);
• в рассоле (5·104 КОЕ/см3) — проводить термическую или иную обработку рассола;
• в готовом продукте — отдавать в специализированную лабораторию для определения коагулазоположительных стафилококков.

4.6.2.17 Среда для определения пропионовокислых бактерий — плотная питательная среда, предназначенная для количественного определения пропионовокислых бактерий.

Приготовление

В (1000 +/- 50) см3 воды вносят 30 г пептона, 1 г дрожжевого автолизата, 20 г агара. Смесь тщательно перемешивают, затем нагревают и кипятят до расплавления агара, не допуская пригорания. Добавляют 20 см3 40% молочной кислоты. В полученной среде проверяют активную кислотность и доводят ее 20 — 30% раствором гидроокиси натрия до значения (7,1 +/- 0,1) ед. pH. Среду перемешивают, разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.

Рекомендации к применению

Применяют при определении пропионовокислых бактерий в производственной закваске, БК и ферментированных молочных продуктах. Пропионовокислые бактерии при росте на этой среде дают кремовые колонии в виде «дисков» и «гречишных зерен».

5 Отбор проб, подготовка их к анализу, приготовление разведений и выполнение посевов

5.1 Отбор проб. Общие правила

Отбор проб молока и продуктов его переработки для микробиологического анализа проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 9225 и ГОСТ 26668.

Контроль осуществляют путем анализа пробы, отобранной из трех единиц транспортной тары или из потребительской тары с продукцией, попавшей в выборку. Для контроля продукции в потребительской таре из партии продукции выделяют по одной единице потребительской тары (для сыра — по одной головке, для стерилизованной продукции — 5 единиц потребительской тары). При этом масса отбираемой средней пробы должна быть не менее 100 г для сгущенных, полутвердых, твердых и сыпучих продуктов или не менее 100 см3 для жидких продуктов.

Контроль продукции в цистернах и флягах (молоко-сырье, сливки-сырье и т.д.) осуществляют путем анализа объединенной пробы, составленной для каждой партии продукции. Партией считают молоко или сливки от одного хозяйства, одного сорта, в однородной таре и оформленные одним документом, удостоверяющим качество и безопасность продукции. Для молока или сливок в цистернах партией считают каждую цистерну или ее секцию (отсек).

Пробу для анализа отбирают взвешиванием (для сгущенных, полутвердых, твердых и сухих продуктов) или измерением объема (для жидких продуктов).

Перед отбором проб жидкие продукты необходимо тщательно перемешивать.

Пробы отбирают с помощью стерильных приспособлений.

Отбор проб проводят отборником, черпаком, ложкой, металлической трубкой, щупом, шпателем или другим приспособлением, которые перед использованием должны быть простерилизованы в автоклаве или фламбированием.

Перед вскрытием тары с продукцией крышки фляг, цистерн, банок и т.д. очищают от загрязнений, промывают и протирают.

Отбор проб проводят в стерильную посуду достаточной вместимости и удобной формы (стеклянные колбы, банки, чашки Петри и т.д.), закрывают стерильными пробками или крышками, которые закрывают стерильной бумагой и обвязывают.

При отборе проб сырого молока для определения редуктазы металлические трубки или пробники должны быть продезинфицированы.

Отбор проб проводится с соблюдением вышеуказанных правил из точек, определенных программой производственного контроля, и в соответствии со схемами микробиологического контроля производства продуктов переработки молока (приложение А).

Основанием для выбора точек, в которых осуществляют отбор проб для проведения лабораторных исследований и испытаний, определение периодичности их отбора являются санитарные правила, гигиенические нормативы и данные санитарно-эпидемиологической оценки производства.

5.2 Отбор проб готовой продукции

Отбор проб готовой продукции для микробиологического анализа проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 9225. При этом правила приемки и общие правила отбора проб должны соответствовать требованиям ГОСТ 13928, ГОСТ 26809, ГОСТ 3622.

Пробы для микробиологических испытаний от продукции, попавшей в выборку, составленную согласно таблице 2, отбирают до отбора проб, предназначенных для органолептических и физико-химических анализов.

Таблица 2

Число единиц тары с продукцией в выборке для проведения отбора проб молока и продуктов его переработки

Продукты в потребительской таре

Для анализа продукции по микробиологическим показателям используют в качестве пробы для анализа по одной единице потребительской тары с продукцией.

Если масса нетто одной единицы потребительской тары менее массы пробы, необходимой для проведения микробиологических испытаний, то количество единиц потребительской тары увеличивают до достижения необходимой массы или объема пробы.

Молоко и сливки сырье

Объединенную пробу в размере 0,5 или 0,25 дм3 молока-сырья составляют из точечных проб, отобранных из каждой фляги или цистерны после органолептической оценки молока и рассортировки его методом предельной кислотности по ГОСТ 3624. Для проведения редуктазной пробы из объединенной пробы молока выделяют пробу объемом 50 — 60 см3.

Объединенную пробу сливок-сырья в размере 0,5 или 0,25 дм3 составляют из точечных проб, отобранных из каждой фляги или цистерны после органолептической оценки и определения кислотности титриметрическим методом по ГОСТ 3624.

Молоко и сливки пастеризованные, кисломолочные и сквашенные продукты (жидкие)

От продукции в транспортной таре, попавшей в выборку, стерильным черпаком или мутовкой после тщательного перемешивания отбирают 50 — 60 см3 продукта в стерильную посуду и закрывают стерильной пробкой.

Продукцию в потребительской таре (бутылках, пакетах и т.д.) перед отбором проб перемешивают пятикратным переворачиванием. Продукцию, которую нет возможности перемешать вышеописанным способом, следует перемешивать после вскрытия упаковочной единицы стерильным шпателем. После перемешивания необходимое для исследования количество продукта (не менее 15 — 20 см3) отбирают стерильной пипеткой и помещают в стерильную посуду, которую затем закрывают стерильной пробкой.

Творог, творожные изделия, альбуминные и сырные пасты, домашний сыр

В продукции, попавшей в выборку в транспортной таре, перед отбором пробы верхний слой продукта зачищают. Пробу отбирают стерильным щупом на расстоянии 3 — 5 см от края, направляя щуп наклонно к противоположной стороне и опуская на 3/4 его длины. Из столбика продукта на щупе отбирают стерильным шпателем не менее 15 — 20 г продукта и помещают в стерильную посуду, которую закрывают стерильной пробкой.

От продукции, попавшей в выборку в потребительской таре, отбирают для анализа не менее 15 — 20 г (включая и поверхностный слой). Отобранную пробу помещают в стерильную посуду, которую закрывают стерильной пробкой.

Масло из коровьего молока, масляная паста, молочный жир, спреды и смеси топленые, сливки пластические

От продукции, попавшей в выборку в транспортной таре, пробу отбирают стерильным щупом на расстоянии 3 — 5 см от края, направляя щуп к противоположной стороне и опуская на 3/4 его длины.

Из столбика масла на щупе отбирают стерильным шпателем 15 — 20 г продукта и помещают в стерильную посуду. Оставшийся после отбора пробы столбик продукта на щупе возвращают на прежнее место, а поверхность масла аккуратно заделывают.

От продукции, попавшей в выборку в потребительской таре, отбирают для анализа стерильным шпателем 15 — 20 г (включая поверхностный слой).

Отобранную пробу помещают в стерильную посуду, которую закрывают стерильной пробкой.

Сыр и сырные продукты

В продукции, попавшей в выборку, в намеченном месте отбора пробы поверхность сыра прижигают нагретым ножом или шпателем. Стерильный щуп вводят наклонно в середину головки на 3/4 его длины. Из столбика сыра на щупе отбирают стерильным шпателем 15 — 20 г сыра и помещают в стерильную посуду с притертой или ватной пробкой или стерильную чашку Петри с крышкой. Верхнюю часть столбика сыра со щупа возвращают на прежнее место, поверхность сыра заливают подогретым до (110 +/- 10) °C парафином или иным разрешенным для контакта с молочными продуктами материалом или оплавляют нагретым шпателем.

Сыр и сырные продукты, созревающие в полимерных материалах, после отбора проб подлежат повторному упаковыванию.

Сыр плавленый и плавленые сырные продукты

От продукции, попавшей в выборку, из разных мест продукта (включая поверхностный слой) стерильным шпателем или ланцетом отбирают на анализ 15 — 20 г продукта и помещают в стерильную посуду, которую стерильно закрывают.

Сгущенные продукты

От продукции в транспортной таре, попавшей в выборку, стерильной трубкой или черпаком отбирают на анализ 40 — 50 г продукта в стерильную посуду, которую стерильно закрывают.

От сгущенных молочных продуктов в потребительской таре пробу отбирают стерильным пробником, щупом или ложкой после вскрытия тары.

Сухие продукты

От продукции в транспортной таре, попавшей в выборку, отбирают на анализ 40 — 50 г продукта в стерильную посуду с плотно закрывающейся стерильной крышкой или пробкой.

От сухих молочных продуктов в потребительской таре после ее вскрытия отбирают стерильным пробником, щупом или ложкой 40 — 50 г продукта, помещают в стерильную посуду с плотно закрывающейся стерильной крышкой или пробкой.

Стерилизованные продукты

В продукции, попавшей в выборку, анализы проводят отдельно в каждой банке, бутылке или пакете.

5.3 Маркирование, хранение и транспортирование проб

Посуду с пробой, отобранной при контроле технологического процесса, маркируют с указанием:

• места отбора проб;
• наименования сырья, полуфабриката, продукта;
• номера пробы;
• дня (часа) отбора пробы.

Пробы, предназначенные для контроля на предприятии, маркируют с указанием:

• поставщика (при контроле молочного сырья);
• наименования продукта;
• номера пробы;
• дня (часа) отбора пробы.

Пробу, отправляемую в лабораторию вне данного предприятия, пломбируют или опечатывают, снабжают этикеткой и актом отбора проб, в которых указывают:

• номер пробы;
• наименование предприятия-изготовителя;
• наименование и сорт продукта (при наличии);
• номер и объем партии;
• дату и час выработки продукта с момента окончания технологического процесса;
• дату и час отбора проб;
• должность и подпись лица, отобравшего пробу;
• объем необходимых анализов;
• обозначение документа, в соответствии с которым изготовлен и может быть идентифицирован продукт.

Микробиологические анализы продукта проводят не более чем через 4 ч с момента отбора проб.

Пробы должны храниться и транспортироваться до начала исследования в условиях, обеспечивающих температуру продуктов не выше 6 °C, не допуская подмораживания.

Пробы замороженных продуктов хранятся и транспортируются при минусовых температурах в соответствии с условиями хранения конкретного продукта.

Отобранные пробы регистрируются в рабочих журналах перед подготовкой проб к анализу.

5.4 Подготовка проб к анализу

Молоко и сливки сырье

Отобранные пробы перед исследованием тщательно перемешивают.

Молоко, сливки, сметана

Отобранные пробы перед исследованием тщательно перемешивают.

Кисломолочные и сквашенные продукты, закваски

Отобранные пробы перед исследованием тщательно перемешивают и нейтрализуют. Для этого отбирают стерильной пипеткой 10 см3 исследуемого продукта или закваски в стерильную пробирку или колбочку и добавляют 1 см3 стерильного раствора двууглекислого натрия с массовой концентрацией 100 г/дм3, содержимое перемешивают.

Творог, творожные изделия, сыр и сырные продукты, в т.ч. плавленые, альбуминные и сырные пасты, домашний сыр

10 г продукта взвешивают на стерильном часовом стекле, чашке Петри, в бюксе, переносят в стерильную ступку, прикрытую крышкой от чашки Петри, и тщательно растирают.

Масло из коровьего молока, масляная паста, молочный жир, спреды и смеси топленые, сливки пластические

Перед исследованием пробу расплавляют на водяной бане при температуре 40 — 45 °C и перемешивают до получения однородной эмульсии.

Сгущенные продукты

Банки с продуктом и крышки фляг тщательно промывают щеткой в чисто теплой воде и вытирают.

Перед вскрытием крышку банки, пробку бочки и часть днища вокруг пробки фламбируют.

Открывают банки стерильным консервным ножом, а пробку бочки — пробойником. После вскрытия отверстия банки и бочки немедленно закрывают стерильным пергаментом, профламбированной жестяной крышкой или крышкой чашки Петри. Содержимое банки тщательно перемешивают стерильной ложкой. Затем взвешивают стерильную сухую колбу или другую стерильную посуду и в нее отвешивают 10 г продукта.

Сухие продукты

Отобранную пробу тщательно перемешивают стерильной ложкой, взвешивают 10 г продукта на кусочке стерильного пергамента, на чашке Петри, в бюксе, затем взвешенную пробу помещают в стерильную колбу или другую стерильную посуду.

5.5 Приготовление разведений продуктов для посева

Перед посевом готовят десятикратные разведения продукта в стерильных растворах хлористого натрия по 4.3.3, лимоннокислого натрия (для сыров) по 4.3.5, фосфатного буфера по 4.3.4 или воды по 4.3.2.2.

Приготовленные разведения должны быть использованы в течение 45 мин после их приготовления.

Из проб молока, сливок, сквашенных напитков из пахты и сыворотки или других продуктов, отбираемых по объему, берут стерильной пипеткой 10 см3 и вносят в 90 см3 раствора для разведений. Получают разведение 1:10 (первое разведение).

Отобранные пробы масла, спредов вносят в соответствующие стерильные растворы, подогретые до 40 — 45 °C.

К 10 г альбуминной или сырной пасты, сгущенных продуктов, сухих продуктов, концентратов и других продуктов, отбираемых по весу, добавляют 90 см3 соответствующих стерильных растворов, подогретых до 40 — 45 °C, и взбалтывают в течение 3 — 5 мин до возможно более полного эмульгирования. Получают разведение 1:10 (первое разведение).

К 10 г сыра, помещенного в стерильную ступку, постепенно добавляют 90 см3 раствора лимоннокислого натрия, подогретого до 40 — 45 °C, сыр тщательно растирают до получения однородной массы или эмульсии. Получают разведение 1:10 (первое разведение).

При приготовлении первого разведения допускается уменьшение объема или навески продукта до 1 см3 (г) при соответствующем уменьшении объема раствора для разведений.

Из первого разведения 1:10 готовят последующие 1:100 и т.д., беря 1 см3 предыдущего разведения и добавляя его в пробирку с 9 см3 раствора для разведений.

Для приготовления каждого разведения берут новую стерильную пипетку.

5.6 Техника проведения посевов

5.6.1 Техника посева аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (посев на чашки Петри)

Посев на чашки Петри проводят, используя твердые (плотные) питательные среды, содержащие 0,8 — 1,5% агара или 10 — 15% желатина, которые дают возможность для роста и подсчета отдельных колоний микроорганизмов.

Для посева обычно готовят 3 стерильные чашки Петри и такое же число пробирок с какой-либо плотной питательной средой (в зависимости от поставленной задачи). Затем выбирают те разведения исследуемого материала, которые должны дать десятки, сотни и тысячи колоний соответственно.

На крышках чашек Петри предварительно делают надписи восковым карандашом, маркером или др., отражающие следующую информацию:

• о материале (продукте), из которого сделан посев;
• о соответствующем разведении;
• о дате проведения посева.

Перед началом посева необходимо заранее подготовить соответствующим образом все необходимые материалы (чашки, пробирки, пипетки, спиртовку и т.д.), обработать спиртом рабочую поверхность стола, руки, расположить на рабочем столе наиболее удобным образом материалы. Посев проводят, соблюдая правила стерильности.

После тщательного перемешивания соответствующего разведения стерильной пипеткой берут 1 см3 материала и вносят в чашку Петри, слегка приоткрывая крышку со стороны спиртовки и выдувая содержимое пипетки. Таким образом проводят посев всех намеченных разведений.

При посеве на чашки Петри посевной материал вносят от большего разведения к меньшему. В этой случае пользуются одной пипеткой.

Затем осторожно приподняв (с одного края) крышку чашки Петри, выливают расплавленную и охлажденную до 40 °C питательную среду. Количество питательной среды, вносимой на одну чашку, должно составлять около 10 — 15 см3.

Все операции при использовании для посевов агаровых сред необходимо проводить быстро, без задержек, чтобы избежать преждевременного застывания агара. Начинающим рекомендуется использовать водяную баню для поддержания температуры агаровых сред на уровне 40 — 45 °C.

Сразу после внесения питательной среды ее смешивают с посевным материалом легким вращательным покачиванием чашки, но так, чтобы не смочить крышку. Затем чашку с посевом ставят для застывания среды на горизонтальную поверхность.

5.6.2 Техника посева аэробных микроорганизмов

Посев аэробных микроорганизмов проводят на поверхности плотных (твердых) питательных сред, обеспечивая тем самым аэробные условия для их развития.

Расплавленную питательную среду разливают в чашки Петри и ставят для застывания на горизонтальную поверхность. Застывшую среду подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует слиянию колоний. Подсушивать среду в чашках Петри рекомендуется в термостате при температуре 37 — 45 °C, расположив открытые чашки на стерильной бумаге в перевернутом виде. Время подсушивания — 1 ч. Можно проводить подсушивание в боксе на столе при включенных бактерицидных лампах.

5.6.2.1 Для количественной оценки аэробной микрофлоры исследуемых объектов в подготовленную чашку Петри на поверхность плотной питательной среды вносят 0,1 — 0,2 см3 исследуемого материала (объем зависит от конкретных условий) и стерильным шпателем Дригальского втирают посевной материал в питательную среду равномерно по всей поверхности.

5.6.2.2 Для оценки видовой (групповой) принадлежности микрофлоры, содержащейся в материале, поверхностный посев проводят с использованием бактериологической петли. При этом материал на питательной среде распределяют параллельными штрихами по всей чашке в одном направлении. При таком способе посева материал, находящийся на петле, расходуется постепенно и по линиям, нанесенным в конце посева, вырастают изолированные колонии микроорганизмов.

5.6.3 Техника посева анаэробных микроорганизмов

Для создания условий развития анаэробных микроорганизмов могут быть использованы следующие приемы:

• посев в высокий столбик питательной среды;
• культивирование посевов в анаэростатах или других устройствах, создающих анаэробные условия;
• применение специальных реагентов для создания анаэробных условий.

Посев анаэробных микроорганизмов проводят в пробирках с простерилизованной питательной средой, разлитой высоким столбиком. Для анализа анаэробных микроорганизмов, как правило, используют твердые или полутвердые питательные среды.

Непосредственно перед посевом для снижения содержания свободного кислорода питательные среды, разлитые по пробиркам и закрытые ватными пробками, кипятят в водяной бане в течение 10 — 20 мин. При кипячении из среды вытесняются газообразные вещества, в том числе кислород.

Пробирки с прокипяченными питательными средами быстро охлаждают до 40 °C и используют для посева.

Засев среды проводят соответствующим разведением посевного материала пипеткой. Посевной материал при этом должен свободно стекать из пипетки без принудительного выдувания.

Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды можно сверху заливать стерильным вазелиновым или парафиновым маслом или водным агаром (толщина слоя 1 — 1,5 см).

При посеве анаэробных микроорганизмов возможно использование анаэробных инкубаторов или настольных анаэробных систем с газогенераторными пакетами.

5.6.4 Метод предельных разведений

При проведении анализов методом предельных разведений учет количества определяемой группы микроорганизмов ведется по наиболее вероятному числу (НВЧ).

Проведение анализа

Готовят ряд последовательных разведений исследуемого продукта в стерильной воде с таким расчетом, чтобы последние разведения не содержали учитываемых микроорганизмов.

Из разведений делают посевы по 1 см3 в два параллельных ряда пробирок с питательной средой. Последнее засеваемое разведение берут с таким расчетом, чтобы в нем отсутствовали определяемые микроорганизмы.

Посевы термостатируют при оптимальной температуре развития микроорганизмов учитываемой группы. Время культивирования, необходимое для проявления признаков роста на питательной среде, также зависит от группы микроорганизмов.

Обработка результатов

НВЧ микроорганизмов определяют по количеству пробирок с признаками роста.

Сначала составляют числовую характеристику, которая состоит из трех цифр, указывающих число пробирок с признаками роста.

Первая цифра числовой характеристики соответствует тому разведению, при котором в двух пробирках есть признаки роста. Следующие цифры означают число пробирок с признаками роста в двух последующих разведениях. Выбор трех последовательных разведений для составления числовой характеристики желательно проводить таким образом, чтобы в первом из выбранных разведений обе пробирки имели признаки роста, а в последнем разведении признаки роста в обеих пробирках отсутствовали.

По числовой характеристике таблицы 3 находят НВЧ, которое умножают на то разведение, с которого составляют числовую характеристику. Полученное число соответствует статистически достоверному количеству клеток бактерий в 1 г или 1 см3 продукта.

Таблица 3

НВЧ микроорганизмов при посеве в два ряда

6 Методы анализа

Для микробиологического контроля допускается использование аттестованных в установленном порядке методик выполнения измерений.

6.1 Качественные методы оценки молока-сырья

Качественная оценка молока-сырья проводится методами, указанными ниже, или другими методами, утвержденными в установленном порядке.

6.1.1 Редуктазная проба

В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду окислительно-восстановительные ферменты — дегидрогеназы (редуктазы). Существует корреляция между общим количеством бактерий в молоке и количеством выделяемых ими окислительно-восстановительных ферментов, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель уровня бактериальной обсемененности сырого молока.

Чувствительность редуктазной пробы составляет порядка 300 тыс. КОЕ/см3 и более. При меньшем уровне бактериальной обсемененности молока-сырья данный метод не может быть использован.

Показатели редуктазной пробы всегда несколько ниже, чем значения бактериальной обсемененности, получаемые чашечным методом на среде КМАФАнМ.

6.1.1.1 Метод определения редуктазы с резазурином

Сущность метода

Метод основан на восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми микроорганизмами в молоко. По продолжительности изменения окраски резазурина оценивают бактериальную обсемененность молока-сырья.

Проведение анализа

Пробу с резазурином следует проводить не ранее, чем через 2 ч после доения (средняя продолжительность бактерицидной фазы неохлажденного молока).

В пробирки наливают по 1 см3 рабочего раствора резазурина и по 10 см3 исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками и перемешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37 +/- 1) °C.

При отсутствии редуктазника можно использовать водяную баню, помещенную в термостат с температурой (37 +/- 1) °C.

Вода в редуктазнике или водяной бане после погружения пробирок с молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Температуру (37 +/- 1) °C поддерживают в течение всего времени определения.

Пробирки с молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от попадания прямых солнечных лучей (редуктазник должен быть плотно закрыт крышкой).

Время погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа.

Показания снимают через 1 и 1,5 ч.

Появление окрашивания молока в пробирках, исчезающее при встряхивании, не учитывают.

По истечении 1 ч пробирки вынимают из редуктазника. Пробирки с молоком, имеющим окраску от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком, оставляют в редуктазнике еще на 30 мин.

Обработка результатов

В зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета молоко относят к одному из четырех классов, указанных в таблице 4 и приложении В.

Таблица 4

Класс молока по редуктазной пробе

Молоко, имеющее через 1,5 ч окраску, соответствующую I классу, относят к высшему классу.

6.1.1.2 Метод определения редуктазы с использованием микробитестов с резазурином

Микробитесты с резазурином предназначены для определения уровня общей бактериальной обсемененности молока-сырья при проведении редуктазной пробы.

Микробитесты с резазурином представляют собой полоски бумаги фиолетового цвета, которые необходимо хранить в светонепроницаемых пакетах, а при работе предохранять от действия солнечного света. Анализ следует проводить не ранее чем через 2 ч после доения.

Для проведения анализа необходимо вскрыть упаковку с микробитестами профламбированными ножницами, достать из нее микробитест и поместить его в стерильную пробирку, добавить 10 см3 исследуемого молока, закрыть стерильной резиновой пробкой и перемешать путем медленного трехкратного переворачивания пробирки. Затем пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37 +/- 1) °C.

Время погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа.

Показания снимают через 1 и 1,5 ч.

По истечении 1 ч пробирки вынимают из редуктазника. Пробирки с молоком, имеющим окраску от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком, оставляют в редуктазнике еще на 30 мин.

Обработка результатов

В зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета молоко относят к одному из четырех классов в соответствии с таблицей 4 и приложением В.

6.1.2 Определение ингибирующих веществ (ИВ)

Сущность метода

Метод основан на сравнительном определении дегидрогеназной активности тест-культуры Streptococcus thermophilus, чувствительной к ингибиторам бактериального роста, при ее развитии в испытуемом молоке и стандартном образце (СКИВ).

Чувствительность метода позволяет обнаружить в молоке содержание пенициллина 0,01 МЕ/см3; стрептомицина 10 мкг/см3; тетрациклина 1 мкг/см3, массовую долю формалина 0,005%; массовую долю перекиси водорода 0,01%.

6.1.2.1 Метод определения ИВ с индикатором резазурином

Сущность метода

Метод основан на восстановлении резазурина при развитии в молоке чувствительных к ингибирующим веществам микроорганизмов вида Streptococcus thermophilus.

Приготовление культуры термофильного стрептококка для определения ингибирующих веществ

Из сухой закваски

Для восстановления активности культуры 100 см3 обезжиренного молока стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 10 — 15 мин и охлаждают до 42 — 43 °C. Во флакон с сухой закваской термофильного стрептококка добавляют 5 — 7 см3 стерилизованного молока и тщательно перемешивают. Содержимое флакона вносят в молоко, подготовленное как указано выше, и перемешивают.

Заквашенное молоко термостатируют при температуре (43 +/- 2) °C в течение 12 — 18 ч до образования сгустка, после чего закваску охлаждают и используют для приготовления коллекционной тест-культуры.

Для приготовления коллекционной тест-культуры в пробирку с 10 см3 стерильного обезжиренного молока вносят 1 петлю культуры и выдерживают в термостате при (43 +/- 2) °C в течение 16 — 18 ч. Коллекционную тест-культуру хранят при 6 — 9 °C и перевивают через 1 — 14 сут.

Через 3 — 4 пересадки культуру снова готовят из сухой закваски. Допускается использовать культуру дольше, если она не утратила своей активности и по микроскопическому препарату соответствует требованиям (продолжительность сквашивания при перевивке 16 — 18 ч, сгусток плотный; консистенция однородная, допускается мягкая крупитчатость или вязкая; в поле зрения микроскопа в препарате тест-культуры — диплококки одиночные или собранные в цепочки).

Рабочую тест-культуру готовят из коллекционной в пробирках или бутылочках — в зависимости от необходимого количества. В пробирку с 10 см3 или бутылочку со 100 см3 стерильного обезжиренного молока вносят 1 петлю коллекционной тест-культуры и выдерживают в термостате при (43 +/- 2) °C в течение 16 — 18 ч до образования сгустка.

Для проведения анализа используют 1 — 2 суточную культуру при условии хранения ее в холодильнике при 6 — 8 °C.

Приготовление из сухого бактериального препарата «Интест»

При приготовлении рабочей культуры из сухого бактериального препарата «Интест» во флакон с препаратом добавляют стерильной пипеткой 10 см3 стерильной или кипяченной дистиллированной воды, подогретой до температуры (45 +/- 1) °C. Флакон закрывают пробкой и его содержимое тщательно перемешивают до получения однородной взвеси.

Полученную бактериальную суспензию используют для проведения анализов спустя 30 мин. За это время происходит набухание клеток.

Одна порция (флакон) культуры, приготовленной из препарата «Интест», предназначена для анализа 30 проб исследуемого молока.

При необходимости культуру хранят при температуре (6 +/- 2) °C и используют для проведения анализов в течение 72 ч.

Проведение анализа

В чистые пробирки (лучше стерильные) наливают по 10 см3 исследуемого молока и закрывают стерильными резиновыми пробками (лучше ватно-марлевыми, т.к. при последующей пастеризации резиновые пробки могут вылетать из пробирок). Оставшуюся часть пробы сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C.

При наличии большого количества проб исследуемого молока анализ проводят сериями. Количество пробирок с исследуемым молоком в каждой серии не более 20.

Одновременно проводят контрольный анализ. Для этого в пробирку наливают 10 см3 восстановленного препарата СКИВ. Для получения восстановленного препарата вскрывают колпачок и пробку флакона с сухим препаратом. Во флакон вносят пипеткой 10 см3 дистиллированной воды, подогретой до температуры (50 +/- 10) °C, закрывают пробкой и встряхивают до полного растворения.

Пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой нагревают в водяной бане до (87 +/- 2) °C с выдержкой 10 мин, затем охлаждают до (47 +/- 1) °C.

Затем в пробирки стерильной пипеткой вносят рабочую тест-культуру в количестве 0,5 см3, приготовленную из коллекционной тест-культуры, или 0,3 см3 тест-культуры, приготовленной из бактериального препарата «Интест». Ватно-марлевые пробки заменяют на стерильные резиновые пробки.

Содержимое пробирок тщательно перемешивают трехкратным переворачиванием. Пробирки выдерживают в течение 1 ч 15 мин при температуре (46 +/- 1) °C в редуктазнике или водяной бане.

Затем в пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой вносят по 1 см3 основного раствора резазурина, подготовленного по 4.4.3, температурой (20 +/- 2) °C. Содержимое пробирок перемешивают путем двукратного переворачивания.

Пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой выдерживают в течение 10 мин в редуктазнике или водяной бане с терморегулятором или водяной бане, помещенной в термостат при (46 +/- 1) °C.

Обработка результатов

При отсутствии в исследуемом молоке (и в контрольной пробе) ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь розовый или белый цвет.

При наличии в молоке ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь окраску, характерную для молока 1 класса по цветовой шкале для определения класса по редуктазной пробе с резазурином (приложение В).

6.1.2.2 Определение ИВ с индикатором метиленовым голубым

Сущность метода

Метод основан на восстановлении метиленового голубого при развитии в молоке чувствительных к ингибирующим веществам Streptococcus thermophilus.

Подготовка к анализу

Приготовление коллекционной и рабочей тест-культуры проводят по 6.1.2.1.

Приготовление водного раствора пептона

3 г пептона помещают в колбу и доливают до 100 см3 водой, стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение 10 мин и хранят в холодильнике при (6 +/- 2) °C в течение 30 сут. В случае отсутствия стерилизатора допускается кипячение раствора пептона от 1 до 2 мин на слабом огне; данный раствор должен быть использован в течение 7 — 8 ч.

Приготовление водного раствора метиленового голубого

0,5 г метиленового голубого вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки прокипяченной и охлажденной до (25 +/- 2) °C дистиллированной водой. Смесь тщательно перемешивают до полного растворения и хранят в холодильнике при (6 +/- 2) °C не более 30 сут в светонепроницаемой посуде.

Подготовка пробок

Резиновые пробки помещают в стеклянную посуду с дистиллированной водой или заворачивают в бумагу и стерилизуют в автоклаве при 0,1 мПа в течение 20 мин. При отсутствии автоклава резиновые пробки кипятят непосредственно перед испытанием в дистиллированной воде или конденсате в течение 30 мин.

Приготовление смеси для анализа

К 20 см3 водного раствора пептона добавляют 3,5 см3 односуточной культуры термофильного стрептококка (следует использовать стерильную пипетку или предварительно хорошо ополоснуть ее раствором пептона), 0,1 см3 водного раствора метиленового голубого и хорошо перемешивают. Смесь готовят перед анализом.

Объем приготовляемой смеси определяют в зависимости от числа исследуемых проб.

Проведение анализа

В чистые пробирки наливают по 10 см3 исследуемого молока и закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками. Оставшуюся часть пробы хранят в холодильнике при (6 +/- 2) °C в течение 24 ч.

Пробирки с исследуемым молоком нагревают в водяной бане до (87 +/- 2) °C и выдерживают 10 мин, затем охлаждают до (43 +/- 2) °C.

После этого в пробирки вносят стерильной пипеткой по 2 см3 приготовленной смеси для анализа, закрывают стерильными резиновыми пробками, перемешивают (пробирки трехкратно переворачивают) и выдерживают в водяной бане при температуре 41 — 42 °C в течение 2 ч.

Обработка результатов

При отсутствии в молоке ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь белый цвет.

При наличии в молоке ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь голубой цвет. Голубое кольцо, образующееся в пробирке на поверхности молока высотой до 1 см, не учитывают.

6.1.3 Методы определения антибиотиков

Анализ молока на антибиотики делают при получении положительных результатов на наличие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454 и отрицательных результатов на отсутствие соды, аммиака и перекиси водорода по ГОСТ 24065 — ГОСТ 24067.

6.1.3.1 Метод с индикатором бромкрезолпурпуром

Сущность метода

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bac. stearothermophilus var. calidolactis C953 от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении окраски при их наличии.

Подготовка к анализу

Стеклянную бутылочку с питательной таблетированной средой "Delvotest^{®}" вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре от 15 до 25 °C.

Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока с ампулами, содержащими агаровую среду со спорами Bac. stearothermophilus var. calidolactis C953, необходимое количество ампул (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы хранят в холодильнике.

Отвинчивают колпачок стеклянной бутылочки и помещают его на стол вниз донышком. Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают обратно в бутылочку.

Проведение анализа

Соединительной частью шприца прокалывают фольгу, укупоривающую ампулы.

В каждую ампулу пинцетом помещают по одной таблетке питательной среды "Delvotest^{®}" . Бутылочку со средой плотно закрывают колпачком и хранят в дальнейшем при комнатной температуре.

Шприцем отбирают 0,1 см3 пробы молока и вносят в ампулу. Для каждой пробы молока используют новый наконечник. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C.

Ампулы "Delvotest^{®}" помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0 +/- 0,5) °C в течение 3 ч. Аналогично проводят контрольное определение, внося в ампулу 0,1 см3 предварительно восстановленного по 6.1.2.1. препарата СКИВ.

Обработка результатов

Ампулы извлекают из термостата и определяют цвет содержимого.

Желтый цвет содержимого ампул с контрольным и анализируемыми образцами молока свидетельствует об отсутствии в молоке ингибирующих веществ. Фиолетовое кольцо на поверхности содержимого ампулы (размером не более 1 мм) не учитывают.

Фиолетовый цвет содержимого ампул с анализируемым образцом молока свидетельствует о наличии в молоке ингибирующих веществ (приложение В).

Вывод о наличии в молоке антибиотиков делают при получении отрицательных результатов после усиленных исследований молока на отсутствие соды, аммиака и перекиси водорода по ГОСТ 24065 — ГОСТ 24067.

6.1.3.2 Определение антибиотиков с использованием Copan Test (CH ATK)

Сущность метода

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bac. stearothermophilus var. calidolactis от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом молоке антибиотиков и сохранении окраски при их наличии.

Проведение анализа

С помощью ножниц отрезают необходимое количество тестовых пробирок, содержащих гелевую матрицу со спорами Bac. stearothermophilus var. calidolactis, питательные вещества и индикатор pH.

С помощью специальной пипетки, находящейся в комплекте, добавляют 0,1 см3 исследуемого образца в тестовую пробирку. Для каждого образца используют отдельную пипетку.

Пробирки термостатируют в специальном термостате или в водяной бане при температуре (64 +/- 1) °C в течение 3 ч.

Обработка результатов

Изменение цвета среды в пробирке на желтый свидетельствует об отсутствии антибиотиков.

Цвет среды не изменился — антибиотики присутствуют.

Частичное изменение цвета среды (желто-фиолетовый) свидетельствует о концентрации ингибирующих веществ ниже чувствительности теста.

Для обработки результатов используют цветовую шкалу (приложение В).

6.1.4 Методы определения количества соматических клеток

Определение проводится методами, указанными ниже, или другими методами, утвержденными в установленном порядке.

6.1.4.1 Визуальный метод определения количества соматических клеток в молоке

Сущность метода

Метод основан на взаимодействии сульфанола (поверхностно-активное вещество), входящего в состав препарата «Мастоприм», с соматическими клетками. В результате взаимодействия нарушается целостность клеточной оболочки и внутреннее содержимое клетки выходит наружу. В итоге в щелочной среде изменяется вязкость (консистенция) молока, что фиксируется визуально.

Подготовка к анализу

Приготовление водного раствора препарата «Мастоприм»

2,5 г препарата вносят в мерную колбу или цилиндр вместимостью 100 см3 и доливают до метки дистиллированной водой (или питьевой свежекипяченой водой), нагретой до температуры 30 — 35 °C. Раствор перед применением взбалтывают до равномерного распределения осадка.

Срок годности раствора — 1 сут при температуре хранения 10 — 30 °C.

Проведение анализа

В луночку пластинки ПМК-1 (пластинки молочно-контрольные) вносят 1 см3 тщательно перемешанного молока и добавляют 1 см3 водного раствора препарата «Мастоприм». Молоко с препаратом интенсивно перемешивают деревянной, пластмассовой или стеклянной палочкой в течение 10 с. Полученную смесь из луночки на пластинке при непрерывном интенсивном перемешивании поднимают палочкой вверх на 50 — 70 мм, после чего в течение не более 60 с оценивают результаты анализа.

Обработка результатов

Количество соматических клеток в исследуемом молоке устанавливают по консистенции смеси молока с препаратом «Мастоприм» в соответствии с требованиями таблицы 5.

Таблица 5

Количество соматических клеток в молоке, определяемое по консистенции смеси молока с препаратом «Мастоприм»

6.1.4.2 Метод определения количества соматических клеток в молоке с применением вискозиметра

Сущность метода

Метод основан на взаимодействии сульфанола (поверхностно-активное вещество), входящего в состав препарата «Мастоприм», с соматическими клетками. В результате взаимодействия нарушается целостность клеточной оболочки и внутреннее содержимое клетки выходит наружу. В итоге в щелочной среде изменяется вязкость (консистенция) молока, что фиксируется с помощью вискозиметра.

Подготовка к анализу

Приготовление водного раствора препарата «Мастоприм»

3,5 г препарата вносят в мерную колбу или цилиндр вместимостью 100 см3 и доливают до метки дистиллированной водой (или питьевой свежекипяченой водой), нагретой до температуры 30 — 35 °C. Раствор перед применением взбалтывают до равномерного распределения осадка.

Срок годности раствора — 1 сут при температуре хранения 10 — 30 °C.

Особенности проведения анализа

Во время исследования температура помещения, в котором проводятся исследования, должна быть 10 — 30 °C.

Кислотность исследуемого молока должна быть 16 — 21 °T.

Проведение анализа

В сосуд прибора вносят 5 см3 водного раствора препарата «Мастоприм» и 10 см3 исследуемого молока, тщательно профильтрованного через четыре слоя марли и перемешанного.

Затем смесь молока с раствором препарата «Мастоприм» перемешивают в течение 30 с десятикратным отклонением рабочего сосуда от вертикальной оси на 145 °C при ручном или нажатием кнопки «Пуск» при автоматическом перемешивании. По окончании перемешивания определяют время вытекания смеси через капилляр.

После проведения анализа смеси для каждой исследуемой пробы молока сосуд следует два-три раза промыть дистиллированной водой и четыре-пять раз продуть с помощью резиновой груши. После очистки сосуда прибор считается подготовленным для дальнейших анализов.

Обработка результатов

Количество соматических клеток в исследуемом молоке устанавливают по времени вытекания смеси в соответствии с инструкциями по эксплуатации вискозиметрических анализаторов молока, которые должны быть аттестованы в установленном порядке.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать:

• для времени вытекания смеси от 12,0 до 18,0 с — 1 с;
• для времени вытекания смеси от 18,1 до 25,0 с — 2 с;
• для времени вытекания смеси от 25,1 до 31,0 с — 3 с;
• для времени вытекания смеси от 31,1 до 37,0 с — 4 с;
• для времени вытекания смеси от 37,1 до 46,0 с — 5 с;
• для времени вытекания смеси от 46,1 до 58,0 с — 6 с.

Предел допускаемой погрешности результатов измерений составляет 10% в интервале доверительной вероятности P = 0,95.

6.1.4.3 Метод определения количества соматических клеток в молоке с применением счетчика соматических клеток

Сущность метода

Метод основан на окрашивании ядер соматических клеток специальным флуоресцентным реагентом. После воздействия света на окрашенное ядро клетки возникает сигнал флуоресценции, регистрируемый в виде изображения. По полученному изображению определяется количество соматических клеток. Результат количества соматических клеток отображается на дисплее прибора.

Средства измерения

Счетчик соматических клеток — прибор с применением прямой флуоресцентно-оптической технологии.

Особенности проведения анализа

Проба отбирается в специальный флакон после того, как сборное молоко тщательно перемешано (не менее 5 мин).

Перед измерением необходимо дождаться исчезновения пены в молоке.

Хранение проб молока: молоко до проведения анализа можно хранить в холодильнике не более 36 ч. Замороженное молоко не подлежит анализу данным методом.

Хранение кассет: кассеты хранят в закрытых пакетах в холодильнике. Кассеты нельзя подвергать воздействию прямого солнечного света. Реагенты, содержащиеся в кассетах, разлагаются под действием света за 1 мин.

Проведение анализа:

• нажать кнопку «On/Off» для включения или выключения прибора. Прибор оснащен функцией автоматического выключения, которая выполняется, если прибор в течение 2 мин не использовался;
• вынуть одну кассету из пакета;
• осторожно перемешать пробу, для этого несколько раз перевернуть флакон с молоком. Не трясти пробу молока перед анализом. Температура пробы должна быть в диапазоне от 10 °C до 40 °C;
• поместить всасывающее отверстие кассеты в пробу молока и нажать на поршень. Удостовериться, что молоко дошло до середины дорожки 3. Молоко вступит в реакцию с реагентами. В течение последующих 2 мин кассету необходимо поместить в прибор и запустить измерение;
• поместить кассету в прибор, при этом всасывающее отверстие кассеты должно быть слева. Закрыть крышку отсека для образца, т.к. открытая крышка может исказить результаты измерения;
• нажать кнопку «RUN» для выполнения измерений. Дисплей покажет прохождение различных этапов процедуры измерений;
• записать отображенное на дисплее значение количества соматических клеток в молоке;
• вынуть кассету из прибора. Выбросить использованную кассету в урну для мусора;
• после завершения измерения закрыть в приборе крышку отсека для образца.

Обработка результатов

Диапазон измерений счетчика составляет от 10000 до 4000000 соматических клеток/см3, что на дисплее прибора отображается как 10 — 4000/ml. Следовательно, количество соматических клеток в исследуемом молоке соответствует показанию прибора, умноженному на 103 клеток/см3.

6.1.5 Сычужно-бродильная проба

Сущность метода

Метод основан на способности молока-сырья свертываться под действием сычужного фермента, а также микроорганизмов сырого молока способствовать этому процессу за счет сбраживания лактозы и снижения pH. По характеру образовавшегося сгустка оценивают качество молока-сырья на его пригодность для производства сыра.

Подготовка к анализу

Приготовление раствора контрольного образца сычужного фермента (КО СФ)

1 г контрольного образца сычужного фермента с активностью 100 тыс. ед. растворяют в 100 см3 дистиллированной воды, нагретой до (30 +/- 1) °C, перемешивают и выдерживают не менее 15 мин. Хранят при температуре 4 — 10 °C в течение 2 сут.

Проведение анализа

В чисто вымытые широкие пробирки, хорошо просушенные и ополоснутые два-три раза молоком, из которого отбирают пробу, наливают около 30 см3 молока. Затем вносят в каждую пробирку по 1 см3 раствора сычужного фермента, хорошо перемешивают и ставят на 12 ч в водяную баню или термостат при температуре (38 +/- 1) °C, после чего вынимают из бани и проводят визуальную оценку.

Обработка результатов

По результатам визуальной оценки молоко-сырье относят к одному из трех классов, указанных в таблице 6.

Таблица 6

Класс молока по сычужно-бродильной пробе

6.1.6 Сычужная проба

Сущность метода

Метод основан на способности молока, подвергнутого предварительной температурной обработке (пастеризации), свертываться под действием сычужного фермента. По характеру образовавшегося сгустка оценивают качество молока-сырья на его пригодность для производства сыра.

Подготовка к анализу

Приготовление раствора контрольного образца сычужного фермента

1 г контрольного образца сычужного фермента с активностью 100 тыс. ед. растворяют в 100 см3 дистиллированной воды, нагретой до (30 +/- 1) °C, перемешивают и выдерживают не менее 15 мин. Хранят при 4 — 10 °C в течение 2 сут.

Подготовка молока к испытанию

Молоко-сырье от индивидуальных сдатчиков, не подвергнутое температурной обработке, пастеризуют в лабораторных условиях. Для этого в колбу вместимостью 250 см3 помещают около 150 см3 молока, закрывают пробкой или фольгой. Колбу с молоком помещают в водяную баню с температурой (64 +/- 1) °C и выдерживают в течение 30 мин, после чего молоко в колбе охлаждают до температуры не выше 38 °C.

Проведение анализа

Пастеризованное молоко разливают в 4 пробирки по 30 см3, доводят до температуры (38,0 +/- 0,5) °C в водяной бане или термостате. Затем в две пробирки вносят по 0,5 см3, в другие две пробирки по 1,0 см3 раствора контрольного образца сычужного фермента, хорошо перемешивают и ставят на 1 ч при температуре (38,0 +/- 0,5) °C в водяную баню или термостат.

После выдерживания пробирок в водяной бане или термостате в течение установленного времени при заданной температуре оценивают качество полученного сгустка.

Обработка результатов

Для оценки молока на свертываемость сначала осматривают сгусток, поворачивая каждую пробирку на 180 °C. При хорошем или удовлетворительном качестве сгустка он не должен выпадать из пробирки. Затем осторожно с помощью шпателя отодвигают сгусток от стенки пробирки, переносят его в чашку Петри и характеризуют сгусток в соответствии с таблицей 7.

Таблица 7

Класс молока по сычужной пробе

Молоко с оценкой «хорошее» и «удовлетворительное» (1 и 2 класса, соответственно) считается сыропригодным, молоко с оценкой «неудовлетворительное» (3 класс) - несыропригодным.

6.2 Качественные методы контроля закваски

6.2.1 Определение кислотообразующей активности (титруемая кислотность)

Сущность метода

Метод основан на нейтрализации кислот, образующихся в результате сбраживания лактозы заквасочными микроорганизмами при развитии их в молоке, раствором гидроокиси натрия в присутствии индикатора фенолфталеина.

Проведение анализа

Производственную закваску хорошо размешивают. В колбу вместимостью от 100 до 250 см3 вносят дистиллированную воду в объеме 20 см3 и закваску в объеме 10 см3, три капли 1% раствора фенолфталеина.

Смесь тщательно перемешивают и титруют 0,1 № раствором гидроокиси натрия до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин.

Обработка результатов

Кислотность, выраженную в градусах Тернера (°T), находят умножением объема раствора гидроокиси натрия, затраченного на нейтрализацию кислот, содержащихся в закваске, на коэффициент 10.

6.2.2 Определение активной кислотности

Сущность метода

Метод основан на определении активности ионов водорода с помощью потенциометрических анализаторов.

Проведение анализа

Производственную закваску хорошо размешивают. В стакан вместимостью 50 — 100 см3 наливают (40 +/- 5) см3 закваски температурой (20 +/- 2) °C и погружают электроды прибора. Электроды не должны касаться стенок и дна стакана. Через 10 — 15 с снимают показания по шкале прибора.

Показания по прибору отсчитывают через 3 — 5 с после установления стрелки.

При использовании для определения активной кислотности pH-метра-милливольтметра pH-150М измерение pH осуществляется в цифровой форме с помощью измерительного преобразователя и набора электродов. Отсчет показаний следует проводить после их установления. Время установления показаний не превышает 3 мин, однако в некоторых случаях может достигать 10 мин.

После каждого измерения электроды датчика промывают дистиллированной водой. В промежутках между измерениями электроды датчика погружают в стакан с дистиллированной водой.

6.2.3 Определение газообразующей активности (наличие углекислого газа)

Сущность метода

Метод основан на оценке высоты поднятия сгустка за счет расширения газов, выделяемых газообразующими микроорганизмами, при нагревании пробы.

Проведение анализа

Производственную закваску хорошо размешивают. 20 см3 закваски, отобранные пипеткой, осторожно, избегая попадания на стенки, вносят в пробирку диаметром 15 мм, отмечают уровень закваски и помещают в емкость с холодной водой. На дно емкости предварительно кладут вату. Затем температуру воды доводят до 90 °C и, не вынимая пробирки, отмечают уровень поднятия сгустка.

Обработка результатов

При нагревании сгусток становится губчатым и приподнимается над отделившейся сывороткой на высоту от 0,6 до 3 см.

Закваска, используемая при изготовлении сыров с рисунком, должна характеризоваться поднятием сгустка на высоту не менее 1 см.

6.2.4 Определение ароматообразующей активности закваски (наличие диацетила и ацетоина)

Сущность метода

Метод основан на способности диацетила и ацетоина, продуцируемых ароматообразующими микроорганизмами в молоке, давать окрашенные соединения в щелочной среде.

Проведение анализа

Для определения ароматообразующей активности закваску подогревают до 90 °C в водяной бане, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через бумажный фильтр. Затем 3 капли фильтрата смешивают на белой фарфоровой пластине (чашке) с 3 каплями 40% раствора KOH и наблюдают за изменением окраски смеси, отмечая время появления розового окрашивания.

Для испытаний можно использовать сыворотку, полученную при определении газообразующей активности по 6.2.1.

Обработка результатов

При наличии в закваске нужного количества ароматических веществ (ацетоин + диацетил) появляется ярко выраженное розовое окрашивание через 10 — 15 мин.

Для закваски, используемой в сыроделии, допустимое время появления розового окрашивания составляет не более 20 мин.

Более позднее окрашивание не принимается во внимание.

6.3 Определение каталазной и оксидазной активности микроорганизмов

Тесты на каталазу и оксидазу проводят при идентификации микроорганизмов, в частности при контроле санитарно-гигиенического состояния воды.

6.3.1 Определение каталазной активности микроорганизмов

Сущность метода

Метод основан на способности каталазы, продуцируемой некоторыми микроорганизмами при росте на питательной среде, разлагать перекись водорода с выделением пузырьков газа.

Проведение анализа

Испытания проводят с охлажденной до комнатной температуры культурой, не допуская соприкосновения клеток с нагретой поверхностью и применяя обезжиренные стерильные пробирки, предметные стекла, пипетки.

Определение каталазной активности микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах, проводят следующим образом. На колонию микроорганизмов, взятую с поверхности питательной среды или извлеченную из нее и помещенную на предметное стекло, после выдержки на воздухе в течение 30 мин пипеткой наносят каплю 3% раствора перекиси водорода.

Определение каталазной активности микроорганизмов, выросших на жидких и полужидких питательных средах, проводят следующим образом. Из посевов отбирают 2 — 3 см3 культуральной жидкости, переносят ее в пробирку и нейтрализуют раствором гидроокиси натрия или соляной кислоты.

1 — 2 капли нейтрализованной культуральной жидкости пипеткой переносят на предметное стекло и после выдержки на воздухе в течение 30 мин добавляют к ней каплю 3% раствора перекиси водорода.

Если в посевах обнаружены газообразующие микроорганизмы, то при определении их каталазной активности ставят контрольную пробу аналогично пробе на каталазу, но без добавления перекиси водорода. В данном случае газообразующие микроорганизмы относят к каталазоположительным при отсутствии пузырьков газа в контрольной пробе или при явно повышенном газообразовании в пробе с перекисью водорода по сравнению с контрольной пробой.

Обработка результатов

При появлении на стекле пузырьков газа через 30 — 60 с считают, что они образовались в результате разложения перекиси водорода каталазой, образуемой микроорганизмами (Приложение Г).

6.3.2 Определение оксидазной активности микроорганизмов

Сущность метода

Метод основан на способности оксидазы, продуцируемой некоторыми микроорганизмами при росте на питательной среде, изменять цвет индикатора.

Подготовка к проведению анализа

Реактивы для оксидазного теста

Вариант 1

Используют 1% водный раствор тетраметил-п-фенилендиамингидрохлорида. Раствор готовят перед употреблением.

Вариант 2

30 — 40 мг \alpha - \text{нафтола} растворяют в 2,5 см3 ректификованного этилового спирта, прибавляют 7,5 см3 дистиллированной воды и растворяют 40 — 60 мг диметил-п-фенилендиамина. Раствор готовят непосредственно перед определением.

Вариант 3

Используют готовые индикаторные системы «СИБ-оксидаза».

Проведение анализа

Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2 — 3 каплями реактива для оксидазного теста. Готовые бумажные системы смачивают дистиллированной водой. Часть изолированной колонии стеклянной палочкой или платиновой петлей (металлическая петля из нихрома может дать ложноположительную реакцию) наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое (вариант 1) или синее (варианты 2 и 3) окрашивание штриха.

Обработка результатов

Микроорганизмы, давшие положительную реакцию, считаются оксидазоположительными.

6.4 Методы микроскопических исследований

В молочной промышленности микроскопические исследования проводят при изучении микроморфологических особенностей микрофлоры молока, лабораторных и производственных заквасок, сыров на различных этапах их производства и т.д.

Атлас санитарно-показательных, технически вредных и заквасочных микроорганизмов, значимых для молока и продуктов его переработки, представлен в приложении Д.

Сущность метода

Метод основан на визуальном наблюдении микроорганизмов с помощью приборов (микроскопов), позволяющих многократно увеличивать исследуемый объект, подготовленный определенным образом.

При микроскопическом исследовании учитываются как жизнеспособные, так и нежизнеспособные клетки микроорганизмов, при этом чувствительность метода — не менее 105 клеток в 1 см3 исследуемого образца.

Эффективность и объективность микроскопических исследований зависит от:

• методики подготовки объекта исследования (способ приготовления микропрепарата);
• состояния и правильности подготовки микроскопа.

Подготовка исследуемых объектов (приготовление микропрепаратов)

При контроле молочной продукции наиболее распространенными способами приготовления микропрепаратов являются следующие способы:

• способ фиксирования и окрашивания;
• способ «раздавленной капли».

Приготовление фиксированных и окрашенных микропрепаратов

Приготовление мазка

На чистое, хорошо обезжиренное, профламбированное в пламени горелки и остуженное стекло бактериологической петлей наносят каплю стерильной воды, в которую с помощью прокаленной, охлажденной бактериологической петли вносят исследуемый материал и распределяют его на площади 1 — 2 см2 таким образом, чтобы получить тонкий равномерный мазок.

Если исследуется плотный материал (сыр и т.д.), то материал предварительно тщательно растирается со стерильной водой.

При исследовании колоний микроорганизмов, выросших на плотной питательной среде, часть колонии отбирают с помощью бактериологической петли или иглы и тщательно растирают в капле воды на предметном стекле.

Приготовленные мазки высушивают при комнатном температуре на воздухе.

Фиксирование мазка

Для закрепления клеток микроорганизмов на стекле высушенные мазки фиксируют. Для этого предметное стекло с высушенным мазком, обращенным вверх, берут пинцетом и проводят несколько раз через верхнюю часть пламени горелки с промежутками 5 — 6 с. Зафиксированный мазок охлаждают на воздухе.

Окрашивание мазка

Окрашивание мазков проводят после их фиксации.

Простое окрашивание:

• зафиксированный мазок помещают на подставку для окраски мазком вверх;
• пипеткой наносят раствор метиленового голубого по 4.4.2 так, чтобы покрыть весь мазок;
• по истечении 30 — 60 с краситель осторожно сливают;
• препарат промывают легкой струей воды, направляя струю на ребро предметного стекла, а не на мазок. Краску можно смывать, опуская стекло в емкость с водой;
• окрашенный мазок высушивают на воздухе;
• окрашивание мазков можно проводить с помощью специальных красящих бумажек или фильтровальной бумаги, пропитанной метиленовым голубым.

При использовании для окрашивания фильтровальной бумаги, пропитанной красителем, на сухой зафиксированный мазок наносят каплю дистиллированной воды, сверху кладут полоску окрашенной бумаги, наносят еще 1 — 2 капли воды и выдерживают определенное время, затем бумагу осторожно убирают, препарат высушивают.

Окраска по методу Грама:

• зафиксированный мазок помещают на подставку для окраски мазком вверх;
• на мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор кристаллического фиолетового по 4.4.1.2. Окраску проводят в течение 1 — 2 мин;
• снимают бумагу, сливают избыток красителя и, не промывая препарата водой, наливают раствор Люголя по 4.4.1.3 на 1 — 2 мин до почернения препарата;
• раствор Люголя сливают. Предметное стекло погружают несколько раз в стаканчик со спиртом, процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости;
• препарат тщательно промывают водопроводной водой.
• препарат окрашивают в течение 2 мин водно-спиртовым раствором фуксина по 4.4.1.5.

Возможно использование вместо основного красителя (кристаллического фиолетового) готовой к использованию фильтровальной бумаги, пропитанной 1% спиртовым раствором кристаллического фиолетового. На препарат помещают фильтровальную бумагу и наносят на нее 2 — 3 капли воды. Окрашивание ведут в течение 1 — 2 мин. Затем бумагу снимают и дальнейшую окраску препарата ведут общепринятым способом.

При проведении окраски по Граму допускается использование готовых тест-наборов для окрашивания.

Микроскопическая картина грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов приведена в приложении В.

Приготовление микропрепарата способом «раздавленная капля»

На середину чистого предметного стекла бактериальной петлей наносят небольшую каплю стерильной воды или физиологического раствора.

В каплю жидкости той же петлей вносят небольшое количество исследуемого материала. Тщательно перемешивают. При приготовлении препарата из жидких культур допускается наносить каплю исследуемого материала непосредственно на предметное стекло.

Каплю осторожно накрывают покровным стеклом. Для этого одним ребром покровное стекло ставят на край капли, затем медленно опускают так, чтобы между стеклами не попали пузырьки воздуха. Излишек жидкости, выступающий за края покровного стекла, убирают полоской фильтровальной бумаги.

Правила подготовки микроскопа

В практике работы производственных лабораторий обычно используют биологические световые микроскопы с окулярами и объективами с увеличением от 5x до 40x (без иммерсии) и с увеличением от 60x до 100x (иммерсионные системы); конденсором с апертурой 1,2 — 1,4; окуляр-микрометром и объектив-микрометром.

Микроскоп следует хранить в специально отведенном месте в деревянном футляре или накрытым стеклянным колпаком или пакетом из полимерной пленки.

Не допускается хранение микроскопа во влажных помещениях, в местах с резкой сменой температуры, вблизи химических реактивов.

Необходимо содержать микроскоп в чистоте и предохранять от механических повреждений.

После работы микроскоп нужно обтереть мягкой тряпкой, иммерсионное масло удалить с объектива и конденсора ваткой или мягкой тряпкой, смоченной бензином. Не следует использовать другие органические растворители (спирт, ацетон, эфир), т.к. они разрушают смолы, которыми склеены линзы объектива, что может привести к порче оптической системы микроскопа.

Нельзя протирать оптическую систему микроскопа бумагой или грубой тканью.

Для работы следует использовать специальные иммерсионные масла промышленного производства. Нельзя заменять иммерсионное масло растительным или минеральным маслом, которое портит линзу объектива.

Нельзя прикасаться пальцами к поверхности линз, т.к. на них остаются следы, нарушающие четкость изображения.

При попадании пыли на фронтальную линзу объектива или окуляра, их протирают мягкой тряпкой, слегка смоченной бензином. При засорении внутренней части объектива или окуляра чистку их рекомендуется проводить в специальных мастерских. Разбирать объектив нельзя.

Рабочее положение микроскопа на столе регулируется в соответствии с высотой стола, стула, положением корпуса и рук исследователя.

При микроскопировании препаратов в светлом поле зрения важное значение имеет установка правильного освещения и подбор («подгонка») объектива и окуляра.

При настройке освещения конденсор поднимают (отпускают) до уровня предметного стекла. При этом он должен находиться в центре круглого окна столика. Если конденсор смещен в сторону, то его осторожно передвигают вращением винтов столика так, чтобы он занял правильное положение.

Диафрагма при настройке освещения должна быть полностью открыта.

В качестве источника света используют или специальные осветители, или рассеянный дневной свет. При использовании рассеянного дневного света обычно применяют плоское зеркало микроскопа. В случае освещения прямым солнечным светом целесообразно использовать белый матовый или синий светофильтр. При недостаточном естественном освещении используют вогнутое зеркало.

При использовании осветителей искусственного света их устанавливают перед микроскопом на расстоянии 300 — 400 мм и включают в сеть. Открыв диафрагму, направляют свет на вогнутое зеркало микроскопа.

Настройку освещения проводят, используя объектив малого увеличения. Для этого поворотом револьвера устанавливают объектив с увеличением 8x (10x) и опускают его на расстояние 5 — 10 мм от предметного столика. Глядя в окуляр, вращая зеркало, добиваются равномерного и яркого освещения всего поля зрения.

При проведении исследований микропрепаратов при различных увеличениях пользуются разными сочетаниями окуляров и объективов. Выбор нужного увеличения определяется микроскопируемым объектом, разрешающей способностью микроскопа, целями исследования. Обычно при изучении дрожжевых клеток и плесневых грибов используют объектив 40x, для изучения бактерий применяют иммерсионный объектив И90 или И100.

Порядок работы

На предметный столик микроскопа помещают приготовленный препарат и зажимают его клеммами.

Осторожно опускают с помощью макрометрического винта тубус микроскопа почти до соприкосновения объектива с покровным стеклом, а иммерсионный объектив погружают в каплю иммерсионного масла, нанесенного на препарат, наблюдая сбоку (глаза должны находиться на уровне предметного столика).

Нельзя опускать объектив резко и низко, тем более давить объективом на окуляр, т.к. при этом можно раздавить покровное и предметное стекло, повредить фронтальную линзу объектива. Особенно осторожно следует опускать тубус микроскопа при работе с иммерсионной системой, т.к. рабочее расстояние между препаратом и объективом в этой системе составляет около 0,15 мм.

После того как тубус будет опущен, смотря в окуляр, медленно вращают макрометрический винт до появления в поле зрения микроскопа контура объекта (грубая наводка).

Наиболее четкого и резкого изображения добиваются вращением микрометрического винта.

6.5 Методы контроля санитарно-показательных и технически вредных микроорганизмов

6.5.1 Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Сущность метода

Метод основан на подсчете колоний мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, вырастающих на плотной питательной среде КМАФАнМ при (30 +/- 1) °C в течение 72 ч.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения в соответствии с таблицей 8.

Посев

Для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Из каждой пробы делают посев на две-три чашки из разведений, указанных в таблице 8 в соответствии с 5.6.1. Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см3 в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито (14 +/- 1) см3 расплавленной и охлажденной до температуры 40 — 45 °C питательной средой для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Таблица 8

Объем или масса засеваемого продукта при определении общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Допускается посев исследуемого продукта на чашки Петри из одного и того же разведения в количестве 1 и 0,1 см3.

Культивирование

После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой (30 +/- 1) °C на 72 ч.

Обработка результатов

Каждую чашку помещают вверх дном на темном фоне и проводят подсчет количества выросших колоний, пользуясь лупой с увеличением в 4 — 10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами.

При подсчете колоний рекомендуется пользоваться счетчиками.

При большом числе колоний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых сектора, подсчитывают число колоний на двух-трех секторах (но не менее чем на 1/3 поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки. Находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Число КОЕ в 1 см3 или 1 г продукта X1 вычисляют по формуле

X₁ = n·10m (1)

где n — количество колоний, подсчитанных на чашке Петри;

m — число десятикратных разведений.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

Картина роста мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов молока-сырья представлена в приложении Г.

6.5.2 Определение общего количества психротрофных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Сущность метода

Метод основан на подсчете колоний психротрофных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, вырастающих на плотной питательной среде КМАФАнМ при (7 +/- 1) °C в течение 7 — 10 сут и предназначен для оценки санитарно-гигиенических условий получения, хранения и транспортировки молока-сырья, а также выявления причин микробиологической порчи продуктов.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения в соответствии с таблицей 9.

Посев

Для определения общего количества психротрофных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Из каждой пробы делают посев на две-три чашки из разведений, указанных в таблице 9 в соответствии с 5.6.1. Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см3 в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито 10 — 15 см3 расплавленной и охлажденной до температуры 40 — 45 °C питательной средой КМАФАнМ.

Таблица 9

Объем или масса засеваемого продукта при определении общего количества психротрофных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Допускается посев исследуемого продукта на чашки Петри из одного и того же разведения в количестве 1 и 0,1 см3.

Культивирование

После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой (7 +/- 1) °C на 7 — 10 сут.

Обработка результатов

Каждую чашку помещают вверх дном на темном фоне и проводят подсчет количества выросших колоний, пользуясь лупой с увеличением в 4 — 10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами.

При подсчете колоний рекомендуется пользоваться счетчиками.

При большом числе колоний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых сектора, подсчитывают число колоний на двух-трех секторах (но не менее чем на 1/3 поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки. Находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке аналогично 6.5.1.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

Картина роста психротрофных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов молока-сырья представлена в приложении Г.

6.5.3 Определение общего количества термофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Сущность метода

Метод основан на подсчете колоний термофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, вырастающих на плотной питательной среде КМАФАнМ при (44 +/- 1) °C в течение 72 ч, и предназначен для оценки санитарно-гигиенических условий получения молока-сырья и выявления источника микробиологической порчи продукта.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения в соответствии с таблицей 10.

Посев

Для определения общего количества термофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Из каждой пробы делают посев на две-три чашки из разведений, указанных в таблице 10 в соответствии с 5.6.1. Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см3 в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито 10 — 15 см3 расплавленной и охлажденной до температуры 40 — 45 °C питательной средой КМАФАнМ.

Таблица 10

Объем или масса засеваемого продукта при определении общего количества термофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Культивирование

После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой (44 +/- 1) °C на 72 ч.

Обработка результатов

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке аналогично 6.5.1.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

Картина роста термофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов молока-сырья представлена в приложении Г.

6.5.4 Определение общего количества микроорганизмов, обладающих протеолитической активностью (протеолитических микроорганизмов)

Сущность метода

Метод основан на подсчете колоний протеолитических аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, вырастающих на плотной питательной среде (водный агар или КМАФАнМ) при (30 +/- 1) °C в течение 48 ч и дающих зоны просветления вокруг колоний в результате разложения белка под действием протеолитических ферментов, выделяемых микроорганизмами, и предназначен для выявления источника микробиологической порчи продукта.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева

Для определения количества протеолитических микроорганизмов обычно проводят посев 0,1 — 0,001 см3 (г), независимо от вида продукта.

Посев

Для определения количества протеолитических микроорганизмов вносят по 1 см3 каждого из выбранных разведений на чашки Петри, добавляют по 1 см3 стерильного обезжиренного молока, приготовленного по 4.6.2.14, и заливают водным агаром (4.6.2.13) или средой КМАФАнМ (4.6.2.1).

Культивирование

Чашки Петри с посевами выдерживают в термостате при 30 °C в течение 48 ч и после этого подсчитывают число выросших колоний протеолитических микроорганизмов.

Обработка результатов

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке аналогично 6.5.1. Подсчет ведут только тех колоний, вокруг которых образовались зоны просветления.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

Картина роста протеолитических микроорганизмов представлена в приложении Г.

6.5.5 Определение общего количества микроорганизмов, обладающих липолитической активностью (липолитических микроорганизмов)

Сущность метода

Метод основан на подсчете колоний липолитических аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, вырастающих на плотной питательной среде КМАФАнМ при 20 — 23 °C в течение 5 — 6 сут и дающих зоны просветления вокруг колоний в результате разложения жира под действием липолитических ферментов, и предназначен для выявления источника микробиологической порчи продукта.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева

Для определения количества липолитических микроорганизмов обычно проводят посев 0,1 — 0,001 см3 (г), независимо от вида продукта.

Посев

На дно подогретой чашки Петри наливают стерильный расплавленный горячий жир и сразу сливают. На дне остается тонкий слой застывшего жира.

Для определения количества липолитических микроорганизмов проводят посев по 1 см3 каждого из выбранных разведений на чашки Петри с последующей заливкой посевов расплавленной и охлажденной до 40 — 45 °C средой КМАФАнМ по 4.6.2.1 (рекомендации к применению для липолитических микроорганизмов).

Культивирование

Чашки Петри с посевным материалом выдерживают в течение 5 — 6 сут при температуре 20 — 23 °C. После этого подсчитывают число выросших колоний.

Обработка результатов

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке аналогично 6.5.1. Подсчет ведут только тех колоний, вокруг которых образовались зоны просветления.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

Картина роста липолитических микроорганизмов представлена в приложении Г.

6.5.6 Определение спор аэробных и факультативно анаэробных мезофильных или термофильных микроорганизмов

Сущность метода

Метод основан на посеве предварительно прогретого при температуре (88 +/- 2) °C в течение (12 +/- 2) мин посевного материала в плотную питательную среду с последующим культивированием посевов для выявления спор мезофильных микроорганизмов в течение 3 сут при (30 +/- 1) °C и для выявления спор термофильных микроорганизмов при (55 +/- 1) °C и подсчете всех видимых колоний, характерных для спорообразующих бактерий. Метод предназначен для оценки санитарно-гигиенических показателей сырья и выявления источника микробиологической порчи продукта.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева

Для определения количества спор аэробных и факультативно анаэробных мезофильных или термофильных микроорганизмов обычно проводят посев 0,1 — 0,01 см3 (г), независимо от вида продукта.

Посев

Посевной материал прогревают в водяной бане при температуре (88 +/- 2) °C в течение (12 +/- 2) мин, охлаждают до температуры (23 +/- 1) °C.

Из каждой пробы делают посев по 1 см3 разведений на чашки Петри. В каждую чашку Петри с заранее промаркированной крышкой добавляют не позднее чем через 15 мин 10 — 15 см3 питательной среды КМАФАнМ, охлажденной до (45 +/- 1) °C, тщательно перемешивают и оставляют до застывания.

Культивирование

После застывания сред чашки Петри переворачивают вверх дном и ставят в таком виде в термостат с температурой (30 +/- 1) °C для выявления спор мезофильных и (55 +/- 1) °C для выявления спор термофильных микроорганизмов на 3 сут.

Обработка результатов

Каждую чашку помещают вверх дном на темном фоне и проводят подсчет количества выросших колоний, пользуясь лупой с увеличением в 4 — 10 раз.

Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами. Учитывают колонии, характерные для спорообразующих микроорганизмов. Спорообразующие микроорганизмы образуют на поверхности среды сухие шероховатые или морщинистые колонии, с неровными краями. В ряде случаев рост спорообразующих микроорганизмов распространяется по всей поверхности агара. Спорообразующие микроорганизмы могут врастать в агар, образуя на поверхности слизистые вздутия.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке аналогично 6.5.1.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов, полученных по всем чашкам.

Картина роста споровых мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов представлена в приложении Г.

6.5.7 Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП)

6.5.7.1 Определение БГКП на среде Кесслер

Сущность метода

Метод основан на способности БГКП сбраживать в питательной среде лактозу при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч с образованием кислоты и газа и предназначен для оценки санитарно-гигиенических показателей сырья, производственного процесса, готового продукта и выявления источника микробиологической порчи продукта.

Проведение анализа

Посев в среду Кесслер

В среду Кесслер проводят посев продуктов в количествах, указанных в таблице 11.

Таблица 11

Объем или масса засеваемого продукта при определении БГКП на среде Кесслер

По 1 см3 соответствующих разведений продукта засевают в пробирки с 5 см3 среды Кесслер.

Посев 10 см3 пастеризованного молока, отобранного после пастеризатора, и 10 см3 закваски проводится в колбочки с 40 — 50 см3 среды Кесслер.

Культивирование

Пробирки с посевами помещают в термостат при (37 +/- 1) °C на 18 — 24 ч. При исследовании продуктов, хранящихся при минусовой температуре, пробирки с посевом выдерживают в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 48 ч.

Обработка результатов

Просматривают пробирки или колбы с посевами и определяют наличие бактерий группы кишечных палочек по газообразованию. При отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии БГКП. При наличии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов считается, что БГКП обнаружены в нем.

Картина роста бактерий группы кишечных палочек на жидкой среде Кесслер представлена в приложении Г.

6.5.7.2 Определение БГКП на плотной среде Кесслер

Сущность метода

Метод основан на способности БГКП сбраживать в питательной среде лактозу при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч с образованием кислоты и газа, которое фиксируется разрывами столбика среды. Метод применяется для внутрипроизводственного контроля и предназначен для оценки санитарно-гигиенических показателей сырья, производственного процесса, готового продукта и выявления источника микробиологической порчи продукта.

Проведение анализа

В пробирку с расплавленной и охлажденной до 40 — 50 °C плотной средой Кесслер вносят 1 см3 разведения продукта; а при взятии смыва — весь смывной раствор вместе с тампоном. Затем путем встряхивания пробирки хорошо размешивают среду с внесенным посевным материалом, дают ей застыть.

Культивирование

Посевы помещают в термостат с температурой (37 +/- 1) °C на 18 — 24 ч.

Обработка результатов

При наличии небольшого количества бактерий группы кишечных палочек в плотной среде Кесслер появляются трещины, при большом количестве этих бактерий в среде образуются пузырьки газа и агар разрывается.

Картина роста бактерий группы кишечных палочек на плотной среде Кесслер представлена в приложении Г.

6.5.7.3 Определение количества БГКП на среде АЖФК

Сущность метода

Метод основан на способности БГКП образовывать типичные колонии на плотной среде при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч и предназначен для оценки санитарно-гигиенических показателей готового продукта, в частности сыра, и выявления источника микробиологической порчи.

Проведение посева

Перед выполнением поверхностного посева среду расплавляют на водяной бане (или пользуются свежеприготовленной средой), охлаждают до 50 °C и разливают в стерильные чашки Петри примерно по 10 — 12 см3, чтобы среда ровно покрывала дно чашки. Чашки оставляют полуоткрытыми на 1 ч для подсушивания. Потом закрывают, маркируют и используют для анализа.

Разведения пастеризованного молока, сыра готовят в соответствии с таблицей 12. Каждое из выбранных разведений засевают по 0,1 см3 поверхностным способом. После посева чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой 37 °C на 16 — 24 ч, но не более 24 ч. Подсчитывают розовато-фиолетовые колонии диаметром больше 0,5 мм с более светлым по сравнению с центром ореолом.

Таблица 12

Объем или масса засеваемого продукта при определении БГКП на среде АЖФК

Посев на АЖФК можно проводить глубинным способом. Каждое разведение должно быть засеяно на 1 см3 в отдельную чашку Петри и залито расплавленным и охлажденным до 45 °C агаром желчным фиолетово-красным.

Сразу после заливки агара содержимое чашки следует тщательно перемешать путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 16 — 24 ч.

При определении БГКП в других молочных продуктах на среде АЖФК для проведения посева рекомендуется выбирать разведения, начиная с того, в котором БГКП должны отсутствовать, и два предыдущих.

Обработка результатов

При поверхностном посеве число колоний, выросших на каждой чашке Петри, для подсчета БГКП в 1 г или 1 см3 образца, умножают на 10 и на соответствующее разведение.

При глубинном посеве число колоний, выросших на каждой чашке, пересчитывают на 1 г или 1 см3 продукта с учетом разведения.

Картина роста бактерий группы кишечных палочек на среде АЖФК представлена в приложении Г.

6.5.7.4 Индикация БГКП на среде КОДА

Сущность метода

Метод основан на способности БГКП сбраживать в питательной среде лактозу при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч с образованием кислоты, что приводит к изменению цвета индикатора с зеленого на желтый при развитии цитратотрицательных БГКП. Метод предназначен для оценки санитарно-гигиенических условий производства и выявления источника микробиологической порчи продукта.

Проведение анализа

Смывную жидкость с тампоном или тампон, которым отбирали смыв, помещают в пробирки с 5 см3 среды КОДА.

Культивирование

Пробирки с посевами помещают в термостат при (37 +/- 1) °C на 18 — 24 ч.

Обработка результатов

Просматривают пробирки с посевами и определяют наличие бактерий группы кишечных палочек по изменению окраски. При отсутствии изменения окраски дают заключение об отсутствии бактерий группы кишечных палочек в смыве.

Картина роста бактерий группы кишечных палочек на среде КОДА представлена в приложении Г.

6.5.7.5 Метод дифференциации энтеробактерий на среде Эндо

Сущность метода

Метод основан на способности ферментирующих лактозу энтеробактерий (БГКП) образовывать на среде темно-красные колонии с характерным металлическим блеском вследствие взаимодействия образующихся альдегидов с фуксином в присутствии сульфита натрия при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч. Метод предназначен для дифференциации энтеробактерий по виду образуемых на среде колоний.

Проведение анализа

На среду Эндо делают посевы с накопительных сред (Кесслер, Кода, ГПС, ЛПС) с признаками роста БГКП.

Перед выполнением посева среду по 4.6.2.6 расплавляют на водяной бане (или пользуются свежеприготовленной средой), охлаждают до 50 °C и разливают в стерильные чашки Петри примерно по 10 — 12 см3, чтобы среда ровно покрывала дно чашки. Чашки со средой подсушивают по 5.6.2, закрывают, маркируют и используют для анализа.

Из пробирок и/или колбочек с накопительными средами с признаками роста БГКП, проводят посев петлей на среду Эндо. Исследуемый материал отбирают бактериальной петлей. Бактериальную петлю кладут на поверхность питательной среды и проводят штрихи по поверхности среды, располагая штрихи как можно ближе друг к другу для получения в конце штриха изолированных колоний. Для выполнения нескольких посевов на одной чашке дно чашки предварительно делят на равные сектора (рекомендуется не более 4 секторов). Техника посева описана в 5.6.2.2.

Культивирование

Чашки с посевами переворачивают вверх дном и помещают в термостат при (37 +/- 1) °C на 18 — 24 ч.

Обработка результатов

Результаты посевов оценивают визуально по характеру образовавшихся колоний:

• образование красных или темно-красных колоний с металлическим блеском на среде Эндо свидетельствует о принадлежности микроорганизмов, давших рост на накопительных питательных средах, к лактозоположительным энтеробактериям (БГКП);
• образование полупрозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний свидетельствует о принадлежности микроорганизмов, давших рост на накопительных питательных средах, к лактоотрицательным энтеробактериям.

При появлении на среде полупрозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний необходимо проводить контроль на предмет наличия патогенных энтеробактерий (сальмонеллы, шигеллы). Контроль проводится в лабораториях, лицензированных на право работы с патогенными микроорганизмами.

Чашки с посевами упаковываются в стерильную бумагу и/или контейнеры и передаются в лаборатории, лицензированные на право работы с патогенными микроорганизмами, для дальнейшего контроля.

Картина роста тест-культуры E. coli на среде Эндо представлена в приложении Г.

6.5.7.6 Определение БГКП с использованием микробитестов для определения редуцирующих бактерий

Сущность метода

Метод предназначен для контроля БГКП, коррелирующих с содержанием редуцирующих тетразолий хлористый бактерий, в неферментированных молочных продуктах (масле) и смывах с оборудования и основан на изменении цвета индикатора 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорида (ТТХ) при развитии редуцирующих бактерий, в том числе БГКП.

Проведение анализа

Из светонепроницаемого пакета, содержащего полиэтиленовые пакеты с микробитестами, вынимают один пакет с микробитестом и с одной стороны разрезают его ножницами. Микробитест вместе с полиэтиленовым пакетом перегибают вдоль по середине, вынимают из пакета, беря за перфорированный конец. Микробитест смачивают в исследуемом разведении путем однократного погружения, которое длится 5 с. Излишек влаги удаляют путем прикосновения конца микробитеста к стенке пробирки или колбы с разведением. При намачивании микробитест впитывает 0,2 см3 разведения продукта или смыва. Затем микробитест вновь помещают в полиэтиленовый пакет, перфорированный конец удаляют. После помещения микробитеста в пакет для удаления воздуха из пакета его следует тщательно прогладить рукой, чтобы полиэтиленовая пленка с обеих сторон плотно прилегла к смоченному микробитесту. Разрезанную сторону пакета зажимают между двумя пластинками из негорючего материала, запаивают на пламени горелки и помещают в пакет из светонепроницаемого материала.

Культивирование

Пакет из светонепроницаемого материала с микробитестом помещают в термостат и выдерживают при температуре 37 °C в течение (43 +/- 2) ч. Микробитест в термостате должен находиться в строго горизонтальном положении.

Обработка результатов

После культивирования проводят подсчет колониеобразующих единиц (красных точек) на обеих сторонах микробитеста.

Количество редуцирующих бактерий X2 в 1 см3 (г) исследуемого объекта подсчитывают по формуле

X₂ = 5·a·10в, (2)

где a — количество колониеобразующих единиц (красных точек) на микробитесте;

в — разведение продукта.

Примечания

Если подсчет невозможно провести сразу по извлечении микробитеста из термостата, микробитест хранят в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C не более 24 ч.

Микробитесты для определения редуцирующих бактерий хранят только в светонепроницаемых пакетах, а при работе предохраняют от действия солнечного света. Микробитесты для определения редуцирующих бактерий должны иметь белый или слегка кремовый цвет. Розовый цвет микробитеста указывает на его засвеченность, и для проведения испытаний он не пригоден.

Картина роста бактерий группы кишечных палочек на микробитесте представлена в приложении Г.

6.5.8 Метод определения дрожжей и плесневых грибов

6.5.8.1 Определение количества дрожжей и плесневых грибов на плотных питательных средах

Сущность метода

Метод основан на высеве продукта или гомогената продукта и (или) их разведений в питательные среды (среда Сабуро, среда агаровая для определения дрожжей и плесеней и др.), определении принадлежности выделенных микроорганизмов к плесневым грибам и дрожжам по характерному росту на питательных средах и по морфологии клеток. Метод предназначен для оценки санитарно-гигиенических показателей сырья, производственного процесса, готового продукта и выявления источника микробиологической порчи продукта.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения.

Для определения количества дрожжей и плесневых грибов выбирают те разведения, при посевах которых на чашках вырастает от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

Посев

Из каждой пробы делают посев по 1 см3 продукта или его соответствующих разведений на 2 — 3 чашки Петри. В каждую чашку с заранее промаркированной крышкой добавляют не позднее чем через 15 мин (14 +/- 1) см3 питательной среды, охлажденной до (45 +/- 1) °C, содержимое чашки Петри немедленно тщательно перемешивают и оставляют на горизонтальной поверхности до застывания питательной среды.

Культивирование

После застывания сред чашки Петри переворачивают вверх дном и ставят в таком виде в термостат с температурой (24 +/- 1) °C на 5 сут.

Через 3 сут термостатирования проводят подсчет типичных колоний, а через 5 сут окончательный подсчет, наблюдая за ростом дрожжей и плесневых грибов визуально, а при необходимости проводят микроскопирование выросших колоний.

Обработка результатов

Каждую чашку помещают вверх дном на темном фоне и проводят подсчет количества выросших колоний, пользуясь лупой с увеличением в 4 — 10 раз.

Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки.

Колонии дрожжей на агаровых средах образуют выпуклые, блестящие серовато-белые колонии с гладкой поверхностью и ровным краем. В среде агаровой для определения дрожжей и плесневых грибов дрожжи могут образовывать глубинные колонии белого цвета звездообразной формы с четким краем.

Плесневые грибы имеют различную окраску и образуют на питательных средах пушистый мицелий.

При необходимости проводят микроскопические исследования. Препараты готовят способом раздавленной капли и/или способом фиксирования и окрашивания по 6.4.

Результаты микроскопирования оценивают, пользуясь характеристикой дрожжей и плесневых грибов, указанной в таблице 13.

Таблица 13

Характеристика дрожжей и плесневых грибов

Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен рост дрожжей и плесневых грибов и их присутствие подтверждено микроскопированием, то дают заключение о присутствии этих микроорганизмов в продукте.

Результаты обрабатывают и пересчитывают отдельно для дрожжей и плесневых грибов.

Количество дрожжей и плесневых грибов X3 в 1 г или в 1 см3 продукта вычисляют по формуле

X_{3} = \frac{\sum C}{n_{1} + n_{2} \cdot 0,1} \cdot 10^{n} , (3)

где \sum C — сумма всех подсчитанных колоний на чашках Петри в двух последовательных десятикратных разведениях при условии, что на каждой чашке число колоний отвечает требованиям, указанным выше;

n1 — количество чашек Петри, подсчитанное для меньшего разведения, т.е. для более концентрированного разведения продукта;

n2 — количество чашек Петри, подсчитанное для большего разведения;

n — степень разведения продукта (для меньшего разведения).

Картина роста дрожжей и плесневых грибов на плотных питательных средах представлена в приложении Г.

6.5.8.2 Определение дрожжей и плесневых грибов в атмосфере производственных помещений при производственном контроле с использованием микробитестов

Сущность метода

Метод основан на способности дрожжей и плесневых грибов образовывать колонии на поверхности микробитестов при температуре (25 +/- 1) °C в течение (72 +/- 6) ч.

Проведение анализа

Из светонепроницаемого пакета, содержащего полиэтиленовые пакеты с микробитестами, вынимают один пакет с микробитестом и с одной стороны разрезают его ножницами.

Микробитест вынимают из полиэтиленового пакета профламбированным пинцетом, затем его смачивают в стерильной воде и помещают в стерильную чашку Петри.

Чашки Петри со смоченными микробитестами размещают в производственных помещениях, открывают и выдерживают открытыми в течение 5 мин, затем закрывают и помещают в термостат.

Примечание - Микробитесты для определения дрожжей и плесневых грибов хранят только в светонепроницаемых пакетах, а при работе предохраняют от действия солнечного света. Микробитесты должны иметь светло-голубой цвет с зеленоватым оттенком.

Культивирование

Для предотвращения возможного высыхания микробитестов чашки с микробитестами перед термостатированием рекомендуется поместить в полиэтиленовый пакет. Пакеты с чашками помещают в термостат в горизонтальном положении крышками вверх.

Чашки с микробитестами выдерживают в термостате при температуре (25 +/- 1) °C в течение (72 +/- 6) ч.

Обработка результатов

После термостатирования проводят подсчет колоний дрожжей и плесневых грибов на верхней стороне микробитеста.

Дрожжи растут на микробитестах в виде точек розового или кремового цвета, а плесневые грибы — колониями разной окраски, по внешнему виду аналогично колониям плесневых грибов на агаровой среде для определения дрожжей и плесеней. При появлении на микробитестах колоний, нехарактерных по внешнему виду для колоний дрожжей и плесневых грибов, проводят микроскопирование для выявления и исключения споровых аэробов.

Картина роста дрожжей и плесневых грибов на микробитестах представлена в приложении Г.

6.5.9 Определение общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий

Сущность метода

Метод основан на способности спор мезофильных анаэробных бактерий, сохранившихся после тепловой обработки исследуемого материала или его разведений при температуре (75 +/- 1) °C в течение 30 мин, прорастать, размножаться и давать видимые признаки роста в питательных средах. Метод предназначен для оценки сыропригодности молока — сырья и выявления источника микробиологической порчи продукта.

Подготовка образцов к анализу

Подготовка образцов жидких молочных продуктов

От пробы жидких молочных продуктов (молоко-сырье, восстановленное молоко и другие, аналогичные по консистенции продукты) отбирают для анализа по 15 см3 и переносят пипеткой в стерильные пробирки, которые закрывают стерильными ватными пробками. При этом необходимо следить, чтобы капельки продукта не попадали на стенки пробирок.

Подготовленные пробирки с исследуемыми образцами вместе с контрольной пробиркой, в которой находится 10 см3 продукта и термометр, помещают в водяную баню. Уровень воды в водяной бане должен быть выше уровня продукта на 10 — 15 мм. Пробирки выдерживают при температуре (75 +/- 1) °C в течение (30 +/- 3) мин, затем быстро охлаждают до комнатной температуры, погружая их в холодную воду.

В зависимости от обсемененности исследуемого жидкого молочного продукта спорами мезофильных анаэробных бактерий из прогретых проб готовят десятикратные разведения.

Перед проведением посева допускается прогрев как исходных образцов продукта, так и их разведений.

Подготовка проб сыра и аналогичных по консистенции молочных продуктов

Подготовленные пробирки с разведениями проб сыра вместе с контрольной пробиркой, в которой находятся термометр и 10 см3 раствора хлористого натрия по 4.3.3 или воды, помещают в водяную баню и выдерживают при температуре (75 +/- 1) °C в течение (30 +/- 3) мин.

Проведение анализа

Для определения количества спор мезофильных анаэробных бактерий проводят посев 1 см3 исследуемого образца (для молока — нулевое, первое и второе, для сыра — первое и второе разведения) в пробирку с (10 +/- 2) см3 питательной среды СДА, приготовленной по 4.6.2.9, выдержанной перед анализом в кипящей водяной бане в течение 30 мин и охлажденной до температуры (40 +/- 1) °C.

Каждое из выбранных разведений исследуемого продукта засевают в две пробирки с питательной средой, внося посевной материал на дно пробирки, не допуская взбалтывания среды и не выдувая посевной материал.

Сверху посевы заливают слоем водного агара по 4.6.2.13, предварительно расплавленного до температуры (45 +/- 1) °C. Высота слоя водного агара должна быть не менее (20 +/- 5) мм.

При использовании для посева пробирок со средой, разлитой высоким столбиком, допускается не заливать посевы защитным слоем водного агара.

Пробирки с посевом помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 72 ч.

Обработка результатов

Наличие спор мезофильных анаэробных бактерий в засеянных объемах исследуемого продукта определяют по появлению разрывов агарового столбика (газообразованию), образуемых при росте этих бактерий газами, а также изменению окраски среды с красной на желтую.

В посевах без защитного слоя рост мезофильных анаэробных бактерий определяют по пенообразованию, образованию «карманов» в столбике среды и изменению цвета питательной среды с красного на желтый. В данном случае основным признаком роста является изменение окраски, т.к. процесс газообразования может быть не зафиксирован.

Наиболее вероятное число спор мезофильных анаэробных бактерий при анализе молока определяют по числу пробирок, в которых они дали рост (см. таблицу 14).

Наиболее вероятное число спор мезофильных анаэробных бактерий при анализе сыра определяют по числу пробирок, в которых они дали рост с посевом 0,1 и 0,01 см3 (см. таблицу 14).

Таблица 14

НВЧ спор мезофильных анаэробных бактерий при контроле молока и сыра

Результаты, в которых количество пробирок с видимыми признаками роста мезофильных анаэробных бактерий при посевах 1; 0,1 и 0,01 см3 молока или сыра соответственно равно 002, 012, 021, 022, 102, 112, 122, 202, не могут быть использованы для расчета, так как в 95% случаев они вызваны несовершенной техникой приготовления разведений или присутствием антибактериальных веществ. В данных случаях исследования повторяют.

Картина роста споровых анаэробных бактерий на среде СДА представлена в приложении Г.

6.5.10 Определение спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих бактерий в молоке и сырах

Сущность метода

Метод основан на способности спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих бактерий, сохранившихся после тепловой обработки исследуемого материала или его разведений при температуре (75 +/- 1) °C в течение 30 мин, прорастать, размножаться и давать видимые признаки роста в питательных средах. Метод предназначен для оценки сыропригодности молока-сырья и выявления источника микробиологической порчи продукта.

Подготовка образцов к анализу

Подготовка образцов проводится по ₆.₅.9.

Проведение анализа

Для определения количества спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих бактерий в молоке и сырах проводят посев 1 см3 исследуемого образца (для молока — нулевое, первое и второе, для сыра — первое и второе разведения) в пробирку с (10 +/- 2) см3 питательной среды ЛАССА, приготовленной по 4.6.2.10, выдержанной перед анализом в кипящей водяной бане в течение 30 мин и охлажденной до температуры (40 +/- 1) °C.

Каждое из выбранных разведений исследуемых молока или сыра засевают в две пробирки с питательной средой, внося посевной материал на дно пробирки, не допуская взбалтывания среды и не выдувая посевной материал.

Сверху посевы заливают слоем предварительно расплавленного до температуры (45 +/- 1) °C водного агара, приготовленного по 4.6.2.13. Высота слоя водного агара должна быть не менее (20 +/- 5) мм.

При использовании для посева пробирок со средой, разлитой высоким столбиком, допускается не заливать посевы защитным слоем водного агара.

Пробирки с посевом помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 72 ч.

Обработка результатов

Рост мезофильных анаэробных лактатсбраживающих бактерий в посевах на среду ЛАССА определяют по образованию разрывов столбика агара и изменению цвета питательной среды с красного на соломенно-желтый. Образование в среде желтых пятен или точек также указывает на наличие лактатсбраживающих анаэробных бактерий.

В посевах без защитного слоя рост мезофильных анаэробных лактатсбраживающих бактерий в посевах на среду ЛАССА определяют по пенообразованию, образованию «карманов» в столбике среды и изменению цвета питательной среды с красного на соломенно-желтый. В данном случае основным признаком роста является изменение окраски, т.к. процесс газообразования может быть не зафиксирован.

Наиболее вероятное число спор лактатсбраживающих анаэробных бактерий рассчитывают в соответствии с 6.5.9.

6.5.11 Методы выявления технически вредных термоустойчивых микроорганизмов (термофильных молочнокислых палочек и дрожжей)

При появлении ряда характерных пороков вкуса и консистенции молочных продуктов, связанных с чрезмерным развитием термостойких молочнокислых палочек и дрожжей, проводят усиленный контроль по их выявлению.

Критическими контрольными точками являются оборудование и пастеризованное молоко или сливки. Метод предназначен для оценки санитарно-гигиенического состояния сырья, производственного процесса, готового продукта и выявления источника микробиологической порчи продукта.

6.5.11.1 Выявление термоустойчивых микроорганизмов (молочнокислых палочек и дрожжей) на технологическом оборудовании

Сущность метода

Метод основан на способности термофильных молочнокислых палочек и дрожжей развиваться в молоке при температуре (42 +/- 2) °C с образованием сгустка (или без него в случае развития дрожжей) в течение 16 — 24 ч.

Проведение анализа

Стерильным тампоном, смоченным стерильным раствором хлористого натрия или стерильной водой, протирают исследуемый участок оборудования. Тампон опускают в пробирку со стерильным молоком.

Культивирование

Посевы выдерживают в течение 16 — 24 ч при температуре (42 +/- 2) °C (для выявления палочек) или при (24 +/- 1) °C (для выявления дрожжей).

Обработка результатов

После окончания культивирования просматривают пробирки с посевами и готовят микроскопические препараты.

Образование сгустка молока и наличие в микропрепарате палочек свидетельствуют о наличии термофильных молочнокислых палочек.

Наличие дрожжей определяют по микропрепарату.

6.5.11.2 Выявление термоустойчивых микроорганизмов (молочнокислых палочек) в пастеризованном молоке или сливках

Сущность метода

Метод основан на способности термостойких молочнокислых палочек развиваться в молоке при температуре (42 +/- 2) °C с образованием сгустка.

Проведение анализа

Готовят разведения исследуемого образца пастеризованного молока или сливок в стерильном растворе хлористого натрия или стерильной воды. Полученные разведения засевают в стерильное обезжиренное молоко по 4.6.2.14 (до 6 разведения).

Культивирование

Посевы выдерживают при температуре (42 +/- 2) °C в течение 72 ч.

Обработка результатов

Полученные сгустки микроскопируют и устанавливают наличие в них палочек.

6.6 Методы определения заквасочных микроорганизмов

6.6.1 Методы определения молочнокислых микроорганизмов

6.6.1.1 Метод определения общего количества молочнокислых микроорганизмов на среде КМАФАнМ

Сущность метода

Метод основан на подсчете колоний молочнокислых микроорганизмов, вырастающих на плотной питательной среде КМАФАнМ при (30 +/- 1) °C в течение 72 ч.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного содержания молочнокислых микроорганизмов в соответствии с таблицей 15.

Таблица 15

Объем или масса засеваемого продукта при определении молочнокислых микроорганизмов

Посев

Для определения общего количества молочнокислых микроорганизмов выбирают те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Из каждой пробы делают посев на две-три чашки из разведений, указанных в таблице 15 в соответствии с 5.6.1. Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см3 в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито (14 +/- 1) см3 расплавленной и охлажденной до температуры 40 — 45 °C питательной средой для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Культивирование

После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой (30 +/- 1) °C на 72 ч.

Обработка результатов

Каждую чашку помещают вверх дном на темном фоне и проводят подсчет количества выросших колоний, пользуясь лупой с увеличением в 4 — 10 раз.

Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке аналогично 6.5.1.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

6.6.1.2 Метод определения общего количества термофильных молочнокислых микроорганизмов

Сущность метода

Метод основан на подсчете колоний молочнокислых микроорганизмов, вырастающих на плотной питательной среде КМАФАнМ при (45 +/- 1) °C в течение 72 ч.

Проведение анализа

Анализ проводится аналогично 6.6.1.1, за исключением температуры культивирования, которая составляет (45 +/- 1) °C.

6.6.1.3 Метод определения общего количества молочнокислых микроорганизмов на стерильном молоке

Сущность метода

Метод основан на способности мезофильных молочнокислых бактерий развиваться при температуре (30 +/- 1) °C, а термофильных при (45 +/- 1) °C в обезжиренном молоке, выделяя кислоту. В результате чего молоко сворачивается, образуя сгусток в течение 72 ч.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева, количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного содержания этих микроорганизмов в продукте.

Посев

Из каждой пробы делают ряд последовательных разведений (до 10). Из последних трех-четырех разведений вносят по 1 см3 в 2 параллельные пробирки со стерильным обезжиренным молоком (4.6.2.14).

Культивирование

Пробирки с посевами помещают в термостат и выдерживают при температуре (30 +/- 1) °C для учета мезофильных молочнокислых бактерий или при температуре (45 +/- 1) °C для учета термофильных молочнокислых бактерий. Посевы выдерживают 72 ч.

Обработка результатов

В результате развития молочнокислых микроорганизмов в молоке образуется сгусток. Процесс образования сгустка фиксируется визуально.

Для проведения анализа состава молочнокислых микроорганизмов готовят микропрепараты. По микроскопическому препарату отмечают три последних разведения, содержащие определяемую группу микроорганизмов (палочки или кокки).

При подсчете количества бактерий пользуются методом НВЧ по 5.6.4.

Картина роста мезофильных и термофильных молочнокислых микроорганизмов представлена в приложении Г.

6.6.1.4 Определение общего количества ароматообразующих микроорганизмов

Сущность метода

Метод основан на способности цитратсбраживающих ароматообразующих микроорганизмов при развитии их на плотных питательных средах с цитратом кальция в течение 48 — 72 ч при температуре (30 +/- 1) °C образовывать зоны просветления вокруг колоний.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного содержания ароматообразующих микроорганизмов в соответствии с таблицей 16.

Таблица 16

Объем или масса засеваемого продукта при определении общего количества ароматообразующих микроорганизмов

Посев

Для определения общего количества ароматообразующих мезофильных факультативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 20 и не более 200 колоний. Из каждой пробы делают посев на две-три чашки из разведений, указанных в таблице 16 в соответствии с 5.6.1. Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см3 в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито (14 +/- 1) см3 расплавленной и охлажденной до температуры 40 — 45 °C питательной средой, приготовленной по 4.6.2.15. Осадок нерастворимого цитрата кальция в среде перед заливкой чашек необходимо тщательно перемешать до его равномерного распределения в среде.

Культивирование

После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой (30 +/- 1) °C на 48 — 72 ч.

Обработка результатов

Каждую чашку помещают вверх дном на темном фоне и проводят подсчет количества колоний, образовавших зоны просветления, пользуясь лупой с увеличением в 4 — 10 раз.

Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами.

Количество колоний, образовавших зоны просветления, подсчитывают на каждой чашке аналогично 6.5.1.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

Картина роста цитратсбраживающих ароматообразующих микроорганизмов представлена в приложении Г.

6.6.1.5 Определение молочнокислых микроорганизмов можно проводить на средах, предусмотренных в ГОСТ 10444.11. Данные среды могут быть использованы в качестве арбитражных.

6.6.2 Определение количества бифидобактерий

6.6.2.1 Определение количества бифидобактерий в плотных питательных средах

Сущность метода

Метод основан на способности бифидобактерий размножаться в анаэробных условиях на питательных средах при температуре (37 +/- 1) °C с образованием типичных колоний.

Проведение анализа

Перед проведением анализа среду по 4.6.2.11, разлитую высоким столбиком, нагревают в кипящей водяной бане до полного расплавления агара в среде и выдерживают в кипящей водяной бане в течение (25 +/- 5) мин для снижения в ней растворенного кислорода с целью усиления анаэробных свойств.

При определении бифидобактерий в смешанных с молочнокислыми бактериями культурах перед расплавлением в среду вносят стерильный раствор неомицина (4.5.5.1) или диклоксациллина (4.5.5.2). После расплавления среды пробирки охлаждают в водяной бане до температуры (45 +/- 2) °C.

Готовят разведения продукта с 1 по 7 (при посеве бифидосодержащего БК — с 1 по 9). Для выявления максимально возможного количества бифидобактерий, при необходимости, можно засевать вплоть до 12-го разведения.

Затем из трех-четырех последних разведений берут пипеткой по 1 см3 и вносят в пробирки со средой. Пипетка с отобранным разведением опускается на дно пробирки, а затем медленно поднимается вращательным движением, таким образом, чтобы тщательно перемешать разведение со средой, не допустить попадание воздуха и ограничить пристеночный рост.

Проводят два параллельных определения.

Выращивание

Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 2 — 3 сут, в случае определения бифидобактерий в смешанных с молочнокислыми бактериями культурах — 3 - 5 сут.

Обработка результатов

По окончании инкубирования учитывают последние пробирки, в которых выросли типичные для бифидобактерий колонии — в виде крупных «дисков» или «гречишных зерен». Отмечают разведение и подсчитывают количество выросших колоний.

Подтверждение принадлежности образовавшихся типичных колоний к бифидобактериям проводят методом микроскопирования.

Из типичных колоний последнего разведения готовят мазки, окрашенные метиленовым голубым по 4.4.2.2. При приготовлении микропрепарата на чистое предметное стекло наносят петлей небольшую каплю стерильной воды или физраствора и исследуемый материал, взятый с колонии. Материал тщательно размешивают и распределяют на площади около 1 см2. Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют в пламени горелки и красят метиленовым голубым. Бифидобактерии в препаратах имеют вид тонких, мелкозернистых, слегка изогнутых палочек с утолщениями на концах или без них; располагаются группами, в виде римских пятерок (V), скоплениями в виде китайских иероглифов, и могут образовывать короткие цепочки.

Вычисление содержания живых бифидобактерий X4 в 1,0 см3 (г) продукта проводят по формуле

X4 = a·10n, (4)

где X4 — количество живых бифидобактерий в 1,0 см3 (г) продукта;

a — среднее количество колоний в учитываемом разведении продукта, засеянном в 2 параллельных ряда;

10 — коэффициент децимального разведения;

n — показатель разведения продукта, в котором отмечен рост бифидобактерий.

Для определения истинного количества бифидобактерий в среде с неомицином результат следует удвоить.

Картина роста бифидобактерий на плотных питательных средах представлена в приложении Г.

6.6.2.2 Определение количества бифидобактерий в полужидких питательных средах

Сущность метода

Метод основан на способности бифидобактерий давать рост в питательных средах, разлитых высоким столбиком в пробирках, с образованием колоний при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 — 72 ч.

Проведение анализа

Перед проведением анализа среду для учета клеток бифидобактерий (4.6.2.12) следует разогреть в кипящей водяной бане в течение (20 +/- 5) мин.

При определении бифидобактерий в смешанных с молочнокислыми бактериями культурах перед расплавлением в среду вносят стерильный раствор неомицина (4.5.5). После расплавления пробирки охлаждают в водяной бане до температуры (45 +/- 2) °C.

Готовят разведения продукта с 1 по 7 (при посеве бифидосодержащего БК — с 1 по 9).

Затем из трех-четырех последних разведений берут пипеткой по 1 см3 и вносят в пробирки со средой. Проводят два параллельных определения, при этом пробирки располагают в два параллельных ряда.

Пипетка с отобранным разведением опускается до дна пробирки, а затем медленно поднимается вращательным движением, чтобы тщательно перемешать разведение со средой, не допустить попадания воздуха и ограничить пристеночный рост.

Культивирование

Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение (72 +/- 1) ч. Допускается предварительный учет через (48 +/- 1) ч с последующим окончательным учетом через (72 +/- 1) ч.

Обработка результатов

По окончании инкубирования учитывают последние пробирки, в которых выросли типичные для бифидобактерий колонии — в виде «гвоздиков», «вытянутых веретен», иногда в виде «полос», расположенных вдоль пробирки.

Подтверждение наличия бифидобактерий — методом микроскопирования.

Из типичных колоний последнего разведения и со дна пробирки последующего разведения (без видимого роста типичных колоний бифидобактерий) готовят препараты, окрашенные метиленовым голубым (по 4.4.2.2). При приготовлении микропрепарата на чистое предметное стекло наносят петлей небольшую каплю исследуемого материала и распределяют на площади около 1 см2. Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют в пламени горелки и красят метиленовым голубым. Бифидобактерии имеют вид тонких, мелкозернистых, слегка изогнутых палочек с утолщениями на концах или без них; располагаются группами, в виде римских пятерок (V), скоплений в виде китайских иероглифов, могут образовывать короткие цепочки.

Поскольку анализируемые продукты, обогащенные бифидобактериями, являются кисломолочными, в мазках, в зависимости от вида продукта, могут присутствовать микроорганизмы молочнокислых заквасок (молочнокислые лактококки и палочки).

Вычисление содержания живых бифидобактерий X5 в 1,0 см3 (г) продукта проводят по формуле

X5 = a·10n, (5)

где a — среднее количество колоний в последнем разведении продукта, засеянном в 2 параллельных ряда:

10 — коэффициент децимального разведения;

n — показатель последнего разведения продукта, в котором отмечен рост бифидобактерий.

При обнаружении бифидобактерий микроскопией мазков придонного материала из того разведения, в котором не отмечено видимого роста колоний, учитывают степень этого разведения.

Для определения истинного количества бифидобактерий в среде с неомицином результат следует удвоить.

Картина роста бифидобактерий в полужидких питательных средах представлена в приложении Г.

6.6.3 Определение пропионовокислых бактерий

Сущность метода

Метод основан на подсчете колоний пропионовокислых бактерий, вырастающих в высоком столбике плотной питательной среды при (30 +/- 1) °C в течение 5 — 7 сут.

Проведение анализа

Подготовка к анализу

Перед проведением анализа среду по 4.6.2.17, разлитую при приготовлении высоким столбиком в пробирки П1-21-200ТС или П2-21-200ТС с диаметром (21 +/- 2) мм и высотой (200 +/- 2) мм, нагревают в кипящей водяной бане до полного расплавления агара в среде и выдерживают в кипящей водяной бане в течение (25 +/- 5) мин для снижения в ней растворенного кислорода с целью усиления анаэробных свойств. После расплавления пробирки охлаждают в водяной бане до температуры (45 +/- 2) °C.

Посев

При исследовании продукта или БК, содержащего пропионовокислые бактерии, готовят разведения с 1 по 7, при посеве моновидовых БК пропионовокислых бактерий готовят разведения с 1 по 9.

Затем из трех-четырех последних разведений берут пипеткой по 1 см3 и вносят в пробирки со средой. Пипетка с отобранным разведением опускается до дна пробирки, а затем медленно поднимается вращательным движением, таким образом, чтобы тщательно перемешать разведение со средой, не допустить попадание воздуха и ограничить пристеночный рост. Пробирки с посевами охлаждают до застывания агара.

Проводят два параллельных определения.

Культивирование

После застывания агара пробирки с посевами помещают в термостат с температурой (30 +/- 1) °C на 5 — 7 сут.

Обработка результатов

По окончании инкубирования учитывают последние пробирки, в которых выросли типичные для пропионовокислых бактерий колонии — в виде крупных «дисков» или «гречишных зерен» обычно светло-кремового цвета. Колонии могут быть белыми, серыми, розовыми, красными, желтыми или оранжевыми. Отмечают разведение и подсчитывают количество выросших колоний.

Подтверждение принадлежности образовавшихся типичных колоний к пропионовокислым бактериям проводят методом микроскопирования и пробой на каталазу.

Из типичных колоний последнего разведения готовят мазки, окрашенные метиленовым голубым по 4.4.2.2. При приготовлении микропрепарата на чистое предметное стекло наносят петлей небольшую каплю стерильной воды или физраствора и исследуемого материала, взятого с колонии. Материал тщательно перемешивают с водой или физраствором и распределяют на площади около 1 см2. Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют в пламени горелки и красят метиленовым голубым. Пропионовокислые бактерии в препаратах имеют вид дифтероидных или булавовидных палочек с одним округленным концом, другой конец может быть конусообразным или заостренным, окрашивающимся менее интенсивно. Клетки некоторых культур могут быть кокковидными, удлиненными, раздвоенными и даже разветвленными. Клетки обычно располагаются поодиночке, парами, в виде букв V и Y, короткими цепочками или группами в виде «китайских иероглифов».

Проверку каталазной активности колоний, взятых для микроскопирования, проводят по 6.3.1. Пропионовокислые бактерии являются каталазоположительными.

Вычисление содержания пропионовокислых бактерий X6 в 1,0 см3 (г) продукта проводят по формуле

X6 = a·10n, (6)

где X6 — количество пропионовокислых бактерий в 1,0 см3 (г) продукта;

a — среднее количество колоний в учитываемом разведении продукта, засеянном в 2 параллельных ряда;

10 — коэффициент децимального разведения;

n — показатель разведения продукта, в котором отмечен рост пропионовокислых бактерий.

6.6.4 Методы определения дрожжей в кисломолочных напитках (кефир и др.)

Определение дрожжей в кисломолочных напитках проводят в соответствии с 6.5.8 или ГОСТ 10444.12.

6.7 Методы контроля эффективности термообработки молока и молочных продуктов

6.7.1 Проверка эффективности пастеризации

6.7.1.1 Эффективность пастеризации контролируют в соответствии с требованиями ГОСТ 3623 определением щелочной или кислой фосфатазы, или пероксидазы в зависимости от вида пастеризации (низкотемпературная или высокотемпературная) путем испытания проб молока или продуктов его переработки.

Эффективность низкотемпературной пастеризации контролируют по отсутствию активности щелочной фосфатазы, инактивация которой происходит при температуре не ниже 63 °C с выдержкой 30 мин. Определение щелочной фосфатазы применяют для контроля эффективности пастеризации молока в сыроделии.

Эффективность высокотемпературной пастеризации контролируют по отсутствию активности пероксидазы, которая инактивируется при температуре пастеризации не ниже 80 °C с выдержкой 20 — 30 с. Определение пероксидазы применяют для контроля эффективности пастеризации при получении продуктов, в технологии производства которых заложены температуры пастеризации более высокие, чем температура инактивации данного фермента.

Эффективность высокотемпературной пастеризации контролируют по отсутствию активности кислой фосфатазы, инактивация которой происходит при температуре не ниже 85 °C с выдержкой 30 мин или при более высоких температурах пастеризации с соответственно меньшим временем выдержки. Определение кислой фосфатазы применяют для контроля эффективности пастеризации молока и сливок в маслоделии.

6.7.1.2 Эффективность пастеризации молока и жидких сырьевых компонентов контролируют микробиологическим методом — путем испытания проб, отобранных после секции охлаждения, на наличие санитарно-показательных микроорганизмов (БГКП) по 6.5.7.1.

6.7.2 Метод определения промышленной стерильности

Сущность метода

Метод основан на способности микроорганизмов, выдержавших стерилизацию, размножаться и давать рост в стерилизованных молочных продуктах при температуре 37 °C в течение 3 — 5 сут и вызывать в них органолептические и физико-химические изменения.

После термостатной выдержки допускаются следующие изменения:

• титруемой кислотности не более, чем на 2 °T;
• КМАФАнМ — не более 10 КОЕ/см3 (г).

Проведение анализа стерилизованных молочных продуктов, в том числе масла сливочного стерилизованного и сыра плавленого специального назначения

Отобранные по 5.2 единицы потребительской тары со стерилизованным продуктом выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 3 — 5 сут. По истечении срока термостатной выдержки упаковочные единицы с продуктом охлаждают до (20 +/- 5) °C и подвергают внешнему осмотру.

При наличии вздутия крышки или донышка упаковки, не опадающего при нажатии пальцами, упаковочную единицу с продуктом считают бракованной и отмечают в журнале.

Стерилизованные молочные продукты не подлежат оценке на промышленную стерильность, если:

• обнаружена негерметичность швов или укупорки тары;
• после термостатирования и охлаждения обнаружены дефектные упаковочные единицы.

Упаковочные единицы без внешних дефектов вскрывают, анализируют органолептически и по микробиологическим показателям безопасности.

Если при анализе стерилизованного продукта в герметично укупоренной таре продукт сохранил после термостатирования стандартный внешний вид, значение его кислотности соответствует значению, указанному в нормативном документе, а при микроскопировании продукта обнаружены единичные клетки (не более 10), и в посевах не обнаружены жизнеспособные микроорганизмы или обнаружены в допустимых пределах, то консервы считают промышленно-стерильными.

7 Организация контроля санитарно-гигиенического состояния производства

Санитарно-гигиеническое состояние производства должно обеспечивать выпуск продукции гарантированного качества за счет организации системы мер и осуществления контроля по их исполнению. Контроль за санитарно-гигиеническим состоянием производства предполагает:

• контроль санитарно-гигиенического состояния оборудования, трубопроводов, инвентаря, упаковочных материалов и т.д.;
• контроль санитарно-гигиенического состояния воздушной среды производственных помещений;
• контроль гигиенического состояния питьевой воды;
• контроль соблюдения гигиены работниками предприятия.

7.1 Контроль санитарно-гигиенического состояния оборудования, трубопроводов, инвентаря, упаковочных материалов и т.д.

Контроль санитарно-гигиенического состояния оборудования, трубопроводов, инвентаря, упаковочных материалов и т.д. проводится путем взятия смывов с их поверхности и последующем их анализе.

Подготовка к проведению анализа

Для отбора смывов можно использовать:

• стерильную воду;
• раствор хлористого натрия;
• жидкую среду Кесслер (выходной контроль);
• среду Кода.

Смывы отбирают:

• стерильными ватными тампонами, закрепленными на стеклянных, металлических или деревянных палочках, которые вставлены в пробирки с ватными или другими пробками;
• ватными или марлевыми тампонами, стерилизованными в бумажных пакетах, с использованием стерильных (профламбированных) пинцетов.

Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют путем наклонения пробирки или опусканием тампона в жидкость.

В исследуемых смывах контролируют:

• КМАФАнМ — посевом 1 см3 смывной жидкости;
• отсутствие/наличие БГКП во всем объеме смывной жидкости, включая тампон.

При необходимости определения КМАФАнМ и БГКП смывы готовят в растворе хлористого натрия или воды, которые разливают в пробирки по 5 см3. Стерильный тампон смачивают в растворе хлористого натрия или воды, делают смыв и возвращают тампон в пробирку. Пробирку тщательно встряхивают.

Проведение анализа

Из полученного смыва отбирают 1 см3 для посева на КМАФАнМ (4.6.2.1), а остальное переносят в среду Кесслер (4.6.2.2 А) или среду КОДА (4.6.2.3) для определения признаков роста БГКП. В смывах, приготовленных с использованием раствора хлористого натрия или воды, БГКП можно определять с использованием микробитестов для редуцирующих бактерий (6.4.10.4).

При определении только БГКП отбор смывов можно проводить непосредственно на среды Кесслер или КОДА, которые разливают в пробирки по 5 см3.

Тампон смачивают:

• либо непосредственно средой;
• либо раствором хлористого натрия или воды.

После проведения смывов тампоны либо возвращают в пробирку со средой, либо помещают в раствор хлористого натрия или воды, а затем всю смывную жидкость с тампоном переносят в пробирки со средой для дальнейшего проведения анализа.

Техника отбора смывов с оборудования, трубопроводов и инвентаря

Контроль качества мойки и дезинфекции трубопроводов, оборудования и инвентаря осуществляется непосредственно перед началом их работы (оборудование, не используемое после мойки и дезинфекции более 6 ч, вторично дезинфицируется перед началом работы).

Смывы с крупного оборудования и инвентаря берут с поверхности площадью 100 см2, используя стерильный трафарет площадью 100 см2 или 50 см2 (два раза). При отсутствии трафарета площадь смыва определяется визуально.

Смывы с мелкого оборудования и инвентаря берут со всей поверхности.

Смывы с оборудования, имеющего несколько поверхностей или сложную конфигурацию, делают с разных поверхностей в отдельности. Точками отбора смывов являются: дно, боковая поверхность, стенки около крана, рабочая поверхность крышки, мешалки и т.д.

В резервуарах большого объема, где взятие пробы с задних и верхних стенок резервуара из люка рукой невозможно, смывы делают при помощи специальных приспособлений (приспособления, дающие возможность удлинить ручку пробника), с соблюдением условий стерильности.

Смывы с кранов берут со всей поверхности крана в разобранном состоянии.

Микробиолог проводит контроль санитарно-гигиенического состояния оборудования и инвентаря без предупреждения в соответствии с порядком внутрипроизводственного контроля и качеством выпускаемой продукции.

Показатели санитарного состояния оборудования и инвентаря оцениваются в соответствии с таблицей 17. В случае несоответствия (превышения) показателей следует считать санитарную обработку неэффективной, что предполагает применение усиленных мер.

Таблица 17

<*> Посев смывной жидкости с рук проводят аналогично посевам смывов с оборудования.

Смывы с трубопроводов и шлангов делают со 100 см2 внутренней поверхности трубы, разбирая собранный для работы трубопровод в намеченном для исследования месте.

Для правильного взятия смыва проводится предварительный расчет глубины введения тампона внутрь трубы по формуле

Г = 100/3,14·D, (6)

где Г — глубина введения тампона внутрь трубы, см;

D — диаметр трубопровода, см.

Например, чтобы отобрать смыв с поверхности трубы диаметром 50 мм, вводят стерильный, смоченный тампон внутрь трубы на 6,5 см, а при диаметре 36 мм — на 9 см.

После ввода тампона в трубу на требуемую глубину его продвигают к выходу, делая вращательные движения.

Смывы с безразборного трубопровода, или трубопровода большой протяженности, имеющего свободный доступ только к входу и выходу, проводят путем отбора последней порции промывных вод.

Вакуум-аппараты. При контроле чистоты мойки вакуум-аппарата смывы берут с трубок калоризаторов и с внутренних стенок сепаратора.

Смывы со стенок сепараторов берут через отверстия люка, с трубок калоризатора — после открытия крышки. С внутренней части десяти трубок калоризатора смывы берут специальным, приготовленным для этой цели длинным пинцетом или металлическим стержнем; на пинцет или металлический стержень навертывают кусочек стерильной ваты, смоченной в растворе хлористого натрия из колбы с 30 см3 раствора хлористого натрия. На стержне делают отметку на расстоянии 10 см от конца. Ватой протирают трубку калоризатора на глубине 10 см. Расчет количества микроорганизмов проводят на 100 см2 внутренней поверхности трубы.

С внутренних стенок вакуум-аппарата смыв берут также металлическим стержнем со стерильной ватой на конце с поверхности, приблизительно равной 100 м2.

Допускается определять качество мойки вакуум-аппарата путем исследования конденсата, собранного из крана выхода сгущенного продукта после пропаривания вакуум-аппарата.

Проводят посев 1 см3 смыва или конденсата на среду КМАФАнМ для определения общего количества бактерий и 1 см3 смыва или конденсата в 5 см3 среды Кесслер для определения БГКП.

Емкости малого и среднего размера (фляги, бидоны, ушаты и т.д.). Контроль чистоты мойки можно проводить методом смывов с определенной поверхности (дно, стенка, крышка) по 7.1.

Цеховой инвентарь (мешалки, мутовки, лотки и т.д.). Для оценки эффективности мойки цехового инвентаря пробы отбирают со всей поверхности в тот момент, когда инвентарь подготовлен к работе непосредственно перед использованием.

Упаковка и упаковочные материалы (пергамент, кашированная фольга, пленка полистироловая, полимерные материалы для упаковки сыра, комбинированные материалы для упаковки молочных продуктов и др. упаковочные материалы).

Для определения чистоты упаковочных материалов разворачивают исследуемый рулон и с внутренней поверхности берут смывы стерильным ватным тампоном со 100 см2. Смывы помещают в пробирки с 5 см3 стерильного раствора хлористого натрия или воды.

Емкостная упаковочная тара (стеклянные, полистирольные банки, стаканчики, коробочки, бутылочки и т.д.).

Для контроля чистоты мойки емкостной упаковочной тары берут 20 см3 стерильного раствора хлористого натрия или стерильной воды. Для анализа отбирают 10 упаковочных единиц (банок и т.д.). В первую банку вливают 20 см3 стерильного раствора хлористого натрия или воды. Банку держат над горелкой под углом 45 °C, чтобы не попадала микрофлора из воздуха. Поворотом банки смачивается раствором вся ее внутренняя поверхность, и смывной раствор сливается в следующую банку. Таким образом, одной порцией стерильного раствора обрабатывают все 10 банок. Из последней банки раствор выливают обратно в колбу, в которой был стерильный раствор хлористого натрия или воды. 1 см3 смывной жидкости засевается в чашку Петри для определения общего количества микроорганизмов, а оставшаяся смывная жидкость засевается в пробирку со средой Кесслер (5 см3).

Деревянная тара (ящики, бочки, кадки и т.д.)

Для проверки качества мойки деревянной тары пробы отбирают в тот момент, когда мойка закончена и тара подготовлена к использованию. Пробу берут ватным или марлевым тампоном с поверхности площадью приблизительно 100 см2 и помещают в 5 см3 среды Кесслер. Анализируют отдельно смывы со стенок тары, дна, углов.

Текстильные изделия (спецодежда, фильтрующие материалы, серпянка, мешки и т.д.)

Контроль санитарной одежды проводят у работников на производственных участках, связанных с сырьем, полуфабрикатами, готовой продукцией на разных этапах выработки молочных продуктов.

Отбор проб проводят методом смыва с площади 100 см2 с передних пол и рукавов халата. Пробы помещают в 5 см3 среды Кесслер. Спецодежду признают удовлетворительного санитарного состояния при отсутствии БГКП.

Смывы также контролируют по наличию или отсутствию условно-патогенных и патогенных микроорганизмов в аккредитованной в установленном порядке лаборатории. Допустимые нормы содержания условно-патогенных и патогенных микроорганизмов и рекомендуемая периодичность контроля приведены в приложении Б.

7.2 Контроль санитарно-гигиенического состояния воздушной среды осуществляется по следующим микробиологическим показателям:

• КМАФАнМ;
• общее количество дрожжей и плесневых грибов.

Проведение анализа

Посев воздуха проводят путем прямого контакта воздушной среды с поверхностью твердой питательной среды, разлитой на чашки Петри, либо микробитестом, смоченным водой и помещенным в чашку Петри. В результате клетки микроорганизмов, находящиеся в воздухе, имеют возможность свободно оседать на поверхность среды.

Для определения КМАФАнМ используется среда КМАФАнМ, приготовленная по 4.6.2.1, для определения дрожжей и плесеней — среда Сабуро (4.6.2.8) или среда для определения дрожжей и плесеней (4.6.2.7), или микробитесты для определения дрожжей и плесеней.

Для проведения посева чашки Петри со средами или микробитестом размещают на стерильной бумаге, расстеленной на горизонтальной поверхности. Верхнюю крышку снимают и располагают рядом с чашкой вверх дном, защищая внутреннюю поверхность крышки от контакта с воздушной средой.

Чашки выдерживают в открытом состоянии в течение 5 мин для осуществления контакта с воздухом, затем закрывают крышками.

Культивирование

Посевы воздуха для определения КМАФАнМ выдерживают при 30 °C в течение 72 ч, для количественного определения дрожжей и плесеней — при 24 °C в течение 5 сут, как в случае использования питательных сред, так и микробитестов.

Обработка результатов

Подсчитывают количество колоний на чашках и проводят сравнение полученных результатов в соответствии с данными таблицы 18.

Таблица 18

Микробиологические показатели при контроле санитарно-гигиенического состояния воздушной среды

Периодичность контроля:

• зависит от назначения контролируемого помещения, его места в технологической цепи, как возможного источника обсеменения продукта и проводится 1 раз в месяц. Особое внимание следует уделять участкам фасовки продукции и камерам созревания сыров;
• усиленный контроль показателей проводят при появлении тех или иных характерных органолептических пороков продуктов (поверхностное плесневение) или при снижении их хранимоспособности;
• при стабильном качестве продукции контроль может проводиться только по показателю содержания дрожжей и плесневых грибов.

В случае если содержание нормируемой микрофлоры превышает допустимые нормы, то воздух помещения подлежит обработке с целью снижения уровня его обсемененности.

7.3 Контроль санитарно-гигиенического состояния питьевой воды

Контроль санитарно-гигиенического состояния питьевой воды проводят в соответствии с СанПиН 2.1.4.1074; ГОСТ Р 51232, ГОСТ 18963; МУК 4.2.1018 по следующим микробиологическим показателям:

• термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ);
• общие колиформные бактерии (ОКБ);
• КМАФАнМ (ОМЧ).

Упрощенная схема контроля качества воды в условиях производственных лабораторий представлена на рисунке 1.

<*> — результаты исследований укладываются в установленные нормы — соответствие требованиям безопасности;

• результаты превышают установленные нормы — несоответствие требованиям безопасности и необходимость усиленной санобработки воды.

Рисунок 1 — Упрощенная схема контроля качества воды в условиях производственных лабораторий по программе производственного контроля

Полная схема контроля качества воды в условиях производственных лабораторий представлена на рисунке 2.

Рисунок 2 — Полная схема контроля качества воды в условиях производственных лабораторий

Примечание 1

Результаты посева фильтров на среде Эндо:

• на фильтрах нет роста колоний или рост пленчатых, губчатых, плесневых колоний — результат «отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 см3 воды». Анализ закончен через 24 ч;
• на фильтрах рост изолированных типичных лактозоположительных колоний — подсчитывают число колоний каждого типа отдельно, подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ (исследуют не менее 3 — 4 колоний каждого типа) по признакам: - оксидазный тест; - принадлежность к Граму; - ферментация лактозы на лактозной среде при (37 +/- 1) °C 48 ч для ОКБ и при (44 +/- 0,5) °C 24 ч для ТКБ.

Примечание 2

Результаты посева воды на среду накопления:

• отсутствие помутнения и образования кислоты и газа в засеянных объемах воды — результат «отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 см3 воды». Анализ закончен через 24 ч;
• из флаконов, где отмечено помутнение и образование кислоты и газа, а также помутнение и кислота при использовании ГПС или помутнение при использовании ЛПС, делают высев на среду Эндо. При отсутствии роста колоний или росте пленчатых, губчатых, плесневых колоний — результат «отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 см3 воды». Анализ закончен через 24 ч. Рост изолированных типичных лактозоположительных колоний — подсчитывают число колоний каждого типа отдельно, подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ по признакам: - оксидазный тест; - принадлежность к Граму; - ферментация лактозы на лактозной среде при (37 +/- 1) °C 48 ч для ОКБ и при (44 +/- 0,5) °C 24 ч для ТКБ.

7.3.1 Отбор проб для контроля воды

Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов.

Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги). Многоразовая посуда, в т.ч. пробки, должна выдерживать стерилизацию сухим жаром или автоклавированием.

При отборе проб в одной и той же точке для различных целей первыми отбирают пробы для микробиологических исследований. Если отбирают воду после обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации остаточного количества дезинфектанта в емкость, предназначенную для отбора проб, вносят до стерилизации натрий серноватисто-кислый в виде кристаллов из расчета 0,01 г на 500 см3 воды.

Пробу отбирают в стерильные емкости. Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду запрещается.

При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана проводят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин при полностью открытом кране. При отборе проб напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. Если через пробоотборный кран происходит постоянный излив воды, отбор проб проводят без предварительного обжига, не изменяя напора воды и существующей конструкции (при наличии силиконовых или резиновых шлангов).

При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании.

После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком.

Отобранную пробу маркируют и сопровождают документом отбора проб воды с указанием места, даты, времени забора, фамилии специалиста, отбирающего пробу, и другой информации.

Пробы воды можно хранить при температуре 4 — 10 °C не более 6 ч. Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2 ч после забора.

7.3.2 Проведение анализов

7.3.2.1 Определение общего числа микроорганизмов (ОМЧ)

Сущность метода

Метод основан на определении общего числа мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре или агаре для определения КМАФАнМ при температуре 37 °C в течение 24 ч, видимых с увеличением в два раза.

Проведение анализа

Пробу воды тщательно перемешивают, вносят в чашки Петри по 1 см3 и проводят посев в соответствии с 5.6.1. При этом из каждой пробы делают посев не менее двух объемов по 1 см3.

Обработка результатов

Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в два раза. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колоний образующих единиц (КОЕ) в 1 см3 исследуемой пробы воды.

Если подсчет отдельных колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают сплошной рост.

Общее число микроорганизмов (ОМЧ) должно составлять не более 50 КОЕ/см3. При получении неудовлетворительных результатов проводится усиленная обработка воды и повторный анализ.

7.3.2.2 Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации (основной метод)

Сущность метода

Метод основан на концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранном фильтре, выращивании их при (37 +/- 1) °C на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Проведение анализа

Подготовка мембранных фильтров

Мембранные фильтры № 2 или № 3, а также планктонные фильтры № 6, проверенные на отсутствие трещин, отверстий и т.п., помещают по одному на поверхность дистиллированной воды, нагретой до 80 °C в стакане (в чашке для выпаривания, эмалированной кастрюле и др.) и медленно доводят до кипения на слабом огне, после чего воду заменяют и кипятят 10 мин. Смену воды и последующее кипячение повторяют 3 — 5 раз до полного удаления остатков растворителей из фильтров, после чего они готовы к работе. Подготовленные фильтры хранят сухими или в широкогорлой банке с дистиллированной водой. Перед употреблением фильтры стерилизуют кипячением в дистиллированной воде.

Фильтрующие мембраны «Владипор» марки МФА-МА NN 5, 6, 7, 8 и 10, визуально проверенные на отсутствие трещин, отверстий, пузырей и т.п., стерилизуют кипячением. При этом во избежание скручивания мембран необходимо соблюдать следующие правила. На дно стакана или другой емкости, в котором проводят кипячение, помещают «сторож для молока» или нержавеющую сетку для ограничения бурного кипения. Дистиллированную воду заливают в стакан или емкость в небольшом объеме, ограничивающем свободное вращение в ней фильтрующих мембран. Однако вода должна покрывать предназначенные для стерилизации фильтрующие мембраны. Дистиллированную воду доводят в сосуде до 80 — 90 °C, после чего, убавив нагрев, на поверхность воды по одной помещают фильтрующие мембраны. Воду с помещенными в нее мембранами медленно доводят до кипения и кипятят на слабом огне в течение 10 — 15 мин. Затем воду сливают и заменяют небольшим количеством (чтобы покрыть фильтрующие мембраны) стерильной дистиллированной воды. После чего фильтрующие мембраны готовы к употреблению. При необходимости проводят повторное кипячение фильтрующих мембран.

Подготовка фильтровального аппарата к анализу

Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

Выполнение анализа

При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 см3.

При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 см3 через один фильтр.

При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличение количества фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 см3 воды).

Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры.

Фильтры помещают на среду Эндо. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

Если на фильтрах нет роста или выросли пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые колонии, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ И ТКБ в 100 см3 исследуемой воды.

Анализ заканчивают через 24 ч.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их возможной принадлежности к ОКБ и ТКБ.

Для подтверждения наличия ОКБ исследуют:

• все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;
• не менее 3 — 4 колоний каждого типа.

Для подтверждения наличия ТКБ исследуют все типичные колонии, но не более 10.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:

• наличие оксидазной активности;
• окраску по Граму по 6.4.1;
• ферментацию лактозы до кислоты и газа.

Постановка оксидазного теста проводится по 6.3.2.

При контроле качества воды оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от бактерий семейства Pseudomonadaceae и других водных сапрофитных бактерий.

При положительном результате колонию из дальнейшего исследования исключают.

Если при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет, получают недостаточно четкий результат, необходимо пересеять культуру со среды Эндо на питательный агар. После инкубации тест повторяют.

Определение ферментации лактозы

Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой (лактозопептонной или полужидкой средой с лактозой) по 4.6.2.4:

• для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 48 ч;
• для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно подогретую до температуры 43 — 44 °C, и инкубируют при температуре (44,0 +/- 0,5) °C в течение 24 ч.

Первичный учет образования кислоты и газа на подтверждающих полужидких средах возможен через 4 — 6 ч.

При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с посевами для окончательного учета ТКБ продолжают инкубировать до 24 ч.

Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного результата продолжают инкубировать до 48 ч для окончательного учета.

Если колония, подлежащая исследованию, незначительных размеров, ее пересевают на скошенный питательный агар и после инкубации в течение 18 — 24 ч выполняют все необходимые подтверждающие тесты.

Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37 °C с образованием кислоты и газа.

Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °C с образованием кислоты и газа.

Если проведенные тесты дают положительный результат о принадлежности исследованных колоний к ОКБ (оксидазоотрицательные, грамотрицательные, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и газа), то мы говорим о присутствии ОКБ в исследованном объеме.

Обработка результатов

При отсутствии общих и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 см3» и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 см3».

После идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают числом КОЕ в 100 см3 воды.

7.3.2.3 Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

Титрационный метод может быть использован:

• при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;
• при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;
• в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Сущность метода

Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

Проведение анализа

При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпидемнадзор, производственный контроль) засевают 3 объема по 100 см3 исследуемой воды.

При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе проводят посев: 3 объемов по 100 см3, 3 объемов по 10 см3 и 3 объемов по 1 см3.

Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо-пептонную или глюкозо-пептонную среду, приготовленные по 4.6.2.4. Посев 100 см3 и 10 см3 воды проводят в 10 см3 и 1 см3 концентрированной среды, посев 1 см3 пробы проводят в 10 см3 среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 24 ч при проведении анализа на среде ГПС и 48 ч при проведении анализа на среде ЛПС. Не ранее 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посева. Из емкостей, где отмечено помутнение, изменение окраски (кислотообразование) и образование газа, а также помутнение и кислотообразование при использовании ГПС или помутнение при использовании ЛПС, проводят посев бактериологической петлей на сектора среды Эндо (4.6.2.6), разделенной на 3 — 4 сектора (5.6.2.2), для получения изолированных колоний. При получении сплошного роста необходимо рассеивать посевной материал на чашку со средой Эндо для выделения изолированных колоний.

Емкости без признаков роста на среде ЛПС оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшие исследования с ними не проводят. Из посевов, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.

Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 — 20 ч.

При отсутствии роста колоний на секторах среды Эндо, а также при наличии пленчатых, губчатых, с неровными краями и поверхностью, плесневых и других не характерных для кишечных палочек колоний получают отрицательный результат.

При образовании помутнения, газа и изменения цвета в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде (изменение цвета среды под колонией), дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.

Наличие ОКБ требуется подтвердить:

• если в среде накопления отмечено только помутнение;
• если принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнение у исследователя.

В этих случаях:

• проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии;
• выполняют оксидазный тест;
• подтверждают принадлежность к Граму по 6.4.1;
• подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1 — 2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой по 4.6.2.4 с последующей инкубацией посевов при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 — 48 ч.

При отсутствии изолированных колоний проводят рассев на среду Эндо общепринятыми методами.

Отрицательный ответ дают, если:

• в среде накопления нет признаков роста;
• на секторах среды Эндо нет роста;
• на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные с неровными краями, расплывчатые и т.п.);
• все колонии оказались оксидазоположительными;
• все колонии оказались грамположительными;
• если в подтверждающем тесте на среде с углеводом не отмечено газообразования.

Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев 2 — 3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред.

Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °C. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре (44 +/- 1) °C в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через 4 — 6 ч.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °C дают положительный результат на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.

Допускается для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ проводить посев 1 см3 из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование в пробирки с лактозо-пептонной средой с поплавком по 4.6.2.4 и предварительно прогретые до температуры 44 °C. Посевы выдерживают в термостате при температуре (44 +/- 1) °C в течение 24 ч. При обнаружении изменения окраски индикатора и образования газа дают положительный ответ.

Обработка результатов

При исследовании 3 объемов по 100 см3 результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов, делается запись в журнале: «обнаружены в 100 см3».

При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по таблице 19.

Таблица 19

Расчет наиболее вероятного числа бактерий в 100 см3 питьевой воды

Результат представляют без доверительного интервала.

При отрицательном результате на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе «не обнаружены в 100 см3».

Микробиологические показатели безопасности питьевой воды при контроле в условиях производственной лаборатории представлены в таблице 20.

Таблица 20

Микробиологические показатели безопасности питьевой воды

Периодичность контроля:

• зависит от вида водоснабжения (централизованное или собственное) и вида выпускаемой продукции (непосредственное использование воды в ходе технологического процесса или для технических целей) и проводится 4 — 12 раз в год,
• усиленный контроль показателей проводят при появлении тех или иных характерных органолептических пороков продуктов или при снижении их хранимоспособности.

Картина роста БГКП на средах ГПС и ЛПС приведена в приложении Г.

7.4 Контроль соблюдения гигиены работниками предприятия

7.4.1 Контроль соблюдения гигиены работниками предприятия проводят путем взятия смывов с поверхности рук.

Анализ чистоты рук проводится микробиологом предприятия без предварительного предупреждения не реже 1 раза в декаду у работников, непосредственно соприкасающихся с чистым оборудованием или продукцией.

Для взятия смыва с рук рабочих пользуются ватными тампонами. Перед анализом тампон смачивают стерильным раствором хлористого натрия или воды и обтирают смоченным тампоном обе руки и пальцы.

7.4.2 Контроль за хлорированием рук проводят путем проведения йод-крахмальной пробы.

Отдельные участки рук протирают ватным тампоном, смоченным йод-крахмальным раствором (смесь 1:1 6% раствора йодистого калия и 4% раствора растворимого крахмала).

Признаком того, что руки были обработаны дезинфицирующим раствором, содержащим ионы хлора, является появление сине-бурого окрашивания.

Рекомендуемая периодичность — 1 раз в неделю.

8 Проведение контроля загрязненности производства ферментированных молочных продуктов бактериофагами

При производстве ферментированных молочных продуктов необходимо проводить контроль загрязненности бактериофагами.

Показателем благополучия исследуемого объекта служит отсутствие в отобранных пробах бактериофагов, способных лизировать тест-культуры.

Обнаружение бактериофагов расценивают как показатель фагового неблагополучия объекта, что требует перевода этого объекта на усиленный контроль и проведение усиленной санитарной обработки. Для оценки реальной опасности объекта как источника загрязнения проводят количественное определение бактериофагов.

По периодичности и объему испытаний выделяют три категории фагового контроля.

Нормальный контроль осуществляют при отсутствии случаев нарушения молочнокислого процесса. При этом основными критическими контрольными точками являются: молоко после пастеризации, смесь для выработки сыра, закваска, воздух заквасочного помещения, смывы с оборудования, инвентаря и т.д.

Усиленный контроль осуществляют при возникновении нарушений в процессе приготовления производственной закваски, нарушения кислотообразования во время выработки сырной массы и высокого уровня pH в сырной массе, снижения качества готового продукта и т.д.

Усиленный контроль предполагает:

• увеличение числа контролируемых объектов;
• увеличение периодичности контроля, вплоть до ежедневного.

Контроль по упрощенной схеме осуществляется при стабильно высоком качестве готового продукта. При этом сокращается число контролируемых объектов и периодичность исследований.

Схемы основных методов фагового контроля и оценка степени фагового загрязнения по уровню фаголизиса представлены в приложении Е.

8.1 Подготовка к проведению анализа

8.1.1 Общие требования

Исследования, связанные с определением бактериофагов, проводят в условиях, исключающих возможность загрязнения окружающей среды.

Анализы проводят в боксе, в котором не ведут работы с бактериальными заквасками и препаратами.

При отсутствии бокса работы можно проводить в лабораторном помещении, соблюдая особую осторожность:

• посуду с питательными средами, посевами, растворами с разведениями, использованные пипетки перед мойкой необходимо стерилизовать в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение (25 +/- 5) мин или кипятить (1,2 +/- 0,2) ч.
• по окончании работ рабочее место тщательно дезинфицируют спиртом или другим дезинфицирующим средством и подвергают помещение УФ-обработке течение (45 +/- 5) мин.

8.1.2 Тест-культура для определения бактериофага

Тест-культура — штаммы молочнокислых бактерий, чувствительные к широкому спектру фагов. Они выпускаются специализированными предприятиями в виде моновидовых и одноштаммовых жидких или сухих заквасок или бактериальных концентратов.

Для этих целей используется специальный диагностический набор «Фаготест-ЛК». В набор входят три тест-культуры, чувствительные к различным фагам, что дает возможность выявления их максимального спектра, и сухая питательная среда для их роста.

Подготовка рабочей тест-культуры для определения бактериофага

Рабочую тест-культуру готовят из сухой тест-культуры путем внесения в нее (9,5 +/- 0,5) см3 стерильной воды или физраствора с соблюдением правил асептики. Пробу тщательно перемешивают и используют в течение 2 ч.

8.1.3 Подготовка проб для определения наличия в них бактериофага

Подготовка проб включает освобождение пробы от нерастворимых соединений (белок, жир) и освобождение пробы от микроорганизмов.

Освобождение пробы от нерастворимых соединений

При исследовании молока, закваски или иного продукта пробу предварительно освобождают от белка.

Для этого пробу молока подкисляют 10% молочной кислотой до появления хлопьев, подогревают до температуры (42 +/- 2) °C и выдерживают при комнатной температуре 10 — 15 мин для осаждения белка.

Пробу сыра (1,0 +/- 0,1) г предварительно растирают в ступке с (9,9 +/- 0,1) см3 стерильной воды или физраствора, подогретых до (45 +/- 1) °C.

Пробы фильтруют через стерильный бумажный фильтр в стерильную колбу для отделения белка или центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 — 15 мин. При этом центрифужные стаканы и центрифуга должны быть обработаны спиртом. Стаканы можно обрабатывать стерилизацией в автоклаве, завернутыми в плотную бумагу.

При исследовании закваски, сыворотки, рассола или иного аналогичного объекта проводят перемешивание продукта, затем фильтрование через стерильные ватно-марлевые или ватные фильтры.

Для анализа используют надосадочную жидкость или фильтрат.

Освобождение пробы от микроорганизмов

Выделение бактериофага фильтрованием

Надосадочную жидкость пропускают через стерильные бактериальные фильтры (фильтр Зейтца или другие мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,2 мкм). Можно использовать фильтры, применяемые для анализа воды.

Допускается выделение фага из молока непосредственно фильтрованием через стерильные бактериальные фильтры.

Воду фильтруют непосредственно через стерильные бактериальные фильтры.

Выделение бактериофага с использованием хлороформа

10 см3 исследуемого образца, предварительно освобожденного от белка, помещают в стерильную пробирку, добавляют (1,2 +/- 0,2)% хлороформа с помощью пипетки с резиновой грушей или шприца или другого приспособления, предотвращающего непосредственный контакт работающего с хлороформом. Пробирку закрывают ватной пробкой, смесь тщательно перемешивают и выдерживают в течение (12 + 2) мин. Работы с хлороформом необходимо проводить в вытяжном шкафу.

Стерильной пипеткой с грушей или шприцем, не захватывая нижний слой с хлороформом, отбирают верхнюю часть смеси и переносят в стерильную пробирку.

Выделение бактериофага путем температурного воздействия

Пробу прогревают в водяной бане при температуре (65 +/- 1) °C в течение (25 +/- 5) мин и далее фильтруют через стерильный бумажный или ватно-марлевый фильтр или центрифугируют для удаления белкового осадка.

Выделение бактериофага из производственной атмосферы

Выделение проводят путем прямого осаждения фаговых частиц на чашки Петри с питательной средой и тест-культурами или с помощью аппарата Кротова (или его аналогов).

8.1.4 Подготовка чашек Петри с газонами из тест-культур

В стерильную чашку Петри вносят (20 +/- 5) см3 предварительно расплавленной и охлажденной до (46 +/- 1) °C питательной среды КМАФАнМ по 4.6.2.1.

После застывания питательной среды ее поверхность подсушивают в течение (12 +/- 2) мин в термостате при (37 +/- 2) °C и создают газон из тест-культуры, т.е. на поверхность среды наносят стерильной пипеткой 1 — 2 капли рабочей тест-культуры, приготовленной по 8.1.2, которую распределяют с помощью шпателя Дригальского или изогнутой стеклянной палочки равномерно по всей поверхности.

Допускается наносить тест-культуру на поверхность среды с помощью ватно-марлевого или марлевого тампона. Для этого стерильный тампон смачивают рабочей тест-культурой и протирают им поверхность подсушенной среды.

Подготовленные чашки Петри с тест-культурами должны быть использованы для проведения испытаний в течение 1 ч.

При необходимости более длительного хранения индикаторных чашек Петри их следует поместить в холодильник, но не более чем на 2 ч.

8.1.5 Подготовка индикаторных пробирок для обнаружения бактериофагов

Индикаторные пробирки представляют собой пробирки с жидкой питательной средой и внесенной тест-культурой. Поэтому индикаторные пробирки готовят непосредственно перед проведением исследований.

В случае необходимости допускается хранение подготовленных индикаторных пробирок (с внесенными тест-культурами) в холодильнике при температуре от 4 °C до 6 °C не более 1 ч.

Индикаторные пробирки готовят следующим образом. В пробирки с (10,0 +/- 0,1) см3 гидролизованного молока вносят по (0,10 +/- 0,01) см3 рабочих тест-культур по 8.1.2.

8.2 Методы индикации бактериофагов

8.2.1 Метод индикации бактериофагов с использованием индикаторных чашек Петри

Сущность метода

Метод основан на посеве исследуемой пробы на плотную питательную среду с индикаторными культурами, культивировании посевов при оптимальной для размножения тест-культур температуре и учете негативных колоний (участков отсутствия видимого роста тест-культур на сплошном бактериальном газоне).

А Метод «стекающей капли»

При проведении испытаний указанным методом на поверхность подготовленных по 8.1.4 индикаторных чашек Петри с помощью пипетки наносят каплю исходной пробы, подготовленной по 8.1.3, наклоняют чашку так, чтобы капля стекла к противоположному краю.

Чашку Петри помещают в термостат и выдерживают при режимах, приведенных в таблице 21.

Таблица 21

Режимы культивирования посевов при индикации бактериофагов

При наличии в пробе бактериофагов, способных лизировать тест-культуры, на месте стекания капли формируются, в зависимости от количества фаговых частиц в пробе, либо сплошная зона лизиса тест-культуры, либо отдельные негативные колонии (точечный лизис).

При использовании данного метода может быть проведено ориентировочное определение количества фаговых частиц в пробе.

Для ориентировочной оценки вероятного количества фагов в исследуемой пробе оценивают характер лизиса тест-культуры в «стекающей капле»:

• не обнаружено видимого лизиса и негативных колоний — бактериофаг, способный лизировать тест-культуру, либо отсутствует в исследуемой пробе, либо его количество менее 1 фаговой частицы в 1 см3 пробы;
• в «стекающей капле» пробы содержится до 10 негативных колоний — титр бактериофагов в пробе составляет 103 — 104;
• в «стекающей капле» формируется зона сплошного лизиса — вероятный титр бактериофагов в пробе 106 и более.

Б Метод «капли»

Дно каждой из подготовленных чашек Петри по 8.1.4 с тест-культурами, с наружной стороны, делят на сектора или квадраты. В каждый сектор (квадрат) на поверхность газона тест-культуры с помощью пастеровской пипетки с оттянутым концом или бактериологической петли диаметром 2,0 — 2,5 мм (или стеклянной палочки с оттянутым концом или репликатором) наносят каплю исследуемой пробы.

При этом петлю (или стеклянные палочки) после каждого нанесения исследуемого материала прожигают, а пипетки меняют на новые.

Посевы выдерживают в термостате при оптимальных режимах (таблица 21) и отмечают те пробы, на месте нанесения которых образовалась негативная колония, свидетельствующая о наличии в пробе фага, лизирующего тест-культуру.

8.2.2 Методы индикации бактериофагов с использованием индикаторных пробирок

Сущность метода

Метод основан на посеве исследуемой пробы в жидкую питательную среду с индикаторными культурами, культивировании посевов при оптимальной для размножения тест-культуры температуре и выявлении задержки или отсутствия роста тест-культуры по отсутствию признаков роста (помутнение среды, образование сгустка, изменение кислотности и т.д.).

А Обнаружение бактериофагов с использованием в качестве питательной среды бульона из гидролизованного молока

При проведении исследований в пробирки с (10,0 +/- 1,0) см3 гидролизованного молока вносят бактериологической петлей (диаметром 2 мм) рабочие или активизированные тест-культуры, или суспензию тест-культур.

В пробирки вносят по 1 — 2 капли подготовленной пробы по 8.1.3.

В контрольные пробирки с разными тест-культурами (которые служат для контроля за ростом тест-культур) вносят по 1 — 2 капли стерильной воды или физиологического раствора.

Пробирки термостатируют при оптимальной для роста тест-культур температуре (таблица 21), наблюдая за ростом культуры (помутнением среды) через 4, 6, 10 и 24 ч.

Учет результатов проводят только при наличии роста тест-культур в контрольных пробирках (помутнение среды).

Отсутствие или задержка роста тест-культур по сравнению с контролем свидетельствует о наличии в испытуемой пробе бактериофага, способного лизировать ту или иную тест-культуру.

Примечания

1 Воздействие бактериофага на тест-культуру в гидролизованном молоке может проявляться в первоначальном нормальном развитии тест-культуры в опытной пробирке (помутнение питательной среды в первые 3 — 5 ч) с последующим просветлением культуральной среды.

2 Контроль за развитием тест-культур может быть осуществлен как визуально, так и по оптической плотности, определяемой с помощью ФЭК или другой спектрофотометрической аппаратуры.

3 Для подтверждения присутствия бактериофага в исследуемой пробе из опытной пробирки делают высев и испытания на плотных питательных средах по одному из методов 8.2.1.

Б Обнаружение бактериофагов с использованием в качестве питательной среды стерильного молока

В колбы с (95,0 +/- 5,0) см3 стерильного молока вносят по 0,1 — 0,2 см3 тест-культур и тщательно перемешивают круговыми движениями. В колбы, шифрованные как опытные, добавляют по (10,0 +/- 1,0) см3 пробы, подготовленной по 8.1.3. В колбы, шифрованные как контрольные, вносят по (10,0 +/- 1,0) см3 стерильной воды.

Контрольные и опытные колбы помещают в термостат и выдерживают при оптимальной для жизнедеятельности тест-культур температуре (таблица 21), определяя титруемую кислотность молока через 0 (исходная), (6,0 +/- 0,5) ч, (12,0 +/- 1,0) ч и (22,0 +/- 2,0) ч, рассчитывая прирост титруемой кислотности (\Delta T) за указанные выше промежутки времени (т.е. за 6 ч — \Delta T_{6} ; за 12 ч — \Delta T_{12} ; и за 22 ч — \Delta T_{22} по формуле

\Delta T_{i} = T_{i} - T_{o} , (7)

где \Delta T_{i} — прирост титруемой кислотности за определенный промежуток времени (i), °T;

To — исходная титруемая кислотность, °T;

Ti — титруемая кислотность через i ч, °T.

Достоверное торможение кислотообразования тест-культур в опытных колбах (или в одной из опытных колб) по сравнению с соответствующими контрольными свидетельствует о наличии в исследуемой пробе бактериофага к тест-культуре.

Торможение считается достоверным, если различия в приросте титруемой кислотности в контрольной и опытной колбах составляют через (6,0 +/- 0,5) ч — не менее 3 °T, через (12,0 +/- 1,0) ч — не менее 5 °T, через (22,0 +/- 2,0) ч — не менее 8 °T

Предварительно учет результатов проводят через (6,0 +/- 0,5) ч. При получении недостаточно четких результатов (близких к критическим) опытные и контрольные колбы выдерживают еще 6 ч, а при необходимости — до 24 ч.

Для подтверждения наличия бактериофага в опытных колбах проводят исследования одним из методов по 8.2.1 с использованием индикаторных чашек с теми же тест-культурами.

9 Организация контроля основного сырья на молокоперерабатывающих предприятиях

9.1 Контроль молока-сырья

Общие требования к молоку-сырью для молочных продуктов изложены в ГОСТ Р 52054.

Общие и специфические требования к молоку-сырью для сыроделия, включая не только коровье, но козье и овечье молоко, регламентированы ТУ 9811-153-04610209.

В таблице 22 представлены общие микробиологические показатели безопасности и качества молока-сырья, подлежащие контролю.

Таблица 22

Общие микробиологические показатели безопасности и качества молока-сырья и порядок их контроля

Схема усиленного контроля общей бактериальной обсемененности молока-сырья представлена в таблице 23.

Таблица 23

Порядок усиленного контроля общей бактериальной обсемененности молока-сырья

В молоке-сырье, используемом для производства сыра, необходимо контролировать специфические критерии его сыропригодности.

Таблица 24

Специфические критерии сыропригодности молока-сырья

Результаты контроля записываются в журнал.

9.2 Контроль обезжиренного молока-сырья

Обезжиренное молоко-сырье по микробиологическим показателям безопасности и качества должно соответствовать общим требованиям, предъявляемым к молоку-сырью.

Контроль обезжиренного молока-сырья проводят аналогично контролю общих показателей безопасности и качества по 9.1, таблица 22.

Результаты контроля записываются в журнал.

9.3 Контроль сливок-сырья

Общие требования к сливкам-сырью для производства молочных продуктов регламентированы ТУ 9811-152-04610209.

В таблице 25 представлены общие микробиологические критерии безопасности и качества сливок-сырья, подлежащие контролю в условиях производственной лаборатории.

Таблица 25

Общие микробиологические показатели безопасности и качества сливок-сырья

Результаты контроля записываются в журнал.

9.4 Контроль пахты-сырья

Общие требования к пахте-сырью для получения жидких, сгущенных и сухих продуктов на основе пахты заложены в ОСТ 10-287.

Таблица 26

Общие микробиологические критерии безопасности и качества пахты-сырья

Результаты контроля записываются в журнал.

9.5 Контроль сыворотки-сырья

Для обеспечения безопасности готовой продукции, изготовляемой из молочной сыворотки, сыворотку-сырье рекомендуется контролировать по следующим показателям.

Таблица 27

Общие микробиологические критерии безопасности и качества сыворотки-сырья

Результаты контроля записываются в журнал.

10 Микробиологический контроль вспомогательного сырья и компонентов

При производстве молочных и молокосодержащих продуктов используются функционально необходимые ингредиенты (ферментные препараты, БК, соли-плавители, структурообразователи, соль, сахар и т.д.); пищевые добавки (загустители, стабилизаторы, консерванты и т.д.) и разнообразные немолочные компоненты (немолочные жиры, немолочные белки, мясные продукты, фрукты, овощи, специи, зелень, орехи и др.).

Все виды и группы вспомогательного сырья и используемых компонентов должны соответствовать требованиям нормативных и/или технических документов на данные продукты, и/или спецификациям, являющимся необходимой частью договора-поставки.

Данное соответствие должно быть подтверждено документами, подтверждающими качество и безопасность продукции и применяемыми в законодательно установленном порядке.

Входной контроль вспомогательного сырья и компонентов, доза внесения которых в продукт незначительна (до (1,5 +/- 0,5)%) или их бактериальная обсемененность не может оказать существенного влияния на безопасность и качество готового продукта (соль, сахар, немолочные жиры и т.д.), можно проводить по документам, подтверждающим их соответствие нормам безопасности.

Входной контроль вспомогательного сырья и компонентов, доза внесения которых в продукт значительна (более 2,0%) или их бактериальная обсемененность может оказать существенное влияние на безопасность и качество готового продукта (мясные продукты, фрукты, овощи и т.д.), рекомендуется проводить путем контроля основных показателей безопасности и качества.

Вышеуказанный порядок входного контроля вспомогательного сырья носит рекомендательный характер. Контроль вспомогательного сырья зависит от различных факторов, в частности, стабильности качества сырья, получаемого от постоянных поставщиков; появления ряда специфических пороков вкуса, консистенции или внешнего вида продукта, которые могут быть связаны с микробиологическими показателями вспомогательного сырья и т.д.

При возникновении подозрений в несоответствии качества и безопасности используемых сырья и компонентов или при нарушении режимов их хранения, проводят обязательный контроль показателей, заложенных в нормативные и технические документы, используя стандартные методы.

Результаты контроля записываются в журнал.

При несоответствии контролируемых показателей нормам, установленным в нормативных и технических документах, сырье и используемые компоненты подлежат возврату.

11 Контроль эффективности пастеризации

Проверку соблюдения параметров пастеризации молочного сырья (молока, сливок, пахты и сыворотки) проводят ежедневно по анализу термограмм каждого пастеризационного аппарата. При выявлении отклонения от заданного режима пастеризации выявляют его причины и сообщают об этом техническому руководству предприятия для принятия мер по ликвидации технических неполадок.

Параллельно проводят контроль эффективности пастеризации одним из предлагаемых методов по 6.7.1.

Если в результате анализа установлено, что эффективность пастеризации недостаточна, то пастеризационная установка должна быть остановлена до установления и устранения причин снижения эффективности пастеризации (наиболее опасной точкой является возвратный клапан и микротрещины).

После устранения причин недопастеризации и запуска пастеризационной установки эффективность пастеризации проверяют не менее трех раз до получения устойчивых положительных результатов.

Плановый контроль эффективности пастеризации проводится не реже одного раза в 10 дней, независимо от качества готового продукта.

При снижении качества готового продукта или при выявлении превышения допустимых норм его бактериальной обсемененности проводят внеплановый контроль эффективности пастеризации.

Результаты контроля записываются в журнал.

Пастеризаторы являются реальным источником термофильных стрептококков в пастеризованном молоке и причиной обсеменения ими всего производства и готового продукта.

12 Контроль качества закваски

Внесение в молоко после пастеризации заквасочных микроорганизмов является обязательным этапом производства всех без исключения кисломолочных (ферментированных) молочных продуктов.

Заквасочные микроорганизмы поступают на предприятие в виде БЗ или БК, отличающихся между собой уровнем содержания жизнеспособных клеток в единице активности (БЗ — не менее 109 КОЕ/ЕА, БК — не менее 1010 КОЕ/ЕА).

Видовой состав и количество жизнеспособных клеток в БЗ и БК регламентируются соответствующими техническими документами и гарантируются предприятием-изготовителем БЗ и БК.

При необходимости можно проводить идентификацию заквасочной микрофлоры по первичным признакам в соответствии с ГОСТ 10444.11.

Работы с заквасочными микроорганизмами проводят в специализированном заквасочном помещении.

В производстве используют следующие способы применения БЗ:

• предварительная активизация для последующего использования при приготовлении производственной закваски;
• приготовление производственной закваски.

В производстве используют следующие способы применения БК:

• прямая инокуляция БК в молоко или смесь для выработки продукта;
• предварительная активизация БК для последующего внесения в молоко или смесь для выработки продукта;
• предварительная активизация для последующего использования при приготовлении производственной закваски;
• приготовление производственной закваски.

Безопасность и качество активизированного препарата и производственной закваски контролируют ежедневно из каждой партии (емкости).

12.1 Контроль активизированного БК

Контроль активизированного БК осуществляют по следующим показателям:

• прирост титруемой кислотности за время активизации (2 — 3 ч) — в соответствии с технической документацией на используемый концентрат;
• микроскопический препарат — клетки бактерий в препарате должны располагаться равномерно, не содержать посторонней микрофлоры, в том числе дрожжей и плесневых грибов, и соответствовать виду закваски.

Результаты контроля записывают в журнал.

12.2 Контроль производственной закваски

Контроль производственной закваски, приготовленной на молоке или специальной питательной среде из БК беспересадочным способом, осуществляют по показателям, представленным в таблице 29.

Таблица 29

Показатели производственной закваски

Конкретные значения контролируемых показателей должны соответствовать требованиям технических документов на используемый БК и питательную среду.

При возникновении необходимости количественной оценки содержания ароматообразующих микроорганизмов в закваске проводят анализ методом посева по 6.6.1.4.

Результаты контроля записываются в журнал.

Приложение А (обязательное)

СХЕМЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОДУКТОВ ПЕРЕРАБОТКИ МОЛОКА

Критические контрольные точки устанавливают для каждого вида выпускаемой на предприятии продукции, конкретные параметры производства наносят на технологическую схему и указывают в карте метрологического обеспечения технологической инструкции.

Технологические схемы с основными критическими контрольными точками отражают в программе производственного контроля.

Критические контрольные точки, в которых проводится микробиологическое тестирование, также отражают на схеме с указанием критериев оценки.

Микробиологический контроль производства продуктов переработки молока включает:

• контроль санитарно-гигиенического состояния производства;
• контроль сырья;
• контроль производственного процесса;
• контроль готового продукта.

Контроль санитарно-гигиенического состояния производства проводят в соответствии с разделом 7.

Контроль критериев безопасности и качества основного и вспомогательного сырья проводят в соответствии с разделами 9 и 10.

Контроль эффективности пастеризации проводится в соответствии с разделом 11.

Контроль критериев безопасности и качества закваски проводится в соответствии с разделом 12.

Предлагаемый порядок контроля соответствует нормальному (стандартному) контролю.

При наличии на предприятии-изготовителе эффективно функционирующей системы менеджмента качества и обеспечении выпуска продукции стабильно высокого качества с отсутствием превышения нормативных показателей безопасности и качества в течение длительного времени (не менее 3 лет), допускается проводить контроль продукции по упрощенной схеме.

Упрощенная схема распространяется только на производство продуктов переработки молока в закрытых системах.

При контроле по упрощенной схеме, при неизменном количестве показателей в сравнении с нормальным (стандартным) контролем, может быть снижено количество точек, подлежащих контролю и/или периодичность их контроля в 2 раза.

Схемы микробиологического контроля производственных процессов и готовых продуктов

А.1 Жидкие пастеризованные продукты из молока, сливок, пахты и сыворотки

Схема основных критических контрольных точек при производстве жидких пастеризованных продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки:

сырье пастеризация охлаждение фасование готовый продукт хранение

Пастеризация. При производстве жидких пастеризованных продуктов из молока, сливок, пахты применяют высокотемпературную пастеризацию, конкретные параметры которой регламентированы действующими технологическими инструкциями на соответствующие продукты.

При производстве продуктов из сыворотки применяют пастеризацию при температуре (65 +/- 2) °C с выдержкой 30 мин или (72 +/- 2) °C с выдержкой 20 с.

Охлаждение. После пастеризации продукт необходимо максимально быстро охладить до температуры 4 — 6 °C для ограничения развития остаточной микрофлоры.

Фасование. Источником вторичного обсеменения продукта во время фасования является оборудование, воздух и упаковочные материалы.

Готовый продукт. Микробиологические показатели, допустимые нормы и рекомендуемая периодичность контроля жидких пастеризованных продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки представлены в таблице А.1.

Таблица А.1

Микробиологические показатели жидких пастеризованных продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки, подлежащие контролю в готовом продукте в условиях производственной лаборатории

Хранение. Жидкие пастеризованные продукты из молока, сливок, пахты и сыворотки должны храниться при температуре (4 +/- 2) °C.

А.2 Жидкие ферментированные (кисломолочные и сквашенные) продукты из молока, сливок, пахты и сыворотки

Схема основных критических контрольных точек при производстве жидких ферментированных (кисломолочных и сквашенных) продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки:

сырье пастеризация закваска сквашивание термизация (для сквашенных продуктов) фасование готовый продукт хранение

При производстве жидких ферментированных (кисломолочных и сквашенных) продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки усиленной критической контрольной точкой, в сравнении с производством жидких пастеризованных продуктов, является процесс сквашивания.

Внесение в молоко после пастеризации заквасочных микроорганизмов является обязательным этапом производства всех без исключения ферментированных (кисломолочных и сквашенных) молочных продуктов.

Состав заквасочной микрофлоры, дозы и способы внесения, а также режимы культивирования определяются соответствующими техническими документами на конкретный вид продукта.

Таблица А.2

Минимально необходимое содержание жизнеспособных клеток заквасочных микроорганизмов на разных этапах технологического процесса производства ферментированных молочных продуктов

Для нормального протекания микробиологических и биохимических процессов при выработке большинства ферментированных молочных продуктов количество жизнеспособных клеток заквасочных микроорганизмов в исходной смеси должно быть не менее 106 КОЕ/см3.

Количество жизнеспособных клеток заквасочных микроорганизмов в готовом продукте должно превышать их количество, нормируемое на конец срока годности, так как в процессе хранения продукта происходит снижение жизнеспособных клеток за счет их вымирания. Скорость вымирания зависит от вида заквасочной микрофлоры, температуры хранения продукта, значений pH и сроков годности. Особенно интенсивно снижается количество бифидобактерий в пробиотических продуктах.

Термизация сквашенных продуктов проводится при (64 +/- 4) °C с выдержкой до 30 сек с целью пролонгации сроков годности продуктов. В результате процесса термизации снижается уровень вегетативных микроорганизмов, в том числе заквасочных. Конечное количество заквасочной микрофлоры в термизированных молочных продуктах не нормируется.

Готовый продукт. Микробиологические показатели, допустимые нормы и рекомендуемая периодичность контроля жидких ферментированных (кисломолочных и сквашенных) продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки представлены в таблице А.3.

Таблица А.3

Микробиологические показатели жидких ферментированных (кисломолочных и сквашенных) продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки, подлежащие контролю в готовом продукте в условиях производственной лаборатории

Хранение. Жидкие ферментированные (кисломолочные и сквашенные) продукты из молока, сливок, пахты и сыворотки должны храниться при температуре (4 +/- 2) °C.

А.3 Сгущенные продукты из молока, сливок, пахты и сыворотки

Схема основных критических контрольных точек при производстве сгущенных продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки:

сырье пастеризация сгущение фасование готовый продукт хранение

При производстве сгущенных продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки усиленной критической контрольной точкой, в сравнении с производством жидких пастеризованных продуктов является, процесс сгущения.

Процесс сгущения проводят при режимах, обеспечивающих минимальную продолжительность операции сгущения. При увеличении длительности сгущения и ведении процесса на нижних температурных пределах возможно развитие термофильных микроорганизмов.

Готовый продукт. В условиях производственной лаборатории контролю подлежит каждая партия готового продукта. Микробиологические показатели, допустимые нормы и рекомендуемая периодичность контроля сгущенных продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки представлены в таблице А.4.

Таблица А.4

Микробиологические показатели сгущенных продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки, подлежащие контролю в готовом продукте в условиях производственной лаборатории

Хранение. Сгущенные продукты должны храниться при температурном диапазоне от 0 до 10 °C и относительной влажности воздуха не более 85%.

Допускается изменение условий хранения сгущенных продуктов при совершенствовании технологического процесса.

А.4 Сухие продукты из молока, сливок, пахты и сыворотки

Схема основных критических контрольных точек при производстве сухих продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки:

сырье пастеризация сгущение сушка фасование готовый продукт хранение

При производстве сухих продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки усиленной критической контрольной точкой, в сравнении с производством сгущенных продуктов, является процесс сушки.

В процессе сушки происходит уменьшение количества вегетативных форм и увеличение доли споровых аэробных и анаэробных микроорганизмов. При последующих операциях может происходить вторичное обсеменение продукта с оборудования.

Готовый продукт. В условиях производственной лаборатории контролю подлежит каждая партия готового продукта. Микробиологические показатели, допустимые нормы и рекомендуемая периодичность контроля сухих продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки представлены в таблицах А.5 и А.6.

Таблица А.5

Микробиологические показатели сухих продуктов из молока, сливок, пахты и сыворотки, подлежащие контролю в готовом продукте в условиях производственной лаборатории