ГОСТ 31502-2012. Межгосударственный стандарт. Молоко и молочные продукты. Микробиологические методы определения наличия антибиотиков
(введен в действие Приказом Росстандарта от 13.11.2012 № 730-ст)
(ред. от 23.10.2014)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ включен в пункты 375 и 478 Перечня стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 № 80). Изменение № 1 введено в действие с 01.07.2015 Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст.
ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ
flowchart LR n0["ГОСТ Р 51600-2000"]:::rst click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-51600-2000-gosstandart-rossii" "ГОСТ Р 51600-2000. Государственный стандарт Российской Федерации. Молоко. Методы определения наличия антибиотиков (принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от " n1["ГОСТ Р 51600-2010"]:::rst click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-r-51600-2010" "ГОСТ Р 51600-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Молоко и молочные продукты. Микробиологические методы определения наличия антибиотиков (утв. и введен в действие Прик" n2["ГОСТ 31502-2012"]:::doc click n2 "https://bukva.ai/docs/gost-31502-2012" "ГОСТ 31502-2012. Межгосударственный стандарт. Молоко и молочные продукты. Микробиологические методы определения наличия антибиотиков (введен в действие Приказом Росстандарта от 13." n1 --> n2 n0 --> n1 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 ноября 2012 г. № 730-ст
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ АНТИБИОТИКОВ
Milk and milk products. Microbiological methods of the determination of antibiotics
Дата введения 1 июля 2013 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».
Сведения о стандарте
1. Подготовлен Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии) и Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии).
2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии.
3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол от 24 мая 2012 г. № 41).
4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 ноября 2012 г. № 730-ст межгосударственный стандарт введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.
5. Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 51600-2010.
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты».
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты».
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Настоящий стандарт распространяется на сырое, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое коровье молоко (далее — молоко) и устанавливает качественные микробиологические методы определения наличия антибиотиков:
- чашечный метод с Bacillus stearothermophilus;
- метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур;
- метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный.
2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия
ГОСТ ISO 707-2013 <*>. Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб
(ссылка введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
<*> Не действует на территории Российской Федерации.
(сноска введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
ГОСТ 975-88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия
Ссылка исключена с 1 июля 2015 года. - Изменение № 1, введенное в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст.
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2493-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия
ГОСТ 3622-68 Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка их к испытанию
ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 9285-78 (ИСО 992-75, ИСО 995-75, ИСО 2466-73) Калия гидрат окиси технический. Технические условия
ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия
ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 19881-74 Анализаторы потенциометрические для контроля pH молока и молочных продуктов. Общие технические условия
ГОСТ 22649-83 Стерилизаторы воздушные медицинские. Общие технические условия
ГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ
ГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения соды
ГОСТ 24066-80 Молоко. Метод определения аммиака
ГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водорода
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3. ОБОРУДОВАНИЕ, СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ
3.1. Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания +/- 0,0002 г.
3.2. Холодильник бытовой по ГОСТ 16317, поддерживающий температуру от 0 °C до 12 °C.
3.3. Центрифуга с частотой вращения 3000\text{мин}^{- 1} и разделяющим фактором 750 м/с2.
3.4. Пробирки центрифужные термостойкие вместимостью 25 см3 по ГОСТ 1770.
3.5. Термостат или блок термостатированных ячеек, поддерживающий температуру от 30 °C до 70 °C с допустимой погрешностью +/- 0,5 °C.
3.6. Баня водяная с терморегулятором, поддерживающая температуру от 60 °C до 90 °C.
3.7. Анализатор потенциометрический по ГОСТ 19881 2-го класса точности диапазоном измерений от 5,5 до 8,0 ед. pH.
3.8 Сепаратор-сливкоотделитель.
3.9 Шкаф сушильный, поддерживающий температуру (160 +/- 5) °C.
3.10 Автоклав, поддерживающий температуру (121 +/- 2) °C.
3.11. Стерилизатор воздушный медицинский по ГОСТ 22649 или стерилизатор паровой медицинский, поддерживающий температуру (121 +/- 2) °C.
3.12 Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.
3.13 Микроскоп световой биологический.
3.14 Пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное № 4.
3.15. Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
3.16. Линейка по ГОСТ 427 с пределом измерения 150 мм.
3.17 Аппарат «Микрофот 5ПО-1» или другой проекционный аппарат.
3.18. Колбы конические по ГОСТ 25336 вместимостью 25, 100, 250 см3.
3.19. Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 200 и 1000 см3.
3.20 Пробирки по ГОСТ 1770 вместимостью 10 см3.
3.21 Чашка Петри по ГОСТ 25336.
3.22. Пипетки градуированные 2-го класса точности по ГОСТ 29227 вместимостью 5, 10 и 25 см3.
3.23 Пипетки, отмеряющие объем 0,05 и 0,1 см3.
3.24. Шприц-дозатор автоматический вместимостью 0,1 см3 или шприц-дозатор автоматический вместимостью 1,0 см3, настроенный на объем пробы 0,1 см3.
3.25 Наконечники пластмассовые одноразовые вместимостью 0,1 см3.
3.26 Пинцет.
3.27 Гидролизат кормовых дрожжей.
3.28. Эталон стандартный мутности по нормативным документам государства, принявшего стандарт.
3.29. Препарат сухой для контроля определения ингибирующих веществ в молоке (СКИВ) по нормативным документам государства, принявшего стандарт.
3.30. Образец стандартный стрептомицина по нормативным документам государства, принявшего стандарт.
3.31. Фуксин основной для микробиологических целей, спиртовой раствор массовой концентрации 0,05 г/см3 по нормативным документам государства, принявшего стандарт.
3.32 Экстракт дрожжевой.
3.33 Глюкоза по ГОСТ 975.
3.34. Пептон сухой ферментированный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.
3.35 Агар микробиологический по ГОСТ 17206.
3.36 Натрий хлористый по ГОСТ 4233.
3.37 Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198.
3.38. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493.
3.39. Калия гидрат окиси по ГОСТ 9285, раствор массовой концентрации 0,056 г/см3.
3.40. Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор массовой концентрации 0,0365 г/см3.
3.41 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
3.42. Тест-культура № 1 <1> - тест-культура Bacillus stearothermophilus.
(п. 3.42 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
3.43. Тест-набор № 1, включающий: пластины из герметично укупоренных ампул, содержащих смесь агаровой и питательной сред, споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур; клейкую ленту (для пластин).
(п. 3.43 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
3.44. Тест-набор № 2 <2>, включающий: герметично укупоренные фольгой и содержащие смесь агаровой и питательной сред со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатором бромкрезолпурпур пластины микропробирок или собранные рамкой в блоки ампулы вместимостью 1,0 см3; одноразовые пипетки вместимостью 0,1 см3; клейкую ленту (для пластин).
(п. 3.44 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
3.45. Тест-набор № 3 <3>, по составу соответствующий указанному в п. 3.44.
(п. 3.45 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
3.46. Тест-набор № 4 <4>, по составу соответствующий указанному в п. 3.44.
(п. 3.46 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
3.47. Тест-набор № 5 <5>, включающий: пластины герметично укупоренных фольгой микропробирок, содержащих смесь агаровой и питательной сред со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатором бромкрезолпурпур; одноразовые пипетки вместимостью 0,1 см3; клейкую ленту (для пластин).
(п. 3.47 введен Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
3.48. Тест-набор № 6, включающий герметично укупоренные пробирки, полоски или пластины со смесью агаровой и питательной сред, содержащей споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бриллиантовый черный; самоклеящуюся ленту для пластин; контрольный раствор молока с Пенициллином G массовой концентрацией 0,004 мкг/г и контрольный раствор молока без антибиотиков.
(п. 3.48 введен Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
<1> Тест-культура Bacillus stearothermophilus various calidolactis ВКМБ-510, выпускаемая Институтом биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.
<2> Тест-наборы «Delvotest SP-NT», «Delvotest SP MINI-NT».
<4> Тест-набор «Delvotest T-ST».
<5> Тест-набор «Delvotest T-ST-DA».
(сноски <1> — <5> введены Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
Сноски <1> — <5> с указанными тест-культурой и тест-наборами являются рекомендуемыми к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает их обязательное применение. Допускаются к использованию тест-культуры и тест-наборы производства других изготовителей, обеспечивающие требования настоящего стандарта. В этом случае следует руководствоваться инструкциями, прилагаемыми к данным тест-наборам и тест-культуре.
4. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ
Отбор и подготовка проб — по ГОСТ ISO 707, ГОСТ 3622, ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, ГОСТ 26809 с дополнением. Допускается хранить подготовленные пробы молока в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C не более 24 ч.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
5. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ
5.1 Чашечный метод с Bacillus stearothermophilus
Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами Bacillus stearothermophilus и препятствовать их росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие антибиотиков в молоке устанавливают по размеру диаметра зоны ингибиции.
5.1.1 Подготовка к определению
5.1.1.1. Подготовка лабораторной посуды — по ГОСТ ISO 7218.
5.1.1.2 Приготовление сред
Питательная среда: в мерной колбе по ГОСТ 1770 вместимостью 1000 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды по ГОСТ 6709 растворяют 10,0 г дрожжевого экстракта по 3.32, 20,0 г пептона по ГОСТ 13805, 0,5 г глюкозы по ГОСТ 975, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки и потенциометрическим анализатором по 3.7 устанавливают активность питательной среды (7,1 +/- 0,1) ед. pH. Затем в необходимое количество конических колб по ГОСТ 25336 вместимостью 250 см3 наливают по 200 см3 приготовленной питательной среды и стерилизуют в стерилизаторе по 3.11 при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.
Срок хранения питательной среды в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C — не более 1 мес.
Агаровая среда: в мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 200 см3 вносят 100 см3 дистиллированной воды, 1,0 г гидролизата кормовых дрожжей, 0,4 г пептона, 0,1 г хлористого натрия по ГОСТ 4233 и 1,6 г микробиологического агара по ГОСТ 17206, перемешивают до полного растворения и нагревают на электроплитке до кипения. Затем агаровую среду охлаждают до температуры (55 +/- 5) °C, устанавливают активность агаровой среды (7,3 +/- 0,1) ед. pH и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.
Срок хранения агаровой среды в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C — не более 1 мес.
Допускается применять среды промышленного изготовления, аналогичные указанным выше.
5.1.1.3 Получение спор тест-культуры
Питательную среду, подготовленную по 5.1.1.2, засеивают 2 — 3 см3 тест-культуры № 1 по 3.42, выращенной в пробирках с этой же средой в течение 18 — 20 ч, тщательно перемешивают, помещают в термостат и нагревают при температуре (55 +/- 1) °C в течение 3 сут.
После окончания инкубации из посевов берут мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина по 3.31 массовой концентрации 50 г/дм3 и микроскопируют. При наличии в колбах с посевами 90% — 95% свободных сформировавшихся спор колбы помещают в холодильник на 16 — 18 ч для осаждения спор. Образовавшуюся надосадочную жидкость из колб сливают, а оставшийся осадок распределяют по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают на водяной бане при температуре (67 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин. После этого пробирки помещают на центрифугу по 3.3 и центрифугируют в течение 20 — 30 мин. Полученный осадок в каждой пробирке промывают дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.
Взвесь спор повторно нагревают при температуре (67 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин и переносят в пробирки.
Срок хранения спор тест-культур в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C — не более 2 мес.
5.1.1.4 Приготовление засеянной агаровой среды
В пробирки отбирают взвесь спор тест-культуры, подготовленной по 5.1.1.3, и разводят дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по стандартному эталону мутности.
К 100 см3 расплавленной и охлажденной до температуры (60 +/- 2) °C агаровой среды, подготовленной по 5.1.1.2, добавляют 2,5 см3 40%-ного водного раствора глюкозы и 4 см3 суспензии спор, подготовленной, как указано выше. Смесь агаровой среды и суспензии спор тщательно перемешивают и градуированной пипеткой разливают по (11 +/- 1) см3 в подготовленные для определения чашки Петри по ГОСТ 25336, установленные на горизонтальной поверхности.
Чашки Петри с засеянной смесью агаровой среды и суспензии спор допускается хранить в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C не более 2 сут. Перед проведением определения чашки Петри прогревают в термостате при температуре (55 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.
5.1.1.5 Подготовка проб и приготовление обезжиренного стерильного молока
Определению на наличие антибиотиков подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный — по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066, ГОСТ 24067. В стерильные пробирки пипеткой по ГОСТ 29227 отбирают по 5 — 10 см3 анализируемой пробы молока, нагревают на водяной бане при температуре (87 +/- 2) °C в течение (10 +/- 1) мин и охлаждают в холодной воде до температуры 18 °C — 25 °C.
б) Приготовление обезжиренного стерильного молока
Обезжиренное стерильное молоко получают из молока, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454, с кислотностью 16 — 18 °T с применением сепаратора-сливкоотделителя. Обезжиренное молоко разливают в пробирки по 10 см3 и стерилизуют при 101 кПа (1 атм) в течение (10 +/- 1) мин.
5.1.1.6 Приготовление контрольного раствора стрептомицина
Контрольный раствор стрептомицина используют для проверки активности роста спор тест-культуры.
а) Приготовление фосфатных буферных растворов 1 и 2
Раствор 1: в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 2,0 г двузамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 2493 и 8,0 г однозамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 4198 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают pH раствора (6,1 +/- 0,1) ед. pH с помощью растворов гидрата окиси калия по 3.39 или соляной кислоты по 3.40.
Раствор 2: в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 16,73 г двузамещенного фосфорнокислого калия и 0,523 г однозамещенного фосфорнокислого калия и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают pH раствора (7,9 +/- 0,1) ед. pH с помощью растворов гидрата окиси калия или соляной кислоты.
Растворы стерилизуют при температуре (112 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин.
Срок хранения растворов в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C — не более 30 сут.
б) Приготовление основного раствора стрептомицина массовой концентрации 500 мкг/см3
(5 +/- 1) мг стрептомицина растворяют в конической колбе вместимостью 25 см3 в фосфатном буферном растворе 1. Соотношение фактического значения массовой концентрации стрептомицина к объему буферного раствора 1 должно быть 1:100.
Пример. При массовой концентрации стандарта стрептомицина 760 мкг/см3 5 мг антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см3 буферного раствора 1, получив основной раствор массовой концентрации 500 мкг/см3.
Срок хранения основного раствора стрептомицина в посуде из темного стекла с притертой пробкой при температуре (5 +/- 1) °C — не более 30 сут.
в) Приготовление контрольного раствора стрептомицина массовой концентрации 2,5 мкг/см3
Подготавливают три стерильные пробирки вместимостью 10 см3. В первую пробирку наливают 1 см3 фосфатного буферного раствора 2 и 1 см3 основного раствора стрептомицина, во вторую — 9 см3 фосфатного буферного раствора 2 и 1 см3 раствора из первой пробирки, в третью — 9 см3 стерильного обезжиренного молока по 5.1.1.5, б и 1 см3 раствора из второй пробирки.
Массовая концентрация стрептомицина в разведениях составляет, соответственно, 250; 25 и 2,5 мкг/см3, соответственно. Третье разведение массовой концентрации 2,5 мкг/см3 является контрольным раствором.
Срок хранения контрольного раствора стрептомицина — не более 12 ч.
Допускается вместо контрольного раствора стрептомицина использовать предварительно восстановленный по ГОСТ 23454 (аналогично) препарат СКИВ по 3.29.
5.1.2 Проведение определения
5.1.2.1. На поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 5.1.1.4, пробойником по 3.14 или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм (см. рисунок 1). Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки в случае использования контрольного раствора стрептомицина.
Рисунок 1. Схема расположения лунок
5.1.2.2. В шесть лунок, расположенных по окружности чашки, пипеткой по 3.23 вносят по 0,05 см3 анализируемого молока, подготовленного по 5.1.1.5, а. В центральную лунку вносят 0,05 см3 контрольного раствора стрептомицина.
5.1.2.3. Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55 +/- 1) °C в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.
5.1.3 Обработка результатов
5.1.3.1. Результаты определения оценивают непосредственно после инкубирования по 5.1.2.3, просматривая чашки Петри в проходящем свете от любого источника света.
Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых при взаимодействии с антибиотиками в пробах анализируемого молока и контрольным раствором стрептомицина, измеряют линейкой или на аппарате «Микрофот 5ПО-1» по краям окружностей зон.
5.1.3.2. При отсутствии зон ингибиции контрольного раствора стрептомицина (центральная лунка) определение повторяют.
5.1.3.3. Зона ингибиции диаметром 12 мм и более свидетельствует о присутствии антибиотиков в анализируемой пробе молока.
Зона ингибиции диаметром не более 12 мм или ее отсутствие свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемой пробе.
5.2 Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур
Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis C953 от фиолетовой до желтой — при отсутствии в анализируемом молоке антибиотиков и сохранении фиолетовой окраски — при наличии антибиотиков.
5.2.1 Подготовка к определению
Термостат или водяную баню нагревают до температуры (64 +/- 1) °C.
(п. 5.2.1 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
5.2.1.1 Подготовка тест-набора № 1
Необходимое количество ампул отрезают от пластины по 3.43, маркируют их и выдерживают при температуре (20 +/- 2) °C. Оставшиеся ампулы в упаковке хранят в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C с учетом срока годности.
Открывают ампулы, проколов фольгу с помощью шприца или ножниц.
(п. 5.2.1.1 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
5.2.1.2 Подготовка тест-наборов № 2, № 3, № 4 и № 5
При использовании тест-наборов с пластинами микропробирок необходимое количество микропробирок отрезают от пластины ножницами или ножом и выдерживают при температуре (20 +/- 2) °C. Открывают микропробирки, полностью удаляя фольгу, и маркируют их. Оставшиеся пластины в упаковке хранят в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C с учетом срока годности.
При использовании тест-наборов с блоками ампул необходимое количество ампул достают из рамки, маркируют и выдерживают при температуре (20 +/- 2) °C. Открывают ампулы, проколов фольгу с помощью острого угла рамки или ножниц. Оставшиеся ампулы в упаковке хранят в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C с учетом срока годности.
(п. 5.2.1.2 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
5.2.2 Проведение определения
5.2.2.1 Проведение определения с использованием тест-набора № 1
В каждую ампулу по 5.2.1.1 пипеткой вносят 0,1 см3 анализируемого молока, используя каждый раз новую пипетку. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C до окончания определения.
Ампулы заклеивают клейкой лентой по 3.43, помещают в термостат или на водяную баню и выдерживают при температуре (65 +/- 2) °C в течение 3 ч.
(п. 5.2.2.1 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
5.2.2.2 Проведение определения с использованием тест-наборов № 2, № 3, № 4 и № 5
При использовании тест-наборов с пластинами микропробирок в каждую микропробирку по 5.2.1.2 пипеткой по 3.44 вносят 0,1 см3 анализируемого молока, используя каждый раз новую пипетку. После отбора пробы пипеткой избыток молока попадает в специальный резервуар на пипетке. Если этого не произошло — отбор пробы молока повторяют. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C до окончания определения.
Пластину с микропробирками заклеивают клейкой лентой, помещают в термостат или на водяную баню и выдерживают при температуре (64 +/- 2) °C в течение 3 ч (при использовании тест-набора № 4 — 4 ч).
При использовании тест-наборов с блоками ампул в каждую ампулу по 5.2.1.2 пипеткой по 3.44 вносят 0,1 см3 анализируемого молока, используя каждый раз новую пипетку. После отбора пробы пипеткой избыток молока попадает в специальный резервуар на пипетке. Если этого не произошло — отбор пробы молока повторяют. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C до окончания определения.
Ампулы помещают в термостат или на водяную баню и выдерживают при температуре (64 +/- 2) °C в течение 3 ч (при использовании тест-набора № 4 — 4 ч).
(п. 5.2.2.2 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
5.2.2.3. Контрольное определение проводят в соответствии с 5.2.2.1 или 5.2.2.2. В ампулу (микропробирку) вносят 0,1 см3 предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.
(п. 5.2.2.3 введен Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
5.2.3 Обработка результатов
5.2.3.1. Ампулы (пластины с микропробирками) извлекают из термостата или водяной бани и определяют цвет их содержимого.
(п. 5.2.3.1 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
5.2.3.2. Желтый цвет содержимого ампул (микропробирок) с анализируемыми пробами молока свидетельствует об отсутствии в нем антибиотиков. Фиолетовое кольцо, образовавшееся на поверхности содержимого ампул (диаметром не более 1 мм), не учитывают.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
5.2.3.3. Фиолетовый цвет содержимого ампул (микропробирок) с анализируемыми пробами молока свидетельствует о наличии антибиотиков.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
5.3 Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный
Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis от синей до желтой — при отсутствии в анализируемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении синей окраски — при наличии антибиотиков.
5.3.1 Подготовка к определению
Отрезают необходимое число полосок от тестовых пластин тест-набора № 6 по 3.48 или берут требуемое количество пластин или пробирок тест-набора № 6. Удаляют запаянную фольгу с тестовых полосок и пластин или откупоривают пробирки. Оставшиеся пластины или пробирки хранят в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
5.3.2 Проведение определения
5.3.2.1. При использовании пластин или полосок в одну из ячеек каждой пластины или полоски одноразовой пипеткой вносят 0,1 см3 контрольного раствора молока без антибиотиков по 3.46, в другую ячейку — 0,1 см3 контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные ячейки пластины или полоски вносят по 0,1 см3 анализируемого молока в двукратной повторности.
5.3.2.2. При использовании пробирок в одну пробирку одноразовой пипеткой вносят 0,1 см3 контрольного раствора молока без антибиотиков, в другую — 0,1 см3 контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные пробирки одноразовой пипеткой вносят по 0,1 см3 анализируемого молока в двукратной повторности.
5.3.2.3. Тестовые пластины и полоски заклеивают самоклеящейся лентой по 3.46, пробирки закупоривают и помещают в блок термостатированных ячеек по 3.5 или на водяную баню по 3.6 при температуре (65,0 +/- 0,5) °C и выдерживают до тех пор, пока содержимое на дне ячейки тестовых пластин или полосок или пробирки с контрольным раствором молока без антибиотиков не окрасится полностью в желтый цвет в течение (135 +/- 15) мин.
5.3.3 Обработка результатов
5.3.3.1. Пробирки, тестовые пластины или тестовые полоски извлекают из блока термостатируемых ячеек или водяной бани и определяют цвет содержимого на дне, не нарушая их целостности.
5.3.3.2. Желтый цвет содержимого пробирок или ячеек тестовых полосок или пластин с контрольным раствором и анализируемыми пробами молока свидетельствует об отсутствии в нем антибиотиков.
5.3.3.3. Синий цвет содержимого пробирок или ячеек тестовых полосок или пластин с контрольным раствором и анализируемыми пробами молока свидетельствует о наличии в нем антибиотиков.
6. Метрологические характеристики
(раздел 6 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 23.10.2014 № 1400-ст)
Наименьшие пределы определения антибиотиков в молоке приведены в таблицах 1 и 2.
7. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
При работе с химическими реактивами следует соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005 и ГОСТ 12.1.007.
Работу со споровой тест-культурой в лаборатории проводят в соответствии с установленными санитарными правилами, действующими на территории государства, принявшего стандарт.