ГОСТ 26073-84 (СТ СЭВ 3458-81). Государственный стандарт Союза ССР. Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики паратуберкулеза
(утв. и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 09.01.1984 № 46)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563). С 01.07.2003 до вступления в силу технических регламентов акты федеральных органов исполнительной власти в сфере технического регулирования носят рекомендательный характер и подлежат обязательному исполнению только в части, соответствующей целям, указанным в п. 1 ст. 46 Федерального закона от 27.12.2002 № 184-ФЗ. Ограничение срока действия снято по Протоколу № 3-93 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации («ИУС», № 5 — 6, 1993). Документ утрачивает силу с 01.07.1989. Документ введен в действие с 01.07.1984.
Утвержден и введен в действие Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. № 46
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПАРАТУБЕРКУЛЕЗА
Agricultural animals. Methods of laboratory diagnostics of paratuberculosis
ГОСТ 26073-84 (СТ СЭВ 3458-81)
Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. № 46 срок действия установлен
с 1 июля 1984 года до 1 июля 1989 года
РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР
Н.П. Овдиенко, В.А. Шаров, В.Е. Щуревский, Н.И. Данилова, Н.А. Иванова, О.В. Якушева, А.Н. Шаров, Э.С. Плотников
ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР
Зам. начальника Главного управления ветеринарии П.П. Рахманин
УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. № 46
Несоблюдение стандарта преследуется по закону
Настоящий стандарт распространяется на крупный и мелкий рогатый скот и устанавливает методы лабораторной диагностики заболевания паратуберкулезом, вызываемого микобактериями M. paratuberculosis.
Стандарт применяют при диагностировании заболевания в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских институтов, республиканских и областных (краевых) ветеринарных лабораториях.
Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 3458-81.
1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ
1.1. Для бактериоскопического исследования берут от живых животных не менее 10 см3 фекалий и соскобы слизистой оболочки прямой кишки.
От павших или убитых животных берут не менее трех — пяти различных участков подвздошной кишки, два — четыре брыжеечных лимфатических узла, кусочек илеоцекальной заслонки с прилегающим лимфатическим узлом. При отборе патологического материала прежде всего берут измененные участки кишечника с утолщением, выраженной складчатостью слизистой оболочки и увеличенные лимфатические узлы.
1.2. Пробы патологического материала (отрезки кишечника, лимфатические узлы) для проведения культурального исследования замораживают или консервируют стерильным 30%-ным раствором глицерина.
Отрезки кишечника и лимфатические узлы помещают в разные стерильные пакеты из пергаментной бумаги или банки.
1.3. Для гистологического исследования отрезки кишечника и лимфатические узлы фиксируют в 10%-ном растворе формалина.
1.4. Для серологического исследования берут из яремной вены 5 — 10 см3 крови в стерильные пробирки или используют кровь, полученную при убое животного.
Из отобранных проб крови получают сыворотку методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают 30 — 60 мин при температуре 20 — 30 °C, а затем при температуре 4 — 10 °C. Сыворотка крови должна быть прозрачной, без признаков гемолиза.
Допускается консервировать сыворотку 5%-ным раствором карболовой кислоты (1 — 2 капли на 1 см3 сыворотки) или сухой борной кислотой (2% кислоты к объему сыворотки).
Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия пробы, сыворотки консервированные — в течение 30 сут со дня консервирования при условии сохранения ее первоначального вида.
1.5. Пробы для исследования упаковывают в полиэтиленовые пакеты, помещают в ящик, опечатывают и вместе с сопроводительным документом направляют в лабораторию.
В сопроводительном документе указывают наименование и адрес отправителя, опись проб патологического материала, акт с эпизоотологическими данными.
2. МЕТОД БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Сущность метода заключается в обнаружении микобактерий паратуберкулеза в исследуемом материале и определении их морфологических и тинкториальных свойств путем микроскопии.
2.1 Аппаратура и реактивы
Аппарат для встряхивания (щутель-аппарат).
Центрифуга лабораторная с частотой вращения 2500 — 3000 об/мин.
Стекла предметные по ГОСТ 9284-75.
Микроскоп биологический с иммерсионной системой по ГОСТ 8284-78.
Глицерин по ГОСТ 6259-75.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
Фуксин Циля карболовый; готовят следующим образом: 1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и 0,5 см3 глицерина, добавляя порциями 10 см3 этилового спирта. После растворения краски добавляют при помешивании 100 см3 дистиллированной воды. Раствор краски через 24 ч пропускают через бумажный фильтр. Фуксин Циля стойкий и его хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.
Спирт солянокислый 3%-ный; готовят следующим образом: 3 см3 концентрированной соляной кислоты по ГОСТ 3118-77 добавляют к 97 см3 96%-ного этилового спирта.
Синь метиленовая (метиленовый голубой), насыщенный раствор; готовят следующим образом: 8 — 9 г кристаллической метиленовой сини растворяют в 100 см3 этилового спирта.
Синька Леффлера метиленовая, водно-спиртовой раствор; готовят следующим образом: 30 см3 насыщенного раствора метиленовой сини пропускают через бумажный фильтр, добавляют 1 см3 1%-ного раствора гидроокиси калия и разбавляют 100 см3 дистиллированной воды. Раствор устойчив в течение длительного времени.
Масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739-78.
2.2 Подготовка к исследованию
2.2.1. Готовят мазки из слизистой оболочки кишечника и брыжеечных лимфатических узлов растиранием материала между двумя предметными стеклами. Перед тем как сделать мазки, слизистую оболочку промывают водой или физиологическим раствором от фекалий.
Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем и окрашивают по методу Циль-Нильсена.
На мазки кладут полоску фильтровальной бумаги, наливают на нее раствор фуксина Циля и нагревают до появления пара (два-три раза) в течение 5 мин, не допуская краситель до кипения и добавляя каждый раз раствор краски.
Дают препарату остыть, удаляют пинцетом бумагу, сливают избыток красителя. Мазки промывают водой, после чего обесцвечивают 3%-ным солянокислым спиртом (20 — 30 с) до слабо-розового окрашивания.
Мазки промывают водой и окрашивают раствором метиленовой синьки Леффлера в течение 3 — 5 мин, краску сливают, мазок промывают водой и высушивают на воздухе.
2.3 Проведение исследования
2.3.1. Мазки просматривают под микроскопом. Если бактерий не обнаруживают или наблюдают единичные, просматривают не менее 50 полей зрения.
2.4 Обработка результатов
2.4.1. Для микобактерий паратуберкулеза характерны палочки темно-красного цвета, которые располагаются на синем фоне палисадом (частоколом) или кучками по две, три и более.
Обнаружение бактерий с указанными признаками дает основание для предварительного заключения о наличии возбудителя этой болезни.
При обнаружении в мазках единичных и нетипично расположенных кислотоустойчивых бактерий из исследуемого материала повторно готовят и просматривают 4 — 6 мазков.
3. МЕТОД КУЛЬТУРАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Сущность метода заключается в выделении культуры микобактерий паратуберкулеза из исследуемого материала и их идентификации на специальных питательных средах.
3.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Центрифуга с частотой вращения 3000 об/мин.
Баня водяная с терморегулятором на 30 — 70 °C.
Весы лабораторные по ГОСТ 24104-80.
Пипетки стеклянные мерные вместимостью на 1, 5, 10 см3 по ГОСТ 20292-74.
Воронка делительная вместимостью 300 см3 по ГОСТ 25336-82.
Кислота серная по ГОСТ 4204-77, концентрированная, 3 и 6%-ная.
Кислота соляная по ГОСТ 3118-77.
Кислота щавелевая по ГОСТ 22180-76, 5%-ный раствор.
Калия гидроокись по ГОСТ 24363-80.
Натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, 0,85%-ный раствор, pH 7,0.
Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 245-76.
Натрий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 4172-76.
Магний сернокислый по ГОСТ 4523-77.
Кальций хлористый по ГОСТ 4209-77.
Цинк сернокислый по ГОСТ 4174-77.
Медь сернокислая по ГОСТ 4165-78.
Железо аммонийное лимоннокислое.
Глицерин по ГОСТ 6259-75.
Спирт этиловый ректификованный 96%-ный по ГОСТ 5962-67.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
Сыворотка инактивированная крупного рогатого скота.
Микобактин (спиртовой экстракт из микобактерий флей по Смиту); готовят следующим образом: культуру микобактерий флей (тимофеевой травы) выращивают на мясопептонном бульоне, содержащем 4% пептона и 10% глицерина (среда Френсиса, pH 7,2). Через 3 — 4 недели при получении пышного роста культуры микробную массу отделяют от жидкости, пропуская через двойной бумажный фильтр. Культуру отжимают в воронке, промывают стерильной дистиллированной водой и нагревают при 80 °C в течение 30 мин в аппарате Коха. Высушивают в эксикаторе в чашках Петри над серной кислотой или хлористым кальцием или в термостате при 45 °C, а затем помещают в стерильную ступку и тщательно растирают в порошок;
20 г сухого порошка три раза экстрагируют кипячением в спирте в течение 20 мин в колбе с обратным холодильником, приливая каждый раз 150 см3 спирта.
Все порции экстракта собирают и оставляют на ночь. Надосадочную жидкость пропускают через бумажный фильтр и сливают в колбу, затем сгущают при пониженном давлении до образования вязкой красновато-оранжевой жидкости. Полученную жидкость смешивают с 80 см3 50%-ного раствора глицерина, приготовленного на дистиллированной воде. Устанавливают pH 7,6. Жидкость прогревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Горячую жидкость помещают в делительную воронку и оставляют на ночь.
Нижнюю светлую часть жидкости (pH 7,0) сливают, разливают в ампулы, запаивают и автоклавируют при 120 °C в течение 20 мин. Экстракт хранят при комнатной температуре.
Модифицированная казеиновая питательная среда Дюбо-Смита (ВИЭВ А.П. Аликаева) следующего состава:
однозамещенный фосфорнокислый калий
двузамещенный фосфорнокислый натрий
Перед употреблением к расплавленному в водяной бане полуфабрикату добавляют 20% стерильной, инактивированной при 50 °C в течение 1 ч сыворотки крупного рогатого скота и пенициллин из расчета 50 ЕД на 1 см3 среды.
Готовую среду разливают по пробиркам, скашивают, выдерживают при комнатной температуре в течение 24 ч. Для проверки на стерильность пробирки со средой помещают в термостат на 2 — 3 сут при температуре 38 °C. При посевах используют свежую среду, приготовленную не более чем за 14 сут до исследования. Среды хранят в сухом прохладном месте.
3.2 Проведение исследования
3.2.1. Фекальные массы, измельченные и растертые в ступке (около 10 см3), смешивают с 10 частями 5%-ного раствора щавелевой кислоты в стерильном флаконе с крышкой и встряхивают.
Флакон со смесью ставят на 20 — 30 мин при 37 °C на водяную баню, а затем центрифугируют с частотой вращения 2500 — 3000 об/мин в течение 15 мин.
После центрифугирования отделяют надосадочную жидкость, осадок отмывают стерильным физиологическим раствором, затем с поверхности его бактериологической петлей берут материал и высевают в 5 — 6 пробирок с питательной средой с микобактином и для контраста в среду Левенштейна-Йенсена.
3.2.2. Кусочки лимфатических узлов и отдельно соскобы (ткань) слизистой оболочки и подслизистого слоя кишечника (5 — 6 кусочков) измельчают ножницами до 2 — 3 мм и помещают в разные стерильные ступки, покрытые пергаментной бумагой.
Лимфатические узлы заливают 3%-ным раствором серной кислоты в соотношении 1:10, а слизистую оболочку кишечника — 6%-ным раствором этой кислоты и выдерживают в течение 10 — 15 мин.
Раствор серной кислоты сливают, а патологический материал заливают в зависимости от концентрации серной кислоты на 5 или 10 мин соответственно стерильным физиологическим раствором в таком же объеме.
Физиологический раствор сливают, кусочки материала растирают и суспензируют в небольшом количестве стерильного физиологического раствора, а затем высевают в 5 — 6 пробирок на питательную среду с микобактином и среду Левенштейна-Йенсена, как указано в п. 3.2.1.
Питательные среды после высева материала выдерживают в термостате при 38 °C в течение 3 — 4 мес.
Рост возбудителя паратуберкулеза на средах с сильным обсеменением тканей появляется через 18 — 20 сут, при слабом — в течение 3 — 4 мес. Культуры вырастают в виде плоских колоний с неровными краями и ядром в центре. В дальнейшем они принимают бугристый вид.
Для идентификации выделенную культуру высевают на среду с микобактином и без него. Возбудитель паратуберкулеза в первых генерациях размножается на питательной среде только в присутствии микобактина.
3.3 Обработка результатов
3.3.1. Результат исследования считают положительным, если культура выросла на среде с микобактином и отсутствует ее рост на средах без него.
4. МЕТОД СЕРОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Сущность метода заключается в выявлении комплементсвязывающих антител в сыворотке крови животных, инфицированных микобактериями паратуберкулеза, реакцией связывания комплемента (РСК).
4.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Центрифуга с частотой вращения 3000 об/мин.
Термостат с регулированием температуры на 37 — 38 °C.
Баня водяная с терморегулятором на 30 — 70 °C.
pH-метр ЛПУ-01 или другого типа того же класса точности.
Антиген паратуберкулезный для РСК.
Сыворотка положительная контрольная.
Сыворотка отрицательная контрольная.
Сыворотка гемолитическая для РСК по ГОСТ 16445-78.
Комплемент сухой по ГОСТ 16446-78.
Эритроциты крови барана, 2,5%-ная взвесь.
Натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, 0,85%-ный раствор, pH 7,0 — 7,2.
Натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280-76.
Кислота лимонная по ГОСТ 3652-69.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
Раствор Альсивера; готовят следующим образом: растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды 18,7 г глюкозы, 4,2 г хлористого натрия, 8,0 г лимоннокислого натрия, 0,5 г лимонной кислоты. Раствор доводят до кипения, охлаждают, пропускают через бумажный фильтр, разливают в колбы или флаконы и стерилизуют в автоклаве.
4.2 Подготовка к исследованию
4.2.1. Для приготовления суспензии эритроцитов крови барана берут кровь из яремной вены барана (овцы) с соблюдением правил асептики в сосуд, содержащий стеклянные или фарфоровые бусы, и дефибринируют или в сосуд, содержащий раствор Альсивера (для консервирования) в количестве, равном количеству крови.
Свежедефибринированную кровь или кровь через 6 — 14 сут после ее консервирования два-три раза отмывают в течение 15 мин на центрифуге с частотой вращения 2000 — 3000 об/мин в физиологическом растворе до полного обесцвечивания надосадочной жидкости. Для постановки реакции готовят из осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе.
4.2.2. Для приготовления гемолитической системы, применяемой в РСК, смешивают равные объемы гемолитической сыворотки в удвоенном титре, указанном учреждением, ее изготовившим, и взвеси эритроцитов. Смесь оставляют на 15 мин для сенсибилизации.
4.3 Проведение исследования
4.3.1. Реакцию связывания комплемента (РСК) проводят в пробирках вместимостью 2,5 см3 по 0,5 см3 каждого компонента-сыворотки (испытуемой и контрольных), антигена, комплемента и 1 см3 гемолитической системы.
Предварительно испытуемую сыворотку, сыворотки отрицательную и положительную (контроли) разбавляют физиологическим раствором 1:10, инактивируют в водяной бане при температуре 61 — 62 °C в течение 30 мин.
Реакцию связывания комплемента проводят в водяной бане при температуре 37 — 38 °C. Время связывания комплемента 20 мин, время реакции после добавления гемолитической системы — 20 мин.
В качестве контроля вместо испытуемой сыворотки в РСК используют отрицательную, а также положительную паратуберкулезные сыворотки в разведениях 1:10 с антигеном и 1:10 без антигена.
Контролем гемолитической системы является 1,5 см3 физиологического раствора и 1 см3 гемолитической системы.
При постановке опыта проводят титрование комплемента в соответствии с ГОСТ 16448-78. В РСК берут комплемент в количестве на два интервала выше его титра (при титре 0,16 — 0,22; пентитре 0,22 — 0,28).
Титры каждой серии антигена и гемолитической сыворотки устанавливают предприятия-изготовители.
Реакцию связывания комплемента учитывают визуально один раз через 16 — 18 ч выдерживания в прохладном месте.
4.4 Обработка результатов
Результаты реакции учитывают по следующей схеме:
Задержку гемолиза в «один крест» принимают за сомнительный результат и сыворотку крови от этого животного через 15 — 20 сут исследуют повторно.
5. МЕТОД ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Сущность метода заключается в выявлении в тканях животных, больных паратуберкулезом, микобактерий возбудителя болезни и характерных морфологических изменений.
5.1 Аппаратура, материалы, реактивы
5.1.1 Аппаратура, материалы и реактивы, указанные в п. 2.1, и дополнительно:
микротом с микротомными ножами;
стекла покровные по ГОСТ 6672-75;
спирт этиловый ректификованный, 96%-ный по ГОСТ 5962-67;
формалин по ГОСТ 1625-75, 10%-ный раствор;
ксилол (пара, орто, мета) по ГОСТ 9949-76;
бальзам пихтовый по ГОСТ 2290-76 или кедровый, или канадский.
5.2 Подготовка к исследованию
5.2.1. Кусочки ткани заливают в целлоидин или парафин и делают срезы. Срезы готовят также и на замораживающем микротоме. Препараты окрашивают гемотоксилин-эозином и по Циль-Нильсену в модификации для окраски срезов.
5.3 Проведение исследования
5.3.1 Срезы просматривают под микроскопом.
5.4 Обработка результатов
5.4.1. Обнаружение в стенке кишечника и брыжеечных лимфатических узлах пролиферации из эпителиоидных и гигантских клеток с микобактериями или без них (у 1/3 животных гигантские клетки и микобактерии могут отсутствовать) свидетельствует о типичных для паратуберкулеза гистологических изменениях.
При дифференциальной диагностике паратуберкулеза учитывают сходные изменения, наблюдаемые при туберкулезе, неспецифическом катаре кишечника и паразитарных болезнях.
При туберкулезе кишечника находят обызвествленные казеозные очаги в стенке кишечника, брыжеечных и других лимфатических узлах и органах, отсутствующих при паратуберкулезе. При окраске срезов по Циль-Нильсену обнаруживают редко единичные микобактерии.
Паразитарные узелки дифференцируют по нахождению паразита и эозинофильноклеточной пролиферации.
При неспецифическом — банальном катаре кишечника отсутствуют эпителоидные пролифераты в стенке кишки и в регионарных лимфатических узлах.