ФС.2.1.0559. Фармакопейная статья. Рибофлавин

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 № 377)

(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание»)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Рибофлавин Рибофлавин Riboflavinum	ФС.2.1.0559
	Взамен ФС 42-2954-93

C17H20N4O6 [83-88-5]	М.м. 376,36

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

7,8-Диметил-10-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-тетрагидроксипентил]бензо[g]птеридин-2,4(3H,10H)-дион.

Субстанция представляет собой продукт ферментации.

Содержит не менее 97,0% и не более 103,0% рибофлавина C17H20N4O6 в пересчете на сухое вещество.

СВОЙСТВА

Описание. Желтый или оранжево-желтый кристаллический порошок.

<*> Проявляет полиморфизм. Растворы рибофлавина неустойчивы на свету, особенно в присутствии щелочей.

---

<*> Приводится для информации.

Растворимость. Очень мало растворим в воде, практически нерастворим в спирте 96%.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ

1. Спектрофотометрия (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»).

Испытуемый раствор. Смешивают равные объемы испытуемого раствора, полученного в испытании «Количественное определение», и воды.

Спектр поглощения испытуемого раствора должен иметь максимумы при 223 нм, 267 нм, 373 нм и 444 нм. Отношение значений оптических плотностей A373/A267 должно быть от 0,31 до 0,33. Отношение значений оптических плотностей A444/A267 должно быть от 0,36 до 0,39.

2. Определение проводят методом ТСХ (ОФС «Тонкослойная хроматография»).

Пластинка. ТСХ пластинка со слоем силикагеля (2 — 10 мкм).

Подвижная фаза (ПФ). Вода.

Испытуемый раствор. К 25 мг субстанции прибавляют 10 мл воды, встряхивают в течение 5 мин и фильтруют.

Раствор стандартного образца рибофлавина. К 25 мг (точная навеска) фармакопейного стандартного образца рибофлавина прибавляют 10 мл воды, встряхивают в течение 5 мин и фильтруют.

На линию старта пластинки наносят:

• 1 точка: 2 мкл метиленхлорида и затем 2 мкл испытуемого раствора;
• 2 точка: 2 мкл метиленхлорида и затем 2 мкл раствора стандартного образца рибофлавина.

После каждого последовательного нанесения в точках 1 и 2 пластинку подсушивают в токе холодного воздуха, помещают в камеру с ПФ и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт ПФ пройдет около 80 — 90% длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат в потоке холодного воздуха до удаления следов растворителей и просматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм.

Результат. Основная зона адсорбции на хроматограмме испытуемого раствора по положению, величине и цвету флуоресценции должна соответствовать зоне адсорбции рибофлавина на хроматограмме раствора стандартного образца рибофлавина.

3. Качественная реакция. Растворяют 1 мг субстанции в 100 мл воды. В проходящем свете раствор должен иметь бледно-зеленовато-желтый цвет, в отраженном свете — интенсивную желтовато-зеленую флуоресценцию, которая должна исчезать при добавлении минеральных кислот или щелочей.

ИСПЫТАНИЯ

Удельное вращение. От -115,0 до -135,0 в пересчете на сухое вещество (ОФС «Оптическое вращение»).

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 50 мг субстанции, растворяют в натрия гидроксида растворе 0,05 М и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Раствор используют в течение 30 мин.

Родственные примеси. Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).

Все растворы используют сразу после приготовления и защищают от света.

Подвижная фаза А (ПФА). Фосфорная кислота концентрированная — вода 1:1000.

Подвижная фаза Б (ПФБ). Ацетонитрил.

Растворитель. Натрия ацетата раствор 0,1 М.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,12 г субстанции, растворяют в 10 мл натрия гидроксида раствора 0,1 М, при необходимости обрабатывая ультразвуком, и доводят объем раствора растворителем до метки.

Раствор сравнения. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл испытуемого раствора и доводят объем раствора растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора растворителем до метки.

Раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 10 мг субстанции, растворяют в 1 мл натрия гидроксида раствора 0,5 М, выдерживают в дневном свете в течение 1,5 ч, прибавляют 0,5 мл уксусной кислоты разведенной 30% и доводят объем раствора водой до метки (содержит примеси A и B).

Раствор для идентификации пиков. Содержимое флакона фармакопейного стандартного образца рибофлавина для идентификации пиков, содержащего примеси C и D, растворяют в 1 мл смеси ПФБ — ПФА 1:9, при необходимости обрабатывая ультразвуком.

Примечание

Примесь A: 7,8,10-триметилбензо[g]птеридин-2,4(3H,10H)-дион [1088-56-8].

Примесь B: 7,8-диметилбензо[g]птеридин-2,4(1H,3H)-дион [1086-80-2].

Примесь C: 6,7-диметил-8-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-тетрагидроксипентил]птеридин-2,4(3H,8H)-дион [5118-16-1].

Примесь D: 8-(гидроксиметил)-7-метил-10-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5-тетрагидроксипентил]бензо[g]птеридин-2,4(3H,10H)-дион [52134-62-0].

Хроматографические условия

Колонка	250 x 4,6 мм, силикагель октадецилсилильный эндкепированный для хроматографии, 5 мкм;
Температура колонки	25 °C;
Скорость потока	1,0 мл/мин;
Детектор	спектрофотометрический, 267 нм;
Объем пробы	10 мкл.

Режим хроматографирования

Время, мин	ПФА, %	ПФБ, %
0 — 5	90	10
5 — 20	90 \rightarrow 80	10 \rightarrow 20
20 — 25	80	20
25 — 35	80 \rightarrow 50	20 \rightarrow 50
35 — 45	50	50

Хроматографируют раствор для идентификации пиков, раствор для проверки разделительной способности хроматографической системы, раствор сравнения и испытуемый раствор.

Относительное время удерживания соединений. Рибофлавин — 1 (около 16 мин); примесь C — около 0,2; примесь D — около 0,5; примесь A — около 1,4; примесь B — около 1,9.

Идентификация примесей. Для идентификации пиков примесей C и D используют относительное время удерживания соединений, хроматограмму раствора для идентификации пиков и хроматограмму, прилагаемую к стандартному образцу рибофлавина для идентификации пиков.

Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора для проверки разделительной способности хроматографической системы разрешение (RS) между пиками примеси A и примеси B должно быть не менее 5.

Поправочные коэффициенты. Для расчета содержания примесей площади пиков следующих примесей умножают на соответствующие поправочные коэффициенты: примесь A — 0,7; примесь B и D — 1,4, примесь C — 2,3.

Допустимое содержание примесей. На хроматограмме испытуемого раствора:

• площадь пика примеси A не должна превышать 0,25 площади основного пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,025%);
• площадь пика каждой из примесей B, C и D не должна превышать двукратную площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,2%);
• площадь пика любой другой примеси не должна превышать площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,1%);
• сумма площадей пиков всех примесей не должна превышать пятикратную площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,5%).

Не учитывают пики, кроме пика примеси A, площадь которых составляет менее 0,5-площади основного пика на хроматограмме раствора сравнения (менее 0,05%).

Потеря в массе при высушивании. Не более 1,5% (ОФС «Потеря в массе при высушивании», способ 1). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.

Сульфатная зола. Не более 0,1% (ОФС «Сульфатная зола»). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.

Тяжелые металлы. Не более 0,001%. Определение проводят в соответствии с ОФС «Тяжелые металлы» (метод 3А или 3Б), в зольном остатке, полученном в испытании «Сульфатная зола» с использованием эталонного раствора 1.

<**> Бактериальные эндотоксины. Не более 7,1 ЕЭ на 1 мг рибофлавина (ОФС «Бактериальные эндотоксины»).

---

<**> Испытание проводят для субстанции, предназначенной для производства лекарственных препаратов для парентерального применения.

Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС «Остаточные органические растворители».

Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Определение проводят методом спектрофотометрии (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»).

Все растворы защищают от света.

Раствор натрия ацетата. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,4 г натрия ацетата тригидрата, растворяют воде и доводят объем раствора водой до метки.

Испытуемый раствор. В мерную колбу из темного стекла вместимостью 500 мл помещают 65 мг (точная навеска) субстанции, суспендируют с 5 мл воды до полного смачивания, прибавляют 5 мл натрия гидроксида раствора 8,5%, перемешивают до полного растворения, тотчас прибавляют 100 мл воды, 2,5 мл уксусной кислоты ледяной и доводят объем раствора водой до метки. В мерную колбу из темного стекла вместимостью 200 мл помещают 20,0 мл полученного раствора, прибавляют 3,5 мл раствора натрия ацетата и доводят объем раствора водой до метки.

Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 444 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, используя в качестве раствора сравнения воду.

Содержание рибофлавина C17H20N4O6 в субстанции в пересчете на сухое вещество в процентах (X) вычисляют по формуле:

X = \frac{A \cdot 500 \cdot 200 \cdot 100}{328 \cdot a \cdot 20 \cdot (100 - W)} ,

где A — оптическая плотность испытуемого раствора;

328 — удельный показатель поглощения рибофлавина, (A_{1\text{см}}^{1\%}) ;

a — навеска субстанции, г;

W — потеря в массе при высушивании, %.

ХРАНЕНИЕ

В герметично укупоренной упаковке, в защищенном от света месте.

---