МУК 4.1.3001-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств спиротетрамата и его основного метаболита спиротетрамата-енола в цитрусовых культурах (апельсин, мандарин, лимон, лайм, грейпфрут, клементин), плодовых семечковых (яблоня, груша), плодовых косточковых (персик, нектарин, абрикос), овощных культурах (томаты, перец, огурцы), хмеле, винограде и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 19.03.2012)

с момента утверждения

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ СПИРОТЕТРАМАТА И ЕГО ОСНОВНОГО МЕТАБОЛИТА СПИРОТЕТРАМАТА-ЕНОЛА В ЦИТРУСОВЫХ КУЛЬТУРАХ (АПЕЛЬСИН, МАНДАРИН, ЛИМОН, ЛАЙМ, ГРЕЙПФРУТ, КЛЕМЕНТИН), ПЛОДОВЫХ СЕМЕЧКОВЫХ (ЯБЛОНЯ, ГРУША), ПЛОДОВЫХ КОСТОЧКОВЫХ (ПЕРСИК, НЕКТАРИН, АБРИКОС), ОВОЩНЫХ КУЛЬТУРАХ (ТОМАТЫ, ПЕРЕЦ, ОГУРЦЫ), ХМЕЛЕ, ВИНОГРАДЕ И ВИНОГРАДНОМ СОКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22.12.2012 № 2).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 19 марта 2012 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 16.08.2011 № 0097.12.08.11.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации спиротетрамата и его основного метаболита спиротетрамата-енола в цитрусовых (апельсин, мандарин, лимон, лайм, грейпфрут, клементин), плодовых семечковых (яблоня, груша), плодовых косточковых (персик, нектарин, абрикос) культурах, томатах, огурцах, винограде, виноградном соке в диапазоне 0,04 — 0,4 мг/кг, перце в диапазоне 0,08 — 0,8 мг/кг и хмеле в диапазоне 0,4 — 4,0 мг/кг.

Название действующего вещества по ИСО: спиротетрамат (BYI 08330).

Название действующего вещества по ИЮПАК: cis-3-(2,5-Диметилфенил)-8-метокси-2-оксо-1-азаспиро[4,5]дес-3-ен-4-ил этил карбамат.

Эмпирическая формула: C_{21}H_{27}NO_{5} .

Молекулярная масса: 373,45.

Бесцветное кристаллическое вещество. Температура плавления 142 °C. Давление паров (в Па): 5,6 \times 10^{- 9} (20 °C), 1,5 \times 10^{- 8} (25 °C), 1,5 \times 10^{- 6} (50 °C). Плотность 1,22. Растворимость в органических растворителях при 20 °C (в г/дм3): ацетон — 100 — 120; дихлорметан — более 600; этилацетат — 67; этанол — 44; толуол — 60; н-октанол — 140; н-гексан — 0,055. Растворимость в воде при 20 °C (мг/дм3): 33,5 (pH 4), 29,9 (pH 29,9), 19,1 (pH 9). Коэффициент распределения н-октанол-вода — logK_{ow}2,51(pH4,7);2,50(pH9) .

Основным продуктом метаболитической деградации спиротетрамата в растениях является спиротетрамат-енол (BYI 08330-enol).

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD_{50}) для крыс — более 2000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD_{50}) для крыс — более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC_{50}) для крыс (4 ч) — 4,18 мг/дм3.

Название действующего вещества по ИСО: спиротетрамат-енол (BYI 08330-enol).

Название действующего вещества по ИЮПАК: cis-3-(2,5-Диметилфенил)-4-гидрокси-8-метокси-1-азаспиро[4,5]дес-3-ен-2-он.

Структурная формула:

Бесцветное кристаллическое вещество, удовлетворительно растворимое в воде — 2,7 г/дм3 (pH 7). Коэффициент распределения н-октанол-вода — logK_{ow} - 0,3(pH7) . Является слабой кислотой: pKa = 5,2.

Область применения

Спиротетрамат — системный инсектицид класса кетоенолов, рекомендуемый для борьбы с широким спектром сосущих насекомых на различных сельскохозяйственных культурах (фрукты, овощи, виноград, хмель и др.).

Гигиенические нормативы: МДУ спиротетрамата (в импортируемой продукции): цитрусовые, плодовые семечковые культуры — 1,0 мг/кг; плодовые косточковые культуры — 3,0 мг/кг; томаты, перец, виноград — 2,0 мг/кг; огурцы — 0,2 мг/кг; хмель — 15,0 мг/кг.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Метрологические параметры

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

2. Метод измерений

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих выполнения п. 7.1 (очистка растворителей).

3.3 Вспомогательные средства измерений, устройства и материалы

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоивших данную методику и подтвердивших экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, смеси для экстракции, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик, подготовка концентрирующих патронов Sep - Pak^{®} Vac 35cc C18, Oazis^{®} HLB, Oazis^{®} MAX и Oazis^{®} MCX.

7.1 Очистка органических растворителей

7.1.1 Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм3 ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм3 ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.1.2 Этилацетат, дихлорметан

7.1.2.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.2.2. Очистка растворителя. Растворитель промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.2 Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией 1 моль/дм3 (1 М раствор)

В мерную колбу вместимостью 1000 см3, содержащую 500 - 600 см3 деионизованной воды, помещают 83 см3 концентрированной соляной кислоты, доводят до метки водой, тщательно перемешивают. Хранят при комнатной температуре.

7.3 Приготовление растворов уксусной кислоты

7.3.1 Массовая доля 1% (1%-й раствор)

В мерную колбу вместимостью 1000 см3, содержащую 500 - 600 см3 дистиллированной воды, помещают 10 см3 ледяной уксусной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

7.3.2 Массовая доля 0,005% (0,005%-й раствор)

В мерную колбу вместимостью 1000 см3, содержащую 500 - 600 см3 дистиллированной воды, помещают 5 см3 1%-го раствора уксусной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают. Хранят при комнатной температуре.

7.4 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 250 см3 ацетонитрила, 100 см3 метанола, 650 см3 деионизованной воды, вносят 1 см3 ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

7.5 Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.4) при скорости подачи растворителя 1 см3/мин до установления стабильной базовой линии.

7.6 Приготовление смеси растворителей для экстракции

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 800 см3 ацетонитрила, 200 см3 деионизованной воды, 5 см3 ледяной уксусной кислоты, перемешивают.

7.7. Подготовка концентрирующих патронов Sep - Pak^{®} Vac 35cc C18, Oazis^{®} HLB, Oazis^{®} MAX и Oazis^{®} MCX

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума.

Концентрирующие патроны промывают с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, со скоростью прохождения растворителя через патрон 2 - 3 капли в секунду: Sep - Pak^{®} Vac 35cc (10 g) C18 - последовательно ацетонитрилом, водой, смесью для экстракции, приготовленной по п. 7.6, порциями по 40 см3; Oazis^{®} HLB 3cc (60 mg) - 2 см3 метанола, затем 5 см3 деионизованной воды, Oazis^{®} MAX 6cc (500 mg) - 5 см3 метанола, затем 10 см3 деионизованной воды; Oazis^{®} MCX 6cc (500 mg) - 5 см3 метанола, затем 10 см3 0,005%-го раствора уксусной кислоты. Патроны готовят непосредственно перед использованием.

7.8 Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

7.8.1. Исходные растворы спиротетрамата и спиротетрамата-енола для градуировки (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,0100 г спиротетрамата или спиротетрамата-енола, добавляют 50 - 70 см3 ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Растворы хранятся в холодильнике в течение месяца.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

7.8.2. Растворы N 1 спиротетрамата и спиротетрамата-енола для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10 см3 исходного раствора спиротетрамата или спиротетрамата-енола с концентрацией 100 мкг/см3 (п. 7.8.1), разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Растворы хранятся в холодильнике в течение 3 недель.

Растворы с концентрацией 10 мкг/см3 используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения веществ методом "внесено-найдено", а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.8.3. Рабочие растворы N 2 - 5 спиротетрамата и спиротетрамата-енола для градуировки (концентрация каждого вещества по 0,1 - 1,0 мкг/см3). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см3 градуировочных растворов N 1 с концентрацией спиротетрамата и спиротетрамата-енола 10 мкг/см3 (п. 7.8.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией спиротетрамата и спиротетрамата-енола по 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см3 соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике в течение 3 недель.

7.9 Установление градуировочных характеристик

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика (мкВ·с) от концентрации спиротетрамата и спиротетрамата-енола в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ: цитрусовые культуры: 4427-82 "Апельсины. Технические условия", 4428-82 "Мандарины. Технические условия", 4429-82 "Лимоны. Технические условия"; плодовые семечковые культуры: 16270-70 "Яблоки свежие ранних сортов созревания. Технические условия", 21122-75 "Яблоки свежие поздних сортов созревания. Технические условия", 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки"; 21713-76 "Груши свежие ранних сортов созревания. Технические условия", 21714-76 "Груши свежие поздних сортов созревания. Технические условия"; плодовые косточковые культуры: 21832-76 "Абрикосы свежие. Технические условия", 21833-76 "Персики свежие. Технические условия"; овощные культуры: 1725-85 "Томаты свежие. Технические условия", ГОСТ Р 51810-2001 "Томаты свежие, реализуемые в розничной торговой сети. Технические условия", ГОСТ 1726-85 "Огурцы свежие. "Технические условия", 13908-68 "Перец сладкий свежий. Технические условия"; хмель: 21946-76 "Хмель-сырец. Технические условия"; виноград: 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия", 28472-90 "Виноград свежий ручной уборки для консервирования. Требования при заготовках и поставках"; 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб"; "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (от 21.08.1979 N 2051-79).

Отобранные пробы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 5 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом образцы плодов семечковых, косточковых культур, мякоти цитрусовых культур, томатов, перца, огурцов, винограда измельчают с помощью гомогенизатора.

9. Выполнение определения

9.1. Плоды косточковых, семечковых культур, томатов, огурцов, перца, мякоть цитрусовых культур, ягоды винограда, цитрусовый и виноградный сок

9.1.1 Экстракция

Образец измельченных с помощью гомогенизатора плодов косточковых, семечковых культур, томатов, огурцов, перца, мякоти цитрусовых культур, ягод винограда, а также цитрусового или виноградного сока массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см3, добавляют 40 см3 смеси для экстракции, приготовленной по п. 7.6, интенсивно встряхивают (или гомогенизируют) в течение 1 мин, затем помещают на аппарат для встряхивания на 30 мин.

Пробам дают отстояться. Далее проводят очистку на концентрирующем патроне Sep - Pak^{®} Vac 35cc C18 по п. 9.1.2.

9.1.2 Очистка экстракта на концентрирующем патроне Sep - Pak^{®} Vac 35cc C18

Пробу, полученную по п. 9.1.1, фильтруют с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через концентрирующий патрон Sep - Pak^{®} Vac 35cc (10 g) C18, подготовленный по п. 7.7, со скоростью прохождения раствора 3 - 4 капли в секунду (3 см3/мин), пропуская раствор до верхнего края сорбента. После нанесения пробы осадок в колбе дополнительно промывают 2 порциями по 25 см3 смеси для экстракции, подготовленной по п. 7.6, которые также фильтруют через патрон. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр с пришлифованной пробкой вместимостью 250 см3, перемешивают, фиксируют точный объем раствора, 1/2 его часть, эквивалентную 5 г пробы, переносят в колбу для упаривания на 250 см3. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C досуха (отсутствие запаха уксусной кислоты). Остаток в колбе растворяют в 5 см3 смеси ацетонитрил-вода (1:9, по объему) и очищают на концентрирующем патроне Oazis HLB по п. 9.1.3

9.1.3 Очистка экстракта на концентрирующем патроне Oazis HLB

При анализе проб плодов огурца, мякоти цитрусовых культур, ягод винограда, цитрусового и виноградного сока остаток в колбе растворяют в 5 см3 смеси ацетонитрил-вода (2:8, по объему) и очищают на концентрирующем патроне Oazis MAX по п. 9.1.4.

При анализе пробы перца и хмеля остаток в колбе растворяют в 5 см3 смеси ацетонитрил-вода (2:8, по объему) и очищают последовательно на концентрирующих патронах Oazis MCX по п. 9.1.5, затем Oazis MAX по пп. 9.1.4, 9.2.3.2 или 9.2.4.1.

9.1.4 Очистка экстракта на концентрирующем патроне Oazis MAX

Пробу, полученную по п. 9.1.3 или 9.1.5, вносят с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон Oazis MAX 6cc (500 mg), подготовленный по п. 7.7, со скоростью пропускания раствора 2 - 3 капли в секунду. Патрон промывают 5 см3 смеси ацетонитрил-вода (2:8, по объему), элюат отбрасывают. Вещества элюируют с патрона последовательно 10 см3 смеси ацетонитрил-вода (1:1, по объему), затем 10 см3 смеси ацетонитрил-1%-я уксусная кислота (1:1, по объему), собирая элюат в круглодоннную колбу для упаривания вместимостью 100 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха.

При анализе проб плодов огурцов, мякоти цитрусовых культур, ягод винограда, цитрусового и виноградного сока остаток растворяют в 2 см3 подвижной фазы, перца - 4 см3 подвижной фазы, приготовленной по п. 7.4 (помещая на ультразвуковую баню на 20 - 30 с), и анализируют содержание спиротетрамата и спиротетрамата-енола по п. 9.3.

9.1.5 Очистка экстракта на концентрирующем патроне Oazis MCX

Пробу перца или хмеля, полученную по п. 9.1.3, вносят с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон Oazis MCX 6cc (500 mg), подготовленный по п. 7.7, со скоростью пропускания раствора 2 - 3 капли в секунду. Патрон промывают 5 см3 смеси ацетонитрил-вода (2:8, по объему), элюат отбрасывают. Вещества элюируют с патрона 10 см3 смеси ацетонитрил-вода (1:1, по объему), собирая элюат в круглодоннную колбу для упаривания вместимостью 50 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха.

Остаток в колбе растворяют в 5 см3 смеси ацетонитрил-вода (2:8, по объему) и дополнительно очищают на концентрирующем патроне Oazis MAX по пп. 9.1.4, 9.2.3.2 или 9.2.4.1.

9.2 Хмель (шишки хмеля сухие)

9.2.1 Экстракция

Образец измельченных шишек хмеля массой 5 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см3, добавляют 80 см3 смеси для экстракции, приготовленной по п. 7.6, интенсивно встряхивают (или гомогенизируют) в течение 1 мин, затем помещают на аппарат для встряхивания на 30 мин.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр "красная лента". Растительный остаток на фильтре промывают 100 см3 смеси для экстракции (дважды по 50 см3), раствор также фильтруют на воронке Бюхнера. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр с пришлифованной пробкой вместимостью 250 см3, колбу Бунзена обмывают 20 см3 смеси для экстракции, которые также переносят в мерный цилиндр, перемешивают, фиксируют объем раствора, 1/5 его часть, эквивалентную 1 г пробы, переносят в мерный цилиндр на 100 см3 с пришлифованной пробкой, доводят объем раствора до 100 см3 смесью для экстракции, приготовленной по п. 7.6. Далее проводят очистку на концентрирующем патроне Sep - Pak^{®} Vac 35cc C18 по п. 9.2.2.

9.2.2 Очистка экстракта на концентрирующем патроне Sep - Pak^{®} Vac 35cc C18

Пробу, полученную по п. 9.2.1, фильтруют с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом через концентрирующий патрон Sep - Pak^{®} Vac 35cc (10 g) C18, подготовленный по п. 7.7, со скоростью прохождения раствора 3 - 4 капли в секунду (3 см3/мин), пропуская раствор до верхнего края сорбента. После нанесения пробы через патрон дополнительно фильтруют 20 см3 смеси для экстракции, подготовленной по п. 7.6. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр с пришлифованной пробкой вместимостью 250 см3, перемешивают, фиксируют точный объем раствора, делят его на две равные части (эквивалентные 0,5 г пробы), одна из которых используется для определения спиротетрамата по п. 9.2.3, вторая - спиротетрамата-енола по п. 9.2.4.

9.2.3 Определение спиротетрамата

9.2.3.1. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей. Половину экстракта хмеля, полученного по п. 9.2.2, находящегося в цилиндре, (эквивалентную 0,5 г пробы) переносят в колбу для упаривания на 250 см3. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до водного остатка, переносят его в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 100 см3 деионизованной воды, предварительно обмыв ее колбу, в которой находилась проба, 25 см3 насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают. Контролируют pH раствора по индикаторной бумаге, при необходимости доводят pH до 4 с помощью 1 М раствора соляной кислоты. В делительную воронку вносят 40 см3 дихлорметана, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия толщиной 1,5 см, помещенного на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 см3. Процедуру экстракции водной фазы дихлорметаном повторяют еще дважды порциями растворителя по 30 см3. Объединенный дихлорметановый экстракт, пропущенный через безводный сульфат натрия, упаривают при температура 35 °C на ротационном вакуумном растворителе досуха. Остаток в колбе растворяют в 5 см3 смеси ацетонитрил-вода (1:9, по объему) подвергают последовательной очистке на концентрирующих патронах Oazis HLB по п. 9.1.3, Oazis MCX по п. 9.1.5, затем Oazis MAX по п. 9.2.3.2.

9.2.3.2. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Oazis MAX. Пробу хмеля, полученную по п. 9.1.5, вносят с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон Oazis MAX 6cc (500 mg), подготовленный по п. 7.7, со скоростью пропускания раствора 2 - 3 капли в секунду. Патрон промывают 5 см3 смеси ацетонитрил-вода (2:8, по объему), элюат отбрасывают. Спиротетрамат элюируют с патрона 10 см3 смеси ацетонитрил-вода (1:1, по объему), собирая элюат в круглодоннную колбу для упаривания вместимостью 50 см3. Растворитель в колбе упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха.

Остаток растворяют в 2 см3 подвижной фазы, приготовленной по п. 7.4 (помещая на ультразвуковую баню на 20 - 30 с) и анализируют содержание спиротетрамата по п. 9.3.

9.2.4 Определение спиротетрамата-енола

9.2.4.1. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Oazis MAX. Пробу хмеля, полученную по п. 9.1.5, вносят с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон Oazis MAX 6cc (500 mg), подготовленный по п. 7.7, со скоростью пропускания раствора 2 - 3 капли в секунду. Патрон промывают 5 см3 смеси ацетонитрил-вода (2:8, по объему), затем 10 см3 смеси ацетонитрил-вода (1:1, по объему), элюат отбрасывают. Спиротетрамат-енол элюируют с патрона 10 см3 смеси ацетонитрил-1%-я уксусная кислота (1:1, по объему), собирая элюат в круглодоннную колбу для упаривания вместимостью 50 см3. Растворитель в колбе упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха.

Остаток растворяют в 2 см3 подвижной фазы, приготовленной по п. 7.4 (помещая на ультразвуковую баню на 20 - 30 с) и анализируют содержание спиротетрамата-енола по п. 9.3.

9.3 Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф "Breeze" с ультрафиолетовым детектором (фирма Waters, США).

Хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Zorbax SB C8, зернением 5 мкм.

Объем вводимой пробы: 20 мм3.

Линейный диапазон детектирования: 2 - 20 нг.

Подвижная фаза: ацетонитрил-метанол-вода-ортофосфорная кислота (25:10:65:0,1, по объему).

    Ориентировочное время выхода: спиротетрамат-енол: 7,95  -  8,185 мин;
                                  спиротетрамат:     29,958 - 31,210 мин.

Для достоверности идентификации спиротетрамата и спиротетрамата-енола их детектирование возможно при длине волны 230 нм, поскольку в данной области интенсивность поглощения веществ ~ в 2 раза ниже, чем при 220 нм. Соблюдение соотношения площадей пиков при этих волнах подтверждает наличие остаточных количеств действующего вещества и его метаболита в пробе.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4 (не более чем в 50 раз).

10. Обработка результатов анализа

Содержание спиротетрамата в пробах плодов косточковых, семечковых культур, томатов, огурцов, перца, мякоти цитрусовых культур, ягод винограда, цитрусового и виноградного сока, хмеля с учетом его основного метаболита спиротетрамата-енола в эквиваленте действующего вещества (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

X = \frac{(\text{А } + \text{Б } \cdot K)V \cdot C}{m} , где

А, Б — концентрации спиротетрамата и спиротетрамата-енола, соответственно, найденные по градуировочным графикам в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см3;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;

m — масса анализируемого образца, г;

C — коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, C = 2 — плоды косточковых, семечковых культур, томатов, огурцов, перца, мякоть цитрусовых культур, ягоды винограда, цитрусовый и виноградный соки, C = 20 — хмель;

K — коэффициент пересчета содержания метаболита спиротетрамата-енола на эквивалент спиротетрамата по соотношению молекулярных масс (равен 1,24).

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)

X_{1} , X_{2} — результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8\sigma_{r} .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание спиротетрамата и спиротетрамата-енола в пробах плодов косточковых, семечковых культур, томатов, огурцов, мякоти цитрусовых культур, ягод винограда, цитрусового и виноградного сока — менее 0,04 мг/кг, перца — менее 0,08 мг/кг; хмеля — менее 0,4 мг/кг» <*>.

<*> — 0,04; 0,08 и 0,4 мг/кг — пределы обнаружения в пробах плодов косточковых, семечковых культур, томатов, огурцов, мякоти цитрусовых культур, ягод винограда, цитрусового и виноградного сока; перца и хмеля соответственно.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание спиротетрамата и спиротетрамата-енола в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см3.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X — концентрация спиротетрамата и спиротетрамата-енола в пробе при контрольном измерении, мкг/см3;

C — известная концентрация градуировочного раствора спиротетрамата и спиротетрамата-енола, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;

2,26 — погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 2,26%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов спиротетрамата и спиротетрамата-енола, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.9.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

C_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X'} , где

\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X'}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры K_{\text{к}} рассчитывают по формуле:

K_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - C_{\text{д}} , где

\overline{X}\prime , \overline{X} , C_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}}

|K_{\text{к}}| \leq K , (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

X_{1} , X_{2} — результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

14. Разработчики