ИК 10-04-06-140-87. Инструкция санитарно-микробиологического контроля пивоваренного и безалкогольного производства

(утв. Госагропромом СССР 04.11.1987)

4 сентября 1987 г. № 123-12/1005-15

ИНСТРУКЦИЯ САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПИВОВАРЕННОГО И БЕЗАЛКОГОЛЬНОГО ПРОИЗВОДСТВА

ИК 10-04-06-140-87

с 1 июня 1988 года

29 апреля 1980 года

Разработано НПО напитков и минеральных вод Госагропрома СССР.

Настоящая Инструкция устанавливает правила и методы микробиологического контроля и распространяется на предприятия пивоваренной и безалкогольной промышленности.

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Микробиологический контроль на предприятиях пивоваренной и безалкогольной промышленности заключается в оценке санитарного состояния предприятия на основании определения санитарно-показательных микроорганизмов и микроорганизмов — вредителей производства в сырье, полуфабрикатах, готовой продукции и смывных водах с оборудования.

По результатам микробиологических анализов судят о санитарно-гигиеническом благополучии предприятия, соблюдении технологических режимов производства, причинах и источниках микробиальной порчи продукта.

При организации микробиологического контроля следует руководствоваться настоящей Инструкцией, а также технологическими инструкциями по производству пива, напитков, кваса и Санитарными правилами для предприятий пивоваренной и безалкогольной промышленности.

Работы по микробиологическому контролю выполняет микробиолог предприятия. Результаты анализов регистрируют в рабочих журналах.

Микробиологическую оценку качества готовой продукции, мойки и дезинфекции технологического оборудования следует включать в оценку качества труда цехового персонала при выплате премиальных доплат.

2. ТРЕБОВАНИЯ К ПОМЕЩЕНИЮ ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ РАБОТ

Микробиологические работы проводят в специальном изолированном помещении — боксе площадью 3 — 5 кв. м. Бокс состоит из рабочего помещения и предбоксника, что исключает резкую циркуляцию воздуха и занесение микроорганизмов извне. Дверь в бокс желательно иметь пенального типа.

Оборудование бокса состоит из стола, с легко моющейся поверхностью, стула, спиртовки (или газовой горелки) и бактерицидной лампы, укрепленной в специальном штативе или смонтированной на потолке или стене бокса.

Помещение бокса периодически моют и дезинфицируют. Перед работой бокс облучают с помощью бактерицидной лампы в течение 30 — 60 минут. Запрещается находиться в боксе, когда включена бактерицидная лампа. После ее выключения работать в боксе можно лишь спустя 15 — 20 минут. Выключатель бактерицидной лампы должен находиться в предбокснике. Непосредственно перед началом работ поверхность стола и руки микробиолог протирает спиртом.

3. ТЕХНИКА ОТБОРА ПРОБ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

При одновременном отборе проб для микробиологического и химического анализов отбор проб начинают с предназначенных для микробиологического анализа.

Пробы отбирают с соблюдением условий, исключающих вторичное обсеменение посторонними микроорганизмами.

Жидкости и сыпучие вещества отбирают в стерильную стеклянную посуду. Посуду и инструменты, используемые при отборе пробы, стерилизуют одним из способов, изложенных в Приложении 5 п. 13. Инструменты для вскрытия тары, упаковки или отбора проб допускается обрабатывать этиловым спиртом с последующим фламбированием.

Пробу сыпучих материалов отбирают металлической или фарфоровой ложкой, шпателем, пробоотборником из разных мест и с разной глубины в одну или раздельную посуду в зависимости от цели исследования. Пробку и горлышко посуды обжигают в пламени.

Пробу жидких и пастообразных продуктов из большой емкости отбирают с разной глубины. Если отбирают только одну пробу, то содержимое тщательно перемешивают пипеткой или металлическим пробоотборником. Пробу переносят в посуду, горлышко которой обжигают в пламени.

Пробы жидкости из емкостей, оснащенных краном, отбирают следующим образом:

• кран промывают, вытирают ватным тампоном, пропитанным этиловым спиртом, и обжигают в пламени факела или спиртовки;
• сливают часть жидкости (от 1 до 10 куб. дм в зависимости от вместимости резервуара и диаметра крана);
• пробу в количестве, необходимом для анализа, отбирают в стерильную посуду, горлышко которой предварительно обжигают в пламени.

Отобранные пробы переносят в лабораторию и приступают к выполнению анализа. Если нет возможности сразу приступить к анализу, пробы помещают в холодильник при температуре от 0° до 5 °C не более чем на 6 часов.

Масса (объем) пробы должна быть достаточной для выполнения комплекса определяемых микробиологических показателей.

Отобранная проба предназначена для приготовления разведения или непосредственного высева в питательные среды.

На анализ отбирают:

• не менее 1 шт. — от продуктов в потребительской упаковке;
• до 500 куб. см (г) — жидких, пастообразных, сыпучих продуктов.

Количество вскрываемых единиц расфасовки для отбора проб зависит от размеров партии и определяется по действующим ГОСТ, ОСТ, ТУ на соответствующие продукты.

Партия — определенный набор продуктов одного вида, изготовленных в один день, на одном предприятии, из одного вида сырья, согласно одной технологии, в одной упаковке, сохраняемых и транспортируемых в одних и тех же условиях и предназначенных для однократной передачи или приемки.

Единица продукции — отдельный экземпляр штучной продукции или определенное в установленном порядке количество нештучной продукции.

Проба — определенное количество единиц продукции, отобранное для контроля.

4. МЕТОДЫ ВЫПОЛНЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ АНАЛИЗОВ

Микробиологические анализы отобранных проб проводят с соблюдением правил асептики.

Микробиологические анализы выполняют следующими методами:

• высев исследуемого образца в питательные среды поверхностным или глубинным способом;
• использование мембранной фильтрации с последующим переносом фильтров на поверхность питательной среды;
• микроскопия.

Описание этих методов дано в Приложении 4 настоящей Инструкции.

В тексте Инструкции приняты следующие сокращения терминов:

БГКП — бактерии группы кишечных палочек;

ОМЧ — общее число микроорганизмов (общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов).

5. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПИВОВАРЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА

В пивоваренном производстве микробиологическому контролю подлежат:

• ячмень, солод, несоложеные материалы;
• вода;
• дрожжи пивные;
• сусло;
• пиво готовое;
• бутылки;
• укупорочные материалы;
• технологическое оборудование, коммуникации, автоцистерны (эффективность санитарной обработки).

Микробиологический контроль осуществляется путем отбора проб и определения показателей по участкам производства согласно схеме (Приложение 1).

5.1 Ячмень, солод, несоложеные материалы.

Пиво должно вырабатываться из доброкачественного сырья, отвечающего требованиям ГОСТов, ОСТов и ТУ.

Кроме определения качества ячменя, солода и других зернопродуктов по соответствующим ГОСТам, ОСТам и ТУ, осуществляемого во время приемки сырья, проводят их внешний осмотр для оценки санитарного состояния в момент поступления. Использование сырья, пораженного гнилью и плесенью, не допускается. Визуальную оценку качества производит технолог, зав. лабораторией, мастер цеха или лицо, назначенное приказом директора, и записывает в журнал оценки качества продукции.

5.2. Вода.

При производстве пива используют воду, отвечающую требованиям ГОСТ 2874-82 «Вода питьевая». Пробу воды для санитарно-микробиологического анализа отбирают в производственных помещениях. Отбор проб воды и анализы проводят по ГОСТ 18963-73. Контроль воды проводят не реже 1 раза в месяц.

Бактериологические показатели качества воды должны соответствовать требованиям ГОСТ 2874-82 «Вода питьевая».

5.3. Дрожжи пивные.

5.3.1. Пивные дрожжи из аппарата чистых культур или из последней бутылки перед передачей в цех (при ручном разведении) анализируют методом микроскопирования в капле метиленовой сини с добавлением 10% раствора NaOH или KOH. Определяют процент нежизнеспособных дрожжевых клеток (Приложение 4 п. 1.1.2). Присутствие бактерий и диких дрожжей не допускается.

Дикими называются виды дрожжей, не характерные для данного производства и попадающие в него случайно.

Берут 1 куб. см дрожжей из аппарата чистых культур и разводят стерильной водой. Серию разведений делают по методике, описанной в Приложении 4 п. 1.2.1.

Поверхностным способом высевают по 0,1 куб. см суспензии из разведений -5 (ориентировочно из разведения 10 ) одновременно на три среды: с кристаллическим фиолетовым, с лизином и для контроля — на сусловый агар.

Посевы инкубируют 48 ч при (30 +/- 1) °C. Результаты учитывают следующим образом: на сусловом агаре растут как пивные, так и все виды диких дрожжей; на среде с кристаллическим фиолетовым растут только дикие дрожжи рода Saccharomyces; на среде с лизином только дикие дрожжи р. р. Candida, Torulopsis, Brettanomyces и др., не относящиеся к роду Saccharomyces. При инкубировании свыше 48 ч на селективных средах начинают расти и пивные дрожжи.

5.3.2. Отбор проб семенных дрожжей производят из каждой ванночки или монжю. Пробы отбирают с разных уровней чистой стеклянной трубкой или пипеткой с расширенным концом и помещают в небольшие колбочки или пробирки.

В семенных дрожжах микроскопированием определяют упитанность по гликогену (Приложение 4 п. 1.1.3), процент нежизнеспособных дрожжевых клеток и содержание бактерий.

Обращают внимание на морфологию дрожжевых клеток. Наличие сильно удлиненных или заостренных клеток свидетельствует о дегенерации культуры или о заражении дикими дрожжами. В этом случае делают посев на селективные среды так же, как и для дрожжей из аппаратов чистых культур, но с добавлением в питательную среду стрептомицина — 80 мг/куб. дм или левомицетина — 50 мг/куб. дм, или другого антибиотика для подавления роста бактерий.

В семенных дрожжах количество бактерий не должно быть больше 1% от общего числа дрожжевых клеток; количество нежизнеспособных дрожжевых клеток должно быть в пределах 5%; в 70 — 75% дрожжей должен содержаться гликоген.

Дрожжи, не отвечающие данным требованиям, необходимо подвергать антисептической обработке, один из способов которой дан в Приложении 6.

5.4. Сусло.

5.4.1 Сусло (после теплообменника).

В охлажденном сусле определяют общее число микроорганизмов высевом 1 куб. см пробы глубинным способом на питательный агар или мясо-пептонный агар. Методика посева описана в Приложении 4 п. 1.2.2. После инкубации при температуре (30 +/- 1) °C в течение 48 ч подсчитывают число выросших колоний. Общее число микроорганизмов в 1 куб. см сусла не должно быть больше 300.

Посевом 1 куб. см пробы сусла глубинным способом на сусловый агар с мелом выявляют кислотообразующие бактерии. После инкубации при (30 +/- 1) °C в течение 72 ч кислотообразующие бактерии дают вокруг выросших колоний зоны растворения мела. В охлажденном сусле кислотообразующие бактерии должны отсутствовать.

5.4.2. Сусло из стерилизатора после его охлаждения при разведении чистой культуры дрожжей высевают в объеме 1 куб. см глубинным способом на питательный агар или мясо-пептонный агар и сусловый агар. После инкубации в течение 48 ч рост любых форм микроорганизмов должен отсутствовать.

5.5. Готовое пиво.

Отбор проб осуществляют от каждого сорта в соответствии с ГОСТ 12786-80.

Непосредственно перед вскрытием бутылок с пивом их перемешивают 10-кратным переворачиванием с донышка на пробку или круговым движением. После вскрытия горлышко стеклянных бутылок обжигают и отбирают пиво в объеме, необходимом для анализа. Анализ производят не менее чем из двух бутылок.

Определяют общее число микроорганизмов на питательном агаре или мясо-пептонном агаре, наличие бактерий группы кишечных палочек и стойкость пива в товарной упаковке при (20 +/- 2) °C.

Общее число микроорганизмов в 1 куб. см не должно превышать 500 клеток.

Методика определения бактерий группы кишечных палочек изложена в Приложении 4 п. 1.2.4.

Для специальных сортов бутылочного пива с массовой долей сухих веществ в начальном сусле 12% и более бактерии группы кишечных палочек не допускаются в 10 куб. см; для массовых сортов бутылочного пива с массовой долей сухих веществ в начальном сусле 10 — 11% бактерии группы кишечных палочек не допускаются в 3 куб. см; в пиве розливном бактерии группы кишечных палочек не допускаются в 1 куб. см.

Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, не допускаются в 25 куб. см готового пива. Анализ на патогенные микроорганизмы проводится учреждениями санитарно-эпидемиологической службы по методам, утвержденным МЗ СССР.

5.6. Исправимый брак пива.

На анализ берут исправимый брак пива после тепловой обработки и охлаждения до 2 — 5 °C. Содержание микроорганизмов в 1 куб. см не должно превышать 500 клеток.

5.7. Бутылки.

От каждой моечной машины отбирают 5 — 10 вымытых бутылок. Остаточную воду из всех бутылок сливают в одну из них и закрывают эту бутылку ватной пробкой. В лаборатории делают высев 1 куб. см остаточной воды на питательный агар или мясо-пептонный агар глубинным способом. Посевы инкубируют при (30 +/- 1) °C в течение 48 ч. Общее число микроорганизмов в 1 куб. см должно быть не более 100 в пересчете на одну бутылку.

Качество мойки бутылок можно определять другим способом. В одну из бутылок наливают стерильную водопроводную воду (10% от объема бутылки) и последовательно ополаскивают ею внутреннюю поверхность 5 — 10 бутылок. Высев смывной воды производят вышеуказанным способом. При вычислении общего числа микроорганизмов в 1 куб. см смывной воды учитывают объем воды для ополаскивания и число бутылок.

5.8. Укупорочный материал.

Кроненпробки отбирают с рабочего места стерильным пинцетом в количестве 10 штук в стерильную широкогорлую колбу, заливают 100 куб. см стерильной водой и встряхивают в течение 5 мин. Определение общего количества микроорганизмов производят высевом 1 куб. см смыва глубинным способом на мясо-пептонный агар или на питательный агар. Число микроорганизмов в пересчете на одну пробку не должно быть более 100.

5.9. Воздух.

Для определения количества микроорганизмов в воздухе отделения чистых культур используют седиментационный метод (метод оседания). Чашки Петри с мясо-пептонным или питательным агаром и сусловым агаром переносят в помещение, где исследуют воздух. Крышки сдвигают так, чтобы вся поверхность агаровой пластинки была открыта полностью. Чашки оставляют открытыми в течение 5, 10 или 15 мин., после чего крышку закрывают и чашки помещают в термостат при (30 +/- 1) °C на 24 — 48 ч.

Определяют количество микроорганизмов в 1 куб. м воздуха по формуле, предложенной Омелянским:

                           a х 100 х 5

X = ----------- х 100, S х T

где:

a — число выросших колоний (среднее значение);

S — площадь чашки Петри, кв. см;

T — время экспозиции, мин.;

100 — пересчет площади чашки на 100 кв. см;

100 — пересчет на 1 куб. м воздуха;

5 — экспозиция чашки по Омелянскому (за 5 мин. на чашку Петри площадью 100 кв. см оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха).

Воздух считается чистым, если в нем содержится не более 500 микроорганизмов в 1 куб. м, кроме того, в воздухе отделения чистых культур не должно быть посторонних дрожжей.

Для контроля воздуха, используемого для аэрации чистой культуры, применяют те же питательные среды. Чашки Петри с застывшей питательной средой в открытом виде подставляют на 1 мин. под струю воздуха, закрывают крышкой и инкубируют при (30 +/- 1) °C. Воздух, вдуваемый в аппарат чистых культур, не должен содержать посторонних дрожжевых клеток, молочнокислых бактерий, спор плесеней.

Аналогично проверяют воздух, используемый на технологические нужды в фильтрационном отделении, цехе розлива. На одной чашке Петри не должно быть более 50 клеток микроорганизмов.

6. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОИЗВОДСТВА БЕЗАЛКОГОЛЬНЫХ НАПИТКОВ И КВАСА

В производстве безалкогольных напитков микробиологическому контролю подлежат следующие объекты:

• питьевая вода, сахар-песок, жидкий сахар, плодово-ягодные соки, концентраты напитков и квасного сусла;
• сахарный сироп, купажные сиропы;
• готовые напитки, хлебный квас, товарные сиропы;
• бутылки, укупорочный материал;
• технологическое оборудование, коммуникации, автоцистерны.

Микробиологический контроль производства безалкогольных напитков осуществляется путем отбора проб и определения показателей по участкам производства согласно схеме (Приложение 2).

При определении содержания микроорганизмов в сырье, полуфабрикатах и готовом продукте используют два метода посева:

• метод посева исследуемого материала непосредственно в питательную среду: поверхностно (0,1 куб. см) или глубинно (1,0 куб. см);
• метод мембранных фильтров, позволяющий концентрировать на мембране микроорганизмы из большого объема исследуемого материала, с последующим переносом фильтра на поверхность питательной среды, для выращивания микроорганизмов.

Метод мембранных фильтров используют при анализе образцов с низкой обсемененностью (питьевая вода, концентраты напитков, готовые напитки с консервантом и т.д.).

При определении содержания микроорганизмов в образцах с повышенной обсемененностью (спиртованные соки, купажные сиропы, напитки без консервантов), а также в случаях отсутствия мембран необходимо использовать метод непосредственного посева на питательную среду.

При записи результатов анализов необходимо указывать метод посева. Описание методов дано в Приложении.

6.1. Питьевая вода. Качество питьевой воды, используемой на предприятиях безалкогольной промышленности, должно соответствовать требованиям ГОСТ 2874-82 «Вода питьевая». Воду проверяют по следующим показателям:

• общее число микроорганизмов;
• число бактерий группы кишечных палочек (коли-индекс).

В 1 куб. см воды допускается наличие не более 100 клеток микроорганизмов, а коли-индекс не должен превышать 3 в 1 куб. дм воды.

6.2. Сахар-песок. В рафинированном сахаре-песке определяют общее число микроорганизмов. Для этого сахар-песок в количестве 1 г растворяют в 5 куб. см стерильной питьевой воды. Для посева берут 1,0 куб. см приготовленного раствора и высевают глубинным способом на питательный агар или мясо-пептонный агар, инкубируют (30 +/- 1) °C в течение 48 ч.

При расчете числа микроорганизмов учитывают разведение, высеваемый объем и делают пересчет на 1 г сахара-песка. Допускается не более 1000 клеток микроорганизмов в 1 г песка.

6.3 Жидкий сахар проверяют по следующим показателям:

• общее число микроорганизмов — высевом 1,0 куб. см глубинным способом на питательный агар или мясо-пептонный агар;
• дрожжи — высевом 1,0 куб. см глубинным способом на сусловой агар;
• лейконосток — высевом 1 куб. см (без разведения) в колбу на 100 куб. см с 5 куб. см дрожжевой воды в 10% сахарозы.

Допускаются в жидком сахаре следующие количества клеток микроорганизмов, в 1 куб. см;

• общее число микроорганизмов — не более 20;
• дрожжи — отсутствуют.

Лейконосток в 1 куб. см жидкого сахара — отсутствует.

Опознается лейконосток по ослизнению дрожжевой воды с сахарозой.

6.4. Сахарный сироп. Показатели микробиологической обсемененности сиропа и ход анализа аналогичны жидкому сахару.

Допускаются следующие количества клеток микроорганизмов в 1 куб. см сахарного сиропа:

число микроорганизмов — не более 20;

дрожжи — отсутствуют;

лейконосток в 1 куб. см сиропа — отсутствует.

6.5. Натуральные плодово-ягодные соки (спиртованные и концентрированные).

Спиртованные соки часто бывают сильно обсеменены дрожжами, поэтому определение их проводят высевом 0,1 куб. см поверхностным способом на сусловой агар.

Допускается в 1 куб. см спиртованного сока не более 300 клеток дрожжей.

Соки с большей обсемененностью следует использовать для приготовления купажных сиропов горячим способом.

В соках концентрированных по ГОСТ 18192-72 анализ на возбудителя порчи (дрожжи) проводят при необходимости подтверждения микробиальной порчи по ГОСТ 10444.0-75 (брожение, бомбаж). В этом случае сок в количестве 0,1 куб. см высевают поверхностным способом на сусловой агар.

6.6. Концентрат плодово-ягодных напитков. Содержание дрожжей в концентратах напитков определяют высевом на сусловой агар 3 куб. см методом мембранных фильтров. Концентраты на анализ набирают пипеткой с расширенным концом (слегка отломанным).

Концентрат напитка в количестве 3 куб. см разводят стерильной питьевой водой в 5 раз и фильтруют. В случае затрудненной фильтрации, вызванной плохим осветлением сока, пробу фильтруют через предварительный фильтр № 10 МФА-МА для удаления крупных частиц. Для этого фильтр № 10 помещают в фильтровальный прибор над фильтром № 6. По окончании фильтрования оба фильтра переносят на сусловой агар. При подсчете результатов анализа учитывают рост дрожжей на обоих фильтрах, а также объем взятой пробы и ее разведение.

В концентратах напитков (содержание сухих веществ 70%) дрожжи в 3 куб. см отсутствуют.

6.7. Концентрат квасного сусла. Содержание дрожжей определяют высевом 0,1 куб. см поверхностным способом на сусловой агар. Допускается в 1 куб. см содержание дрожжей не более 50 клеток.

6.8 Купажные сиропы проверяют на наличие дрожжей.

Сиропы без консервантов высевают в количестве 0,1 куб. см поверхностным способом на сусловой агар. Допускается в сиропе без консерванта не более 300 клеток в 1 куб. см.

Сиропы с консервантами проверяют методом мембранных фильтров в следующих количествах:

• сиропы на настоях и ароматизаторах — 1,0 куб. см;
• сиропы на плодово-ягодных соках — 0,5 куб. см.

Фильтр после окончания фильтрации сиропа с консервантом промывают 2 — 3 куб. см стерильной питьевой воды и переносят на чашку Петри с сусловым агаром.

При отсутствии мембран высев проводят поверхностным способом в количестве 0,1 куб. см на сусловой агар.

Допускается наличие дрожжей в купажных сиропах с консервантом в 1 куб. см:

• на настоях и ароматизаторах — единичные клетки (не более 5);
• на плодово-ягодных соках — не более 30.

6.9. Готовые напитки проверяют на содержание дрожжей и бактерий группы кишечных палочек (коли-индекс).

Для определения дрожжей напитки без консерванта высевают в количестве 0,1 куб. см поверхностным способом на сусловой агар.

Допускается наличие дрожжей в 1 куб. см напитка без консерванта не более 100 клеток.

Напитки с консервантами проверяют методом мембранных фильтров или высевом поверхностным способом. Ход анализа аналогичен купажным сиропам.

Допускается в напитках с консервантом следующие количества дрожжей, в 1 куб. см:

• на настоях и ароматизаторах — единичные клетки дрожжей, не более 10;
• на плодово-ягодных соках — не более 50 клеток.

Напитки на хлебном сырье, пастеризованные в бутылках, проверяют на содержание дрожжей методом мембранных фильтров (высеваемый объем — 40 куб. см).

В высеваемом объеме дрожжи отсутствуют.

Определение бактерий группы кишечных палочек проводят общепринятым методом в соответствии с ГОСТ 18963-73 и п. 1.2.4 Приложения 4. Коли-индекс газированных напитков должен быть не более 3.

6.10. Товарные сиропы. Сиропы проверяют на стойкость в соответствии ОСТ 18-130-82 при (20 +/- 2) °C.

6.11. Бутылки, укупорочный материал. Определение и ход анализа см. п. п. 5.8, 5.7, раздел «Микробиологический контроль пивоваренного производства».

6.12 Хлебный квас, полученный путем брожения.

При производстве хлебного кваса определяют следующие показатели:

• содержание дрожжей в концентрате квасного сусла, метод определения см. п. 6.7;
• общее число бактерий группы кишечных палочек в питьевой воде, используемой для разведения концентрата (коли-индекс), в соответствии с ГОСТ 18963-73;
• наличие лейконостока в готовом квасном сусле с сахарным сиропом, см. метод определения жидкого сахара п. 6.3;
• бактерии группы кишечных палочек (БГКП) в готовом квасе.

Метод определения БГКП в квасе изложен в Приложении 4 п. 1.2.4.2.

В хлебном квасе на чистых культурах БГКП не допускается в 10 куб. см.

В хлебном квасе на хлебопекарных дрожжах БГКП не допускается в 1,0 куб. см.

Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, не допускаются в 25 куб. см готовых напитков и кваса. Анализ на патогенные микроорганизмы проводится учреждениями санитарно-эпидемиологической службы по методам, утвержденным МЗ СССР.

Санитарно-микробиологический контроль проводят после мойки и дезинфекции, проведенных согласно «Санитарным правилам для предприятий пивоваренной и безалкогольной промышленности», путем высева отобранных проб последней смывной воды.

Отбор проб проводят после полного удаления моющих и дезинфицирующих средств.

7.1 При производстве пива проверяют качество санитарной обработки следующего оборудования и коммуникаций:

• замочные чаны;
• солодорастильные ящики;
• агрегат для производства солода статическим способом;
• бункера для солода (мокрое и сухое дробление);
• установка для водоподготовки;
• отстойные чаны, тарелки, гидроциклонные чаны;
• сборники для белкового отстоя;
• сепараторы сусловые;
• открытые оросительные холодильники;
• пластинчатые теплообменники;
• трубчатые теплообменники;
• шланги, трубопроводы, суслопроводы во всех цехах и отделениях;
• сборник промывных вод;
• чаны предварительного брожения (открытые и закрытые);
• чаны главного брожения (открытые и закрытые);
• танки для дображивания;
• цилиндро-конические танки;
• танки линий полунепрерывного брожения;
• емкости отделения чистой культуры дрожжей;
• оборудование для хранения задаточных дрожжей;
• система пивопроводов;
• фильтры осветляющие;
• фильтры обеспложивающие;
• сепараторы готового пива;
• смесители;
• карбонизаторы;
• емкости для исправимого брака пива;
• сборники готового пива;
• вымытые бутылки;
• разливочный автомат;
• бочки;
• автоцистерны (пивовозы);
• мерники для пивовозов.

В отобранных пробах определяют:

• общее число клеток микроорганизмов;
• бактерии группы кишечных палочек.

При определении общего числа микроорганизмов высевают глубинным способом 1 куб. см смывной воды на питательный агар или мясо-пептонный агар, инкубируют при (30 +/- 1) °C в течение 48 ч. При хорошем качестве мойки и дезинфекции число микроорганизмов в последних смывных водах должно быть близким к числу микроорганизмов в воде, поступающей на мойку, т.е. не более 100 в 1 куб. см.

Бактерии группы кишечных палочек определяют согласно методике, изложенной в Приложении 4 п. 1.2.4.4. БГКП должны отсутствовать в 100 куб. см смывной воды.

7.2. В производстве безалкогольных напитков проверяют качество санитарной обработки следующего оборудования и коммуникаций:

• емкости для хранения сока, жидкого сахара;
• емкости для хранения концентрата квасного сусла;
• емкости для сахарного сиропа;
• купажные и напорные емкости;
• фильтр-прессы, сепараторы;
• синхронно-смесительные установки;
• разливочные автоматы;
• вымытые бутылки;
• укупорочный материал;
• емкости для приготовления разводки микроорганизмов в производстве хлебного кваса;
• емкость для разведения концентрата;
• бродильно-купажные емкости;
• танки цилиндро-конические бродильные ШЧ-ВЦН-50;
• дозаторы, шланги, системы трубопроводов;
• емкости для готового кваса, коллекторы;
• автоцистерны для кваса.

7.2.1 В отобранных пробах при производстве газированных напитков определяют:

• общее число микроорганизмов;
• коли-индекс;
• дрожжи.

Определение общего числа микроорганизмов в смывных водах см. п. 7.1.

При хорошем качестве мойки и дезинфекции число микроорганизмов в последних смывных водах должно быть близким к числу микроорганизмов в воде, поступающей на мойку оборудования, т.е. не более 100 в 1 куб. см.

Бактерии группы кишечных палочек определяют методами в соответствии ГОСТ 18963-73 «Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа». Коли-индекс 3.

Дрожжи в смывных водах определяют высевом 1 куб. см глубинным способом на сусловой агар. Инкубируют при (30 +/- 1) °C в течение 48 ч. Разрывы или вздутия агаровой пластинки свидетельствуют о наличии дрожжей в смывной воде и количественному подсчету не подлежат.

При тщательно проведенной мойке и дезинфекции дрожжи в 1 куб. см смывных вод должны отсутствовать.

7.2.2 В отобранных пробах смывных вод производства хлебного кваса определяют:

• общее число микроорганизмов;
• бактерии группы кишечных палочек.

Общее число микроорганизмов должно быть близким к числу микроорганизмов в воде, поступающей на мойку, т.е. не более 100 в 1 куб. см. БГКП должны отсутствовать в 100 куб. см смывной воды (см. Приложение 4 п. 1.2.4.4).

7.3. Для быстрой оценки качества мойки и дезинфекции автоцистерн для пива и кваса 10 куб. см последней смывной воды центрифугируют при 1500 — 2000 об./мин. в течение 10 мин. Центрифугат сливают, осадок микроскопируют. В 10 полях зрения должно быть не более 5 — 6 клеток, наличие микроорганизмов в каждом поле зрения указывает на неудовлетворительную мойку.

7.4. В случае обнаружения несоответствия требованиям к санитарной обработке оборудования и коммуникаций микробиолог обязан доложить заведующему производственной лаборатории, который доводит результаты контроля до сведения начальника цеха и требует проведения дополнительной мойки и дезинфекции технологического оборудования.

Недостатки проведенной дезинфекции учитывают при последующей обработке, при этом необходимо обращать внимание на тщательность механической мойки, на концентрацию дезинфицирующего вещества, время выдержки, режимы работы бутылко-моечной машины.

8. САНИТАРНЫЕ НОРМЫ

<*> При эпидемиологическом неблагополучии в регионе по кишечным инфекциям анализ воды проводится не реже 1 раза в 2 недели.

Примечание: При полной загрузке микробиолога выполнением анализов в течение дня он может сделать 25 - 27 анализов. Кроме того микробиолог занят приготовлением питательных сред, стерилизацией сред и посуды, отбором на производстве проб для анализов, визуальным контролем санитарно-гигиенического состояния производства, поэтому количество анализов, которое он может выполнить за день, снижается до 7 - 10. Такой расчет предусматривает наличие препаратора, занятого мытьем химической посуды, изготовлением ватных пробок, санитарной обработкой бокса и другими вспомогательными работами.

<*> При эпидемиологическом неблагополучии в регионе по кишечным инфекциям анализ воды проводится не реже 1 раза в 2 недели.

<**> Отбор проб смывных вод на анализ проводят выборочно - 10 - 15% автоцистерн от общего числа заполняемых цистерн.

Примечание. При полной загрузке микробиолога выполнением анализов в течение дня он может сделать 25 - 27 анализов. Кроме того микробиолог занят приготовлением питательных сред, стерилизацией сред и посуды, отбором на производстве проб для анализов, визуальным контролем санитарно-гигиенического состояния производства, поэтому количество анализов, которое он может выполнить за день, снижается до 7 - 10. Такой расчет предусматривает наличие препаратора, занятого мытьем химической посуды, изготовлением ватных пробок, санитарной обработкой бокса и другими вспомогательными работами.

Микроскоп биологический МБИ, МБР или другой по ГОСТ 8284-67

Осветитель к микроскопу ОИ-19

Автоклав электрический медицинский

Сушильные шкафы с терморегулятором

Термостаты электрические с терморегулятором

Весы аналитические ВЛАО-200-М

Весы лабораторные технические ВЛТК-500

Весы торзионные ВЛТК-500

Дистиллятор электрический

Холодильник бытовой

Центрифуга угловая, малогабаритная ЦУМ-1

Насос вакуумный ручной или с электромотором

Прибор для фильтрации (типа прибора Зейтца)

pH-метр, обеспечивающий измерение pH в пределах от минус 2 до 14

Лампы бактерицидные БУВ-30 (1,5 - 2,5 Вт на 1 куб. м воздуха)

Камеры для счета (камера Горяева или другая)

Бактериологическая петля для пересева микроорганизмов

Шпатели стеклянные и металлические

Чашки Петри по ГОСТ 10973-75

Пробирки по ГОСТ 10515-75

Пипетки по ГОСТ 20292-74 вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см

Колбы стеклянные мерные разной вместимости по ГОСТ 1770-74

Колбы плоскодонные разной вместимости по ГОСТ 1770-74

Стаканы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336-82

Цилиндры мерные разной вместимости по ГОСТ 1770-74

Воронки стеклянные по ГОСТ 23932-79

Стекла предметные по ГОСТ 9284-75

Стекла покровные по ГОСТ 6672-75

Спиртовка по ГОСТ 25336-82 или газовая горелка

Термометры стеклянные химические лабораторные по ГОСТ 215-73

Сахарометры тип ЕО-8

Пинцеты

Мембранные фильтры МФА-МА "Владипор" N 5, 6, 7, 9, 10 диаметром 35 мм

Поплавки стеклянные (маленькие пробирки)

Палочки стеклянные

Пеналы металлические или стеклянные для пипеток

Капельницы по ГОСТ 25336-82

Штативы для пробирок

Бумага оберточная

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026-76

Вата медицинская по ГОСТ 5556-81

Марля медицинская по ГОСТ 9412-77

Масло иммерсионное по ГОСТ 13739-78

Масло вазелиновое по ГОСТ 3164-78

Щетки, ерши для мойки посуды

Карандаши по стеклу

Мыло

Порошок стиральный

Ножницы

Кастрюли эмалированные разной емкости

Электроплитка

Агар-агар микробиологический в волокнах или порошке ГОСТ 20438-75

Пептон бактериологический по ГОСТ 13805-76

Среда сухой питательный агар, выпускаемая Минмедпромом

Среда Эндо, сухая, выпускаемая Минмедпромом

Среда Кода, сухая, выпускаемая Минмедпромом

Метиленовый синий

Фуксин основной

Генцианвиолет

Кристаллический фиолетовый

Фенолфталеин

Лакмус

Глюкоза по ГОСТ 6038-79

Йодистый калий по ГОСТ 4232-74

Кристаллический йод по ГОСТ 4159-79

Спирт этиловый по ГОСТ 5962-67

Щелочи: KOH, NaOH

Кислота карболовая (фенол) по ГОСТ 6417-72

Желчь крупного рогатого скота или желчь медицинская (билирубин)

Кальций углекислый (мел) ГОСТ 83-79

Кислота лимонная ГОСТ 908-79Е

Кислота соляная ГОСТ 3118-77

Кислота фосфорная ГОСТ 10678-71

Кислота уксусная ГОСТ 61-75

Кислота серная ГОСТ 4204-77

Натрий гидрат окиси (едкий) ГОСТ 4328-77

Натрий хлористый ГОСТ 4233-77

Натрий двууглекислый (сода питьевая) ГОСТ 2156-76

Реактивы для окраски по Граму по ГОСТ 18963-73

Лизин

Нейтральный красный ТУ 6-09-4120-75

1.1 Микроскопирование

1.1.1 Способы приготовления микробиологических препаратов.

В задачу заводского микробиолога входит как разведение чистой культуры микроорганизмов, так и оценка санитарно-микробиологического состояния производства в целом. При контроле дрожжей чистой культуры и семенных дрожжей, при определении бактериального обсеменения используют метод микроскопирования. Микроскопический препарат готовят на предметном стекле толщиной 1,1 - 1,4 мм. Покровные стекла имеют толщину 0,15 - 0,17 мм. Применение более толстых стекол снижает четкость изображения. Важным моментом является подготовка стекол. Поверхность стекла тщательно моют и обезжиривают для того, чтобы капля жидкости на стекле равномерно расплывалась. Для обезжиривания стекла обрабатывают хромовой смесью, а затем ополаскивают водой. Наиболее простой и легко доступный способ обезжиривания состоит в том, что сухие стекла натирают сухим хозяйственным мылом, а затем их тщательно вытирают сухой салфеткой. Не рекомендуется для обезжиривания применять кипячение в щелочи, так как поверхность стекол при этом разъедается и становится матовой. Чистые предметные стекла обычно хранят в банке со спиртом.

На обезжиренное предметное стекло стерильной пипеткой наносят каплю исследуемого материала (дрожжи, пиво, смывные воды и др.). В том случае, если микроскопируют культуру, выросшую на плотной питательной среде, на предметное стекло предварительно наносят каплю водопроводной воды, затем петлей переносят в нее небольшое количество исследуемой культуры, размешивают и плотно накрывают покровным стеклом. Препарат рассматривают под микроскопом с сухой системой при увеличении 600. Приготовленный таким образом препарат позволяет установить форму клеток, размеры, подвижность и другие физиологические признаки.

Для количественного учета нежизнеспособных дрожжевых клеток, определения гликогена в дрожжах, а также для лучшего рассмотрения и определения бактериальной инфекции готовят препараты с прижизненной окраской.

В этом случае вместо водопроводной воды на предметное стекло наносят каплю краски (метиленовая синяя, нейтральный красный, раствор Люголя).

1.1.2 Определение нежизнеспособных дрожжевых клеток.

На предметное стекло наносят каплю анализируемых дрожжей и каплю метиленового синего. Через 2 мин. ведут подсчет всех дрожжевых клеток и клеток, окрашенных в синий цвет (нежизнеспособных). Нежизнеспособные дрожжи окрашиваются в синий цвет вследствие того, что клеточная оболочка и мембрана мертвых клеток не препятствует проникновению краски. Подсчет ведут не менее чем в 5 полях зрения. Количество нежизнеспособных дрожжевых клеток выражают в процентах от общего числа клеток.

1.1.3. Определение гликогена в дрожжевых клетках (упитанность по гликогену).

Гликоген - запасное питательное вещество в дрожжах, характеризующее их хорошее физиологическое состояние.

Для определения гликогена на предметное стекло наносят каплю дрожжей и 1 - 2 капли раствора Люголя. Капли смешивают, покрывают покровным стеклом. Микроскопируют через 2 - 3 мин. Гликоген окрашивается в красно-бурый цвет, цитоплазма дрожжей в светло-желтый цвет. В перезревших и ослабленных клетках гликоген отсутствует. Просматривают не менее 5 полей зрения. Хорошее состояние дрожжей, когда 70 - 75% дрожжевых клеток содержат гликоген.

1.1.4 Определение числа клеток в счетной камере.

Счетные камеры применяют в основном при определении количества клеток при задаче дрожжей на брожение, при перекачивании молодого пива на дображивание, при разведении чистой культуры. Используют обычно камеру Горяева, хотя можно применять и другие счетные камеры.

    Камера   Горяева   представляет   собой   толстое   предметное  стекло,
разделенное  бороздками. Центральная часть, на которой нанесена сетка, ниже

        1

боковых на -- мм (это глубина камеры всегда указана на стекле). Сетка 10 1 разделена на большие и малые квадраты. Площадь малого квадрата --- кв. мм, 400 1 а большого -- кв. мм (эти цифры также указаны на предметном стекле). 25 Подсчет клеток можно вести как в малых, так и в больших квадратах.

Каплю исследуемой суспензии наносят на поверхность счетной камеры и покрывают шлифованным покровным стеклом. При необходимости делают разведение, т.к. в одном квадрате число клеток не должно превышать 20. От того, насколько плотно будет притерто стекло, зависит точность результатов. Подсчет клеток начинают через 3 — 5 минут после заполнения камеры для того, чтобы клетки осели и были бы видны под микроскопом в одной плоскости. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата.

Так как на предметном стекле нанесено две сетки, то подсчет ведут как в одной, так и в другой. Для получения более достоверных результатов рекомендуется заполнять камеры несколько раз, при этом общее число просчитанных клеток должно быть не менее 600.

Количество клеток в 1 куб. см суспензии вычисляют по формуле:

                                a х S

M = -------, h х 100

где:

M — количество клеток в 1 куб. см суспензии;

a — среднее число клеток в одном квадрате;

1000 куб. мм = 1 мл;

h — глубина камеры (1/10 мм);

S — площадь квадрата сетки, кв. мм. 4

Таким образом, количество клеток в 1 куб. см = a х 25 х 10 (при 6 подсчете в больших квадратах) или a х 4 х 10 (при подсчете в малых квадратах).

В том случае, если перед подсчетом делали предварительное разведение, то полученный результат умножают на разведение. Результаты выражают в млн./куб. см.

1.1.5 Подсчет клеток на фиксированных подкрашенных препаратах.

При отсутствии счетной камеры для количественного учета микроорганизмов готовят фиксированные окрашенные препараты. На обезжиренное предметное стекло градуированной пипеткой помещают определенный объем суспензии клеток

(от  0,02  до  0,05  куб.  см)  и  равномерно  распределяют  его  петлей на
определенной  площади,  равной  4  или  6  кв.  см.  Для  этого  удобно под
предметное  стекло  подложить  миллиметровую  бумагу,  на  которой  отмечен
прямоугольник  нужного размера. Препарат подсушивают на воздухе и фиксируют
в  стаканчике с 96-процентным спиртом в течение 10 - 20 мин. Затем препарат

1 — 2 мин. красят фуксином Циля. После окраски препарат промывают, погружая

в  стакан  с водой,  и  высушивают на воздухе.  Клетки,  находящиеся в поле
зрения микроскопа, подсчитывают, передвигая препарат   по  диагонали. Общее
количество  подсчитанных  клеток  должно  быть  не  менее 600. Площадь поля
зрения  определяют  с  помощью  объект-микрометра, который вместо препарата

помещают на столик микроскопа. Не меняя увеличения, определяют диаметр поля 2 зрения и по формуле S = Пr вычисляют его площадь. Количество клеток, содержащихся в 1 куб. см суспензии, подсчитывают по формуле:

                             a х S

N = ----- х n, v х s

где:

N — количество клеток в 1 куб. см исследуемой суспензии;

a — количество клеток в одном поле зрения;

s — площадь поля зрения;

v — объем суспензии;

S — площадь приготовленного мазка;

n — разведение исходной суспензии.

1.2. Определение микроорганизмов методом выращивания на питательных средах

Методом выращивания на питательных средах определяют общее число микроорганизмов, бактерии группы кишечных палочек, выявляют вредителей пивоваренного и безалкогольного производств.

Применяют глубинный и поверхностный способ выращивания микроорганизмов. Питательные среды для выявления (культивирования) могут быть плотными (агаризованными) и жидкими.

1.2.1 Приготовление разведений.

При значительной обсемененности анализируемую пробу предварительно разводят. Для разведения пользуются стерильной водопроводной водой или 0,1%

раствором  пептона,  разлитыми  по  9  куб.  см  в  стерильные пробирки. Из
исследуемого  образца  берут стерильной градуированной пипеткой 1 куб. см и
переносят  в  пробирку  с 9 куб. см стерильной воды - это первое разведение

-1

(10  ).  Полученную  суспензию  тщательно  перемешивают, вбирая в пипетку и
выпуская  из нее взвесь не менее 10 раз.  Чтобы   получить 2-ое  разведение

-2 (10 ) берут 1 куб. см из первого разведения и переносят в пробирку с -3

9 куб.  см  стерильной  воды.  Таким  же  образом  готовят  третье (10  ) и
последующие   разведения.  Для  приготовления  каждого  разведения  следует
использовать   отдельную   пипетку.   Степень   разведения    зависит    от
предполагаемой   обсемененности    исследуемого   образца.   При  выявлении
микроорганизмов,  количество  которых  в  образце   относительно  невелико,

разведения не делают.

Интервал между приготовлением разведений и высевом в питательные среды не должен превышать 30 мин.

1.2.2. Определение количества микроорганизмов методом высева на плотные питательные среды.

Метод широко применяется в микробиологическом контроле пивоваренного и безалкогольного производства для выявления обсемененности по ходу технологического процесса, при контроле готового пива, напитков, кваса, при контроле качества мойки и дезинфекции оборудования.

Метод выявляет не только численность, но и разнообразие жизнеспособных микроорганизмов, находящихся в исследуемой пробе.

1.2.2.1 Методика посева на плотные среды.

Посев на чашки Петри может быть поверхностным и глубинным.

При поверхностном посеве на застывшую агаризованную среду наносят обычно 0,1 куб. см суспензии и стерильным стеклянным шпателем равномерно распределяют ее по поверхности. Из каждой пробы или из разведения делают высев на 2 чашки (2-кратная повторность), пользуясь каждый раз отдельным шпателем.

При глубинном способе высевают 1 куб. см пробы или ее соответствующих разведений одновременно в две стерильные чашки Петри. При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывают, и посевной материал вносят на дно чашки. Затем в каждую чашку наливают (18 +/- 2) куб. см расплавленной и охлажденной до (45 +/- 1) °C питательной среды и немедленно перемешивают с посевным материалом осторожными круговыми движениями.

После застывания агаризованной среды чашки Петри, засеянные тем или иным способом, переворачивают дном вверх, посевы инкубируют в термостате.

Подсчитывают выросшие колонии на каждой чашке отдельно. При подсчете каждую учитываемую колонию для удобства отмечают точкой на внешней стороне дна чашки Петри. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют.

Результаты параллельных высевов (повторностей) суммируют и определяют среднее число колоний, выросших на одной чашке. Количество клеток в 1 куб. см исследуемого образца вычисляют умножением среднеарифметического числа колоний на разведение и делением этого числа на количество посевного материала:

                                      n
                                A х 10

M = -------, v

где:

M — количество клеток в 1 куб. см суспензии;

A — среднее число колоний на одной чашке;

10 — коэффициент разведения;

n — порядковый номер разведения;

v — объем высеваемой суспензии в куб. см.

Следует иметь в виду, что достоверность результатов зависит не только от числа повторностей, но и от точности подсчета колоний.

Полученный результат округляют:

до числа, кратного 5 — если среднее арифметическое число микроорганизмов менее 100;

до числа, кратного 20 — если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и оканчивается цифрой 5;

до числа, кратного 10 — если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и не оканчивается цифрой 5.

Результаты вычисления выражают числом 1,0 — 9,9 х 10. Например: при -2

посеве 1 куб. см   пробы  из разведения   10    среднеарифметическое  число
колоний с 2-х чашек равнялось 132. Полученную цифру  следует  округлить  до
числа,  кратного  10,  т.е.   130.  Общее   количество    микроорганизмов в

1 куб. см в данном случае будет равно:

            2           4
    130 х 10  = 1,3 х 10 .

1.2.2.2 Определение общего числа микроорганизмов.

Метод заключается в определении общего количества жизнеспособных мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 куб. см (1 г) пробы.

Сущность метода заключается в следующем:

• определенное количество анализируемой пробы или ее разведений высевают в питательный агар или мясо-пептонный агар;
• посевы инкубируют при (30 +/- 1) °C в течение (72 +/- 3) час., предварительный просмотр выросших колоний производят через 48 час.;
• подсчитывают все выросшие колонии и определяют количество микроорганизмов в 1 куб. см (1 г) пробы, исходя из того, что каждая колония развилась из одной клетки.

Методика посева и все последующие операции изложены в п. 1.2.2.1.

1.2.3 Метод мембранных фильтров.

При работе с мембранными фильтрами следует соблюдать следующие условия:

• выбирают фильтры, размеры пор которых позволяют осадить на нем основное количество микроорганизмов; при работе с фильтрующими мембранами «Владипор» марки МФА-МА в качестве таких мембран используют № 5, 6;
• визуально контролируют отсутствие механических повреждений фильтров, во избежание повреждений фильтры берут пинцетом, не имеющем рубчиков;
• перед использованием фильтров, их освобождают от остатков растворителей, пузырьков воздуха и загрязнений кипячением по ГОСТ 18963-73 в дистиллированной воде;
• для фильтрации применяют аппарат Зейтца или другие установки для фильтрации жидкостей;
• части установки для фильтрации, соприкасающиеся с фильтруемым раствором, стерилизуют (фламбируют) или кипятят;
• стерильный влажный фильтр фламбированным пинцетом осторожно помещают на подкладку из пористого материала или сетку фильтрующей аппаратуры.

Мембранные фильтры применяют для анализа легко фильтруемых жидких продуктов или продуктов, дающих растворы с высоким осмотическим давлением (сиропы, концентрированные соки). При фильтрации образец с высоким осмотическим давлением предварительно разводят стерильной питьевой водой в соотношении, позволяющем его легко профильтровать.

Жидкий продукт, содержащий большое число взвешенных частиц, фильтруют сначала через предварительный фильтр № 9 или № 10 МФА-МА для удаления крупной взвеси. Для этого предварительный фильтр помещают в фильтровальный прибор над основным фильтром № 5 или 6. После окончания фильтрования оба фильтра переносят на поверхность среды. При выведении результатов анализа учитывают рост бактерий на обоих фильтрах.

После осаждения на фильтре микроорганизмов из купажных сиропов или напитков, содержащих консерванты, его промывают стерильной питьевой водой.

Фильтрацию заканчивают в момент исчезновения влаги на поверхности фильтра. Немедленно после окончания фильтрации фильтр переносят на плотные среды. На среду фильтр накладывают нижней стороной так, чтобы она полностью соприкасалась с поверхностью среды. Посевы термостатируют в условиях, благоприятных для роста определенных микроорганизмов.

1.2.4 Определение бактерий группы кишечных палочек.

К бактериям группы кишечных палочек относятся грам-отрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре (37 +/- 0,5) °C в течение 24 — 48 ч.

1.2.4.1. Определение количества бактерий группы кишечных палочек в воде.

Анализ питьевой воды, поступающей в производство, проводят по методикам, изложенным в ГОСТ 18963-73 «Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа».

1.2.4.2 Определение бактерий группы кишечных палочек в пиве и квасе.

БГКП в готовом пиве и квасе определяют методом посева в среду Кода или Кесслер с лактозой (с поплавком). Для определения газообразования в среде Кода можно использовать вату. Для этого пробирки стерилизуют вместе с небольшими рыхлыми комочками ваты, после чего в них разливают готовую среду Кода.

Пиво и квас перед исследованием нейтрализуют стерильным 10% раствором двууглекислого натрия до слабощелочной реакции (pH 7,2 — 7,4). Реакцию среды проверяют с помощью pH-метра или универсальной индикаторной бумажки.

Для посева берут то количество пива, кваса, в котором предусматривается отсутствие БГКП, при этом соблюдают соотношение продукта и среды 1:10.

При посеве 3 куб. см пива можно использовать колбу с 27 куб. см среды или высевать по 1 куб. см пива в три пробирки с 9 куб. см среды.

Посевы помещают в термостат при (37 +/- 0,5) °C на 24 ч. При отсутствии признаков роста (цвет среды не меняется, газ не образуется) дают заключение о соответствии исследованного образца нормативу, например: БГКП в 3 куб. см отсутствует.

При наличии роста на среде Кода происходит изменение цвета среды с фиолетового на зеленоватый, а комочки ваты покрываются пузырьками воздуха.

При наличии признаков роста на среде Кесслер — образование газа в поплавках. В случае обнаружения роста на среде Кода или Кесслер необходимо сделать высев петлей (штрихами) на чашки Петри со средой Эндо. Посевной материал следует брать на петлю в минимальном количестве с таким расчетом, чтобы получить на чашках изолированные колонии. Чашки помещают в термостат с температурой (37 +/- 0,5) °C на 18 — 24 часа.

Из колоний, типичных для БГКП (темно-красные, часто с металлическим блеском или розовые), готовят мазки на предметных стеклах, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Обнаружение грамотрицательных палочек указывает на наличие БГКП.

При обнаружении на среде Эндо мелких бесцветных колоний, характерных для возбудителей острых кишечных инфекций, микробиолог лаборатории немедленно передает чашки для идентификации в территориальную санэпидстанцию.

1.2.4.3. Определение коли-индекса газированных безалкогольных напитков.

Количество бактерий группы кишечных палочек в напитках определяют методом мембранных фильтров или бродильным методом в соответствии с ГОСТ 18963-73 «Методы санитарно-бактериологического анализа».

Перед анализом напиток, насыщенный двуокисью углерода, переносят в стерильную закрытую ватной пробкой коническую колбу или в другую посуду и подогревают при частом перемешивании круговыми движениями на водяной бане при температуре от 30 до 35 °C до тех пор, пока из него не перестанут выделяться пузырьки газа.

При анализе напитков мембранным методом, по окончании фильтрации, фильтр промывают стерильной питьевой водой от оставшейся кислоты и консерванта, после чего переносят на среду Эндо.

При анализе напитков бродильным методом проводят предварительную нейтрализацию напитка 10% раствором бикарбоната натрия до слабощелочной реакции (рН 7,2 — 7,4). Реакцию среды проверяют на рН-метре или универсальной индикаторной бумаге.

1.2.4.4. Определение БГКП в смывных водах с оборудования производства пива и кваса.

Смывные воды в объеме 100 куб. см фильтруют через мембранный фильтр № 6 МФА-МА, соблюдая правила стерильности. Мембранный фильтр, с осевшими на его поверхности клетками, пинцетом переносят в пробирку с 10 куб. см среды Кода или Кесслер с лактозой и размещают его в пробирке так, чтобы он был полностью погружен в жидкость.

Дальнейшее определение БГКП в смывных водах ведут аналогично определению БГКП в пиве и квасе, см. п. 1.2.4.2.

При отсутствии мембранных фильтров производят посев 100 куб. см смывной воды в 90 куб. см концентрированной среды Кода или Кесслер.

В концентрированной среде количество ингредиентов, кроме воды, увеличивают в 10 раз.

Приложение 5

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

1. Общие положения

Питательные среды готовят в эмалированной или стеклянной посуде.

Необходимое значение pH питательных сред устанавливают с помощью растворов NaOH с массовой концентрацией 10 г/куб. дм или 20 г/куб. дм лимонной кислоты или соляной кислоты объемной концентрацией 25 куб. см/куб. дм. Один из этих растворов по каплям добавляют к питательной среде и периодически определяют значение pH с помощью индикатора или потенциометрически. При стерилизации питательной среды значение pH может меняться. При подщелачивании среды pH после кипячения и стерилизации снижается примерно на 0,2, поэтому при приготовлении сред pH устанавливают на 0,2 выше необходимого. После стерилизации обязательно проверяют pH.

Готовые питательные среды хранят при комнатной температуре не более 3 сут., при температуре около 4 °C — не более одного месяца.

2. Среда из сухого питательного агара

Готовят по прописи на этикетке. Производство Дагестанского НИИ питательных средств.

3. Мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар

Исходным продуктом для приготовления обеих сред является мясная вода, которую готовят следующим образом: 500 г свежего мелко нарубленного или пропущенного через мясорубку мяса заливают 1 куб. дм водопроводной воды и оставляют при комнатной температуре на 12 ч или в термостате при 30 °C на 6 ч, а при 37 °C — на 2 ч. Полученный экстракт процеживают через марлю или полотно и кипятят 5 мин. Свернувшиеся белки фильтруют через ватный фильтр и фильтрат доливают водой до первоначального объема. К мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% NaCl. Получают мясо-пептонный бульон — МПБ. Бульон должен быть совершенно прозрачным. Для этого его осветляют следующим образом. Белки двух яиц сбивают в пену с двойным количеством воды. Полученную массу добавляют к охлажденному до температуры 50 °C бульону, тщательно смешивают с ним. Бульон ставят в автоклав или аппарат Коха, с тем чтобы хорошо прогреть его, не повышая при этом давления. Белок свертывается и увлекает из жидкости взвешенную муть. После окончательной фильтрации через двойной складчатый фильтр получают прозрачную жидкость. Готовый бульон стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 30 мин.

Мясо-пептонный агар приготовляют добавлением к мясо-пептонному бульону агара в количестве 2% (на 1 куб. дм МПБ — 20 г агара), расплавляют на водяной бане, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 30 мин.

Применяют МПА для определения общего количества микроорганизмов (мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов).

4. Солодовое сусло

Для приготовления неохмеленного сусла берут на каждый 1 куб. дм водопроводной воды 250 г размолотого солода. Воду нагревают до температуры 50 °C, засыпают солод и смесь, выдерживают при этой температуре 30 мин., все время перемешивая. Затем поднимают температуру до 63 °C и, постоянно перемешивая, выдерживают 30 мин., далее нагревают до 70 °C, выдерживают 30 мин. и проверяют полноту осахаривания крахмала по йодной пробе раствором Люголя. Если осахаривание неполное, смесь подогревают до 72 °C и выдерживают до полного осахаривания. Процесс считается оконченным, когда при смешивании капли сусла с раствором Люголя последний не окрашивается в синий цвет. Плотность сусла устанавливается в соответствии с применяемым способом. После этого сусло фильтруют через марлю, разливают по колбам и пробиркам и стерилизуют при температуре (116 +/- 1) °C в течение 20 мин. или текучим паром при температуре (100 +/- 1) °C 3 сут. по 30 мин.

5. Солодовое агаризованное сусло

К отфильтрованному суслу с массовой долей сухих веществ 7 — 8% добавляют 2% агар-агара (на 1 куб. дм сусла — 20 г агара). Среду расплавляют на водяной бане, разливают по стерильным пробиркам или колбам и стерилизуют при температуре (116 +/- 1) °C в течение 20 мин.

6. Солодовое агаризованное сусло с углекислым кальцием

Для выявления молочнокислых бактерий используют неохмеленное солодовое сусло с массовой долей сухих веществ 7 — 8%. Для нейтрализации кислоты, образующейся при развитии молочнокислых бактерий, перед посевом в агаризованное солодовое сусло вносят 2% стерильного углекислого кальция (мела).

6.1 Углекислый кальций стерильный.

Углекислый кальций фасуют в пробирки, флаконы, колбы от 2 до 100 г. Стерилизуют горячим воздухом при температуре 160 — 165 °C в течение 120 мин.

7. Среды для обнаружения диких дрожжей

Для выявления диких дрожжей обычно используют охмеленное сусло с добавлением веществ, препятствующих размножению культурных пивоваренных дрожжей.

7.1. Сусловой агар с кристаллическим фиолетовым для выявления диких дрожжей рода Saccharomyces.

К 1 куб. дм охмеленного солодового сусла (массовая доля сухих веществ 7%) прибавляют 20 г агара и 2 г кристаллического фиолетового, расплавляют на водяной бане. Среду стерилизуют при температуре (116 +/- 1) °C в течение 20 мин.

7.2. Среда с лизином для выявления диких дрожжей p. p. Candida, Torulopsis, Brettanomyces (не относящихся к p. Saccharomyces).

К 1 куб. дм водопроводной воды прибавляют 50 г глюкозы, 3 г лизина, 1 г KH PO , 1 г MgSO , следы FeSO и 15 — 20 г агара. После расплавления агара

на водяной бане среду разливают по пробиркам, колбам и стерилизуют при (116 +/- 1) °C в течение 20 мин.

8. Дрожжевая вода

Для приготовления дрожжевой воды 100 г свежих прессованных или 50 г сухих дрожжей кипятят в 1 куб. дм дистиллированной воды. Затем жидкости дают отстояться на холоде, декантируют и фильтруют. Фильтрат стерилизуют 20 мин. при температуре (116 +/- 1) °C или при (100 +/- 1) °C 3 сут. по 30 мин. Дрожжевую воду используют как самостоятельную среду или вносят необходимые добавки (углевода, соли). Для обнаружения лейконостока используют дрожжевую воду с 10% сахарозы. Сахарозу добавляют в готовую дрожжевую воду, вновь стерилизуют 20 мин. при температуре (116 +/- 1) °C.

9. Среды с нистатином для обнаружения бактерий

При микробиологическом анализе проб, содержащих дрожжевую микрофлору, выявление бактериальной инфекции бывает затруднено. Для этого пробы (сусла, пива и т.д.) высевают на агаризованные питательные среды с нистатином. Нистатин представляет собой антибиотик, подавляющий рост дрожжей и не влияющий на бактериальную микрофлору.

Промышленность выпускает нистатин с активностью, равной 2000 — 3000 ед. в 1 мг. При активности, равной 2500 ед. на 100 куб. см стерильной воды, берут 10 мг антибиотика, получают раствор с активностью 250 ед. в 1 куб. см. Примерное количество антибиотика при постоянной работе с ним можно брать стерильным скальпелем без взвешивания. В чашку Петри вносят 1 куб. см раствора нистатина и далее все операции проводят как обычно при посеве на твердые среды.

9.1. Кислотообразующие бактерии обнаруживаются на неохмеленном сусле-агаре с мелом и нистатином по наличию зон растворения мела вокруг колоний.

9.2. Лейконосток выявляется на дрожжевом агаре с 10% сахарозы и нистатином в случае большого количества дрожжей.

10. Среды для обнаружения бактерий группы кишечных палочек

10.1 Среда Эндо (фуксинсернистый агар). Если отсутствует готовый

препарат в виде сухого порошка, то к 100 куб. см расплавленного мясо-пептонного агара стерильно добавляют 0,5 г лактозы, растворенной в 2 -

3  куб.  см  стерильной  воды,  охлаждают  до температуры 70 °C и добавляют
смесь  0,5 куб. см насыщенного спиртового раствора основного фуксина с 1,25
куб.  см   свежеприготовленного    10-процентного    раствора    безводного
сернистокислого натрия Na SO  (или с 1,25 куб. см  20-процентного  раствора
                         2  3
кристаллогидрата   Na SO  х 7H O),  хорошо   размешивают   и   разливают  в
                     2  3     2

10.2 Среда Кесслер с лактозой.

К 1 куб. дм водопроводной воды прибавляют 10 г пептона и 50 куб. см желчи крупного рогатого скота, кипятят смесь при помешивании 20 — 30 мин. в водяной бане и фильтруют через вату. В полученном фильтрате растворяют 2,5 г лактозы и доводят объем до 1 куб. дм, устанавливают реакцию среды (pH 7,4 — 7,6), после чего добавляют 2 куб. см 1% водного раствора кристаллического фиолетового, разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют при (121 +/- 1) °C 10 мин., готовая среда имеет темно-фиолетовый цвет.

10.3 Среда Кода.

Выпускается Дагестанским НИИ питательных сред. Среду готовят по прописи на этикетке. Разливают в стерильные пробирки без поплавков или колбочки.

11. Приготовление стерильной воды

Водопроводную воду разливают в пробирки по 10 куб. см, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при (121 +/- 1) °C 30 мин. Стерильную воду хранят не более двух недель.

Можно стерилизовать воду в колбе и разливать, соблюдая правила стерильности, в пробирки или колбы непосредственно перед анализом.

12. Раствор пептонно-солевой

натрий хлористый — 8,5 г

пептон бактериологический — 1,0 г

вода дистиллированная — 1000 куб. см

Приготовление: растворяют натрий хлористый и пептон в дистиллированной воде при медленном нагревании, устанавливают pH 7,0 +/- 0,1, разливают в колбы, пробирки и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 30 мин. Раствор хранят при температуре (4 +/- 2) °C не более 30 дней.

13. Способ стерилизации питательных сред, посуды и других материалов

ТЕМПЕРАТУРА НАСЫЩЕННОГО ПАРА ПРИ РАЗЛИЧНОМ ИЗБЫТОЧНОМ ДАВЛЕНИИ

Раствор оставляют на 2 - 3 суток, периодически взбалтывая, а затем фильтруют. Раствор устойчив.

2. Метиленовый синий 1:40:

насыщенный спиртовый раствор

    метиленового синего, куб. см              1
    дистиллированная вода, куб. см            40

Применяют для окрашивания нежизнеспособных дрожжевых клеток при оценке производственных дрожжей.

3. Раствор Люголя:

    йод кристаллический, г                    1
    йодистый калий, г                         2
    дистиллированная вода, куб. см            300

Йодистый калий растворяют в 5 — 10 куб. см воды, добавляют навеску кристаллического йода и после его полного растворения доводят водой объем раствора до 300 куб. см. Раствор хранят в темной посуде. Применяют для контроля степени осахаривания сусла, для окраски по Граму и для выявления глюкогена при оценке производственных дрожжей.

4. Карболовый раствор генциана фиолетового:

    генциан фиолетовый, г                     1
    этиловый спирт ректификованный, куб. см   10
    фенол, г                                  5

Генциан фиолетовый, этиловый спирт и фенол растирают в ступке, добавляя 100 куб. см дистиллированной воды. Применяют для окраски по Граму.

5. Фуксин Циля

этиловый спирт ректификованный, куб. см 10

Основной фуксин, этиловый спирт и фенол растирают в ступке, добавляя 100 куб. см дистиллированной воды. Применяют для окраски по Граму.

6. Нейтральный красный. Применяют водный раствор в концентрации 0,001 — 0,0001% для окраски микроорганизмов. Нежизнеспособные клетки дрожжей окрашиваются в красный цвет. Раствор нестойкий.

Приложение 6

СПОСОБ АНТИСЕПТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ СЕМЕННЫХ ДРОЖЖЕЙ

При обнаружении повышенного содержания бактерий в семенных дрожжах

                     2 2 8

С этой целью готовят раствор препарата в холодной воде концентрацией 35,0%, заливают им дрожжи в ванне и при достижении pH = 3,5 выдерживают 30 — 60 мин.

После этого промывают дрожжи обычным способом — холодной водой (1 — 2 °C) до установления нейтральной реакции и контролируют качество проведенной обработки (п. 5.3.2).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ПРИ СОСТАВЛЕНИИ ИНСТРУКЦИИ

1. Технологическая инструкция по производству солода и пива. М., 1985 г.

2. Технологическая инструкция по производству безалкогольных напитков и кваса. М., 1984 г.