ГОСТ Р 51600-2000. Государственный стандарт Российской Федерации. Молоко. Методы определения антибиотиков
(принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 26.04.2000 № 127-ст)
Внимание
Документ утратил силу с 1 января 2011 года в части разделов 5 и 6 (рецепторные методы) в связи с изданием Приказа Ростехрегулирования от 26.02.2010 № 24-ст, в части разделов 1, 2, 3 и 4 (микробиологические методы) в связи с изданием Приказа Ростехрегулирования от 26.02.2010 № 25-ст. Взамен введены в действие ГОСТ Р 53774-2010 и ГОСТ Р 51600-2010 соответственно. Документ включен в Перечень национальных стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимых для применения и исполнения федерального закона «технический регламент на молоко и молочную продукцию» и осуществления оценки соответствия (Распоряжение Правительства РФ от 15.12.2008 № 1866-р).
Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ
Milk. Methods for determination of the antibiotics
Дата введения 1 июля 2001 года
Предисловие
1. Разработан Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ГУ ВНИИВСГЭ), Институтом питания РАМН и Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности (ГУ ВНИМИ).
Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 «Молоко и молочные продукты».
2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 26 апреля 2000 г. № 127-ст.
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на сырое, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое молоко (далее — молоко) и устанавливает микробиологические методы определения наличия антибиотиков.
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия
ГОСТ 2493-75 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия
ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия
ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ
ГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения соды
ГОСТ 24066-80 Молоко. Методы определения аммиака
ГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водорода
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.
3. Чашечный метод с Bac. stearothermophilus
3.1 Сущность метода
Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами тест-микроба и препятствовать его росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие любого антибиотика в молоке устанавливают по диаметру зоны ингибиции.
3.2 Аппаратура, реактивы и материалы
3.2.1. Аппаратура, реактивы и материалы по ГОСТ 9225 и указанные в 3.2.2 - 3.2.16.
3.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
3.2.3. Центрифуга частотой вращения 3000\text{мин}^{- 1} и разделяющим фактором 750 м/с2.
3.2.4. Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
3.2.5. Колба коническая по ГОСТ 25336, вместимостью 250 см3.
3.2.6. Линейка по ГОСТ 427, пределом измерения 150 мм или аппарат Микрофот 5ПО-1.
3.2.7 Пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное № 4.
3.2.8. Пипетка градуированная по ГОСТ 29227, 2-го класса точности, вместимостью 25 см3.
3.2.9 Гидролизат кормовых дрожжей.
3.2.10 Диски со стрептомицином.
3.2.11 Оптический стандарт мутности ОСО 42-28-29-86.
3.2.12 Препарат СКИВ.
3.2.13 Стандарт стрептомицина РСО 9347-194-00494189-99.
3.2.14. Тест-микроб Bac. stearothermophilus ВКМВ-510, выпускаемый Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.
3.2.15 Фуксин основной, спиртовой раствор концентрации 50 г/дм3.
3.2.16 Экстракт дрожжевой.
Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивы по качеству не ниже указанных.
3.3 Отбор проб
3.3.1 Отбор проб — по ГОСТ 9225.
3.3.2. Пробы молока до испытания допускается хранить в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C не более 24 ч.
3.3.3. Анализу подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный — по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066 и ГОСТ 24067.
3.4 Подготовка к анализу
3.4.1 Подготовка посуды и материалов
3.4.1.1. Всю новую посуду, предназначенную для микробиологических исследований, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты объемной доли 1 — 2%) в течение 15 мин, затем ополаскивают дистиллированной водой.
Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160 +/- 5) °C в течение 2 ч или в автоклаве при (121 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин с последующим подсушиванием.
Чашки Петри, пипетки и цилиндры стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В конец пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты. Пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками и обертывают бумагой. Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.
3.4.2 Приготовление питательных сред
3.4.2.1. Для получения спор Bac. stearothermophilus ВКМВ-510 используют питательную среду следующего состава: дрожжевой экстракт — 10,0 г, пептон — 20,0 г, глюкоза — 0,5 г, дистиллированная вода — до 1000,0 см3.
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают все компоненты питательной среды, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят объем раствора водой до метки и устанавливают pH среды по pH-метру, равный (7,1 +/- 0,1). Разливают раствор в колбы по 200,0 см3 и стерилизуют его при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.
3.4.2.2. Для проведения анализа готовят агаровую среду следующего состава: гидролизат кормовых дрожжей — 1,0 г, пептон — 0,4 г, хлористый натрий — 0,1 г, агар — 1,6 г, дистиллированная вода — до 100,0 см3.
В колбу вместимостью 200 см3 вносят 100 см3 дистиллированной воды и все компоненты среды, перемешивают до полного растворения и нагревают до кипения. Затем охлаждают до температуры (55 +/- 5) °C, устанавливают pH среды по pH-метру, равный (7,3 +/- 0,1), и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.
3.4.2.3. Для проведения анализа допускается применять питательные среды указанного в 3.4.2.1 и 3.4.2.2 состава промышленного изготовления.
3.4.3 Получение спор тест-микроба
3.4.3.1. Среду по 3.4.2.1 засевают 2 — 3 см3 18 — 20-часовой тест-культуры Bac. stearothermophilus ВКМВ-510, выращенной в пробирках с этой же средой, тщательно перемешивают и помещают в термостат температурой (55 +/- 1) °C на 3 сут.
После окончания инкубации из посевов делают мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина 50 г/дм3 и микроскопируют.
При наличии в поле зрения 90 — 95% свободных сформировавшихся спор колбы с посевами помещают на 16 — 18 ч в холодильник для осаждения. Надосадочную жидкость из колбы сливают, а осадок разливают по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают в водяной бане при температуре внутри пробирок (67 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин. Пробирки центрифугируют 20 — 30 мин. Осадок отмывают стерильной дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.
Взвесь спор вторично прогревают при температуре (67 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин. Полученную взвесь переносят в бактериологические пробирки и хранят в холодильнике не более 2 мес.
3.4.4 Приготовление засеянной агаровой среды
3.4.4.1. В пробирки отбирают взвесь спор тест-микроба по 3.4.3.1 и разводят стерильной дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по оптическому стандарту мутности.
3.4.4.2. К 100 см3 расплавленной и охлажденной до (60 +/- 2) °C среды по 3.4.2.2 добавляют 2,5 см3 водного раствора глюкозы массовой долей 40% и 4 см3 суспензии спор по 3.4.4.1. Смесь среды и спор тщательно перемешивают и разливают градуированной пипеткой по (11 +/- 1) см3 в чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности стола.
3.4.4.3 Чашки засевают непосредственно перед употреблением.
В некоторых случаях чашки хранят в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C не более 2 сут. Перед использованием их прогревают в термостате при (55 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.
3.4.5 Приготовление обезжиренного стерильного молока
3.4.5.1. Обезжиренное стерильное молоко получают из цельного молока кислотностью 16 — 18 °T, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454. В пробирки разливают обезжиренное молоко по 10 см3 и стерилизуют при 10^{5}\text{Па }(1\text{атм}) в течение (10 +/- 1) мин.
Допускается использовать препарат СКИВ.
3.4.6 Приготовление контрольного разведения стрептомицина активностью 2,5 мкг/см3 (Ед/г)
3.4.6.1. Контрольное разведение стрептомицина используют для проверки активности роста тест-микроба.
3.4.6.2. Контрольное разведение стрептомицина готовят в фосфатных буферных растворах.
Состав раствора 1: двузамещенный фосфорнокислый калий — 2,0 г, однозамещенный фосфорнокислый калий — 8,0 г, дистиллированная вода — до 1000,0 см3.
В мерной колбе вместимостью 1000 см3 растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают pH раствора по pH-метру, равный (6,1 +/- 0,1), и стерилизуют при температуре (112 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин. Срок хранения раствора — не более 30 сут при температуре (5 +/- 1) °C.
Состав раствора 2: двузамещенный фосфорнокислый калий — 16,73 г, однозамещенный фосфорнокислый калий — 0,523 г, дистиллированная вода — до 1000,0 см3.
В мерной колбе вместимостью 1000 см3 растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают pH раствора по pH-метру, равный (7,9 +/- 0,1), и стерилизуют при температуре (112 +/- 2) °C в течение (30 +/- 1) мин. Срок хранения раствора — не более 30 сут при температуре (5 +/- 1) °C.
3.4.6.3. Контрольное разведение готовят из основного раствора стрептомицина активностью 500 мкг/см3, который получают растворением 5 мг стандарта антибиотика, взвешенного с отсчетом показания весов до 0,1 мг, в буферном растворе 1 по 3.4.6.2. Объем буферного раствора составляет 0,01 активности антибиотика.
Пример: При активности стандарта стрептомицина 760 мкг/мг навеску антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см3 буферного раствора 1 и получают основной раствор активностью 500 мкг/см3.
Основной раствор антибиотика хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой не более 30 сут при температуре (5 +/- 1) °C.
Из основного раствора в трех пробирках готовят серию разведений антибиотика. В первую пробирку наливают 1 см3 буферного раствора 2 по 3.4.6.2 и 1 см3 основного раствора, во вторую — 9 см3 буферного раствора 2 и 1 см3 раствора из первой пробирки, в третью — 9 см3 стерильного обезжиренного молока по 3.4.5 и 1 см3 раствора из второй пробирки. Активность антибиотика в разведениях составляет соответственно 250; 25 и 2,5 мкг/см3. Разведение антибиотика в молоке активностью 2,5 мкг/см3 является контрольным.
Контрольное разведение стрептомицина используют в течение рабочего дня.
3.4.6.4. Взамен контрольного разведения стрептомицина для проверки активности роста тест-микроба могут быть использованы диски со стрептомицином по 3.2.10.
3.4.7 Подготовка проб молока к анализу
Каждую пробу молока наливают по 5 — 10 см3 в чистую стерильную пробирку, прогревают в течение (10 +/- 1) мин на водяной бане при температуре внутри пробирки (87 +/- 2) °C и охлаждают в холодной воде до температуры 18 — 25 °C.
3.5 Проведение анализа
3.5.1. Непосредственно перед исследованием молока на поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 3.4.4, пробойником или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм. Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки (рисунок 1) только в случае использования контрольного разведения антибиотика.
Рисунок 1. Схема вырезания лунок в агаровой среде
3.5.2. В центральную лунку вносят 0,05 см3 контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.3 или в центре чашки на поверхность засеянной агаровой среды помещают диск со стрептомицином по 3.2.10. В лунки, расположенные по окружности чашки, вносят по 0,05 см3 исследуемых проб молока по 3.4.7.
3.5.3. Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение (20 +/- 1) мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55 +/- 1) °C в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.
3.6 Обработка результатов
3.6.1. Результаты анализа оценивают непосредственно после инкубирования. Чашки просматривают в проходящем свете от любого источника света.
Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых испытуемым образцом молока и контрольным разведением антибиотика, измеряют линейкой или на аппарате Микрофот 5ПО-1 по краям окружностей зон.
3.6.2. При отсутствии зон ингибиции контрольного разведения стрептомицина исследования повторяют с использованием вновь приготовленных засеянных чашек по 3.4.4 и контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.
3.6.3. При отсутствии антибиотиков в молоке диаметр зоны ингибиции должен быть менее 12 мм, а при их наличии — 12 мм и более.
3.7 Метрологические характеристики
3.7.1. Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 1.
4. Метод с индикатором бромкрезолпурпуром
4.1 Сущность метода
Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bac. stearothermophilus var. calidolactis C953 от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении окраски — при их наличии.
4.2 Аппаратура, материалы и реактивы
4.2.1. Термостат, позволяющий поддерживать температуру от 30 до 70 °C с допускаемыми отклонениями +/- 0,5 °C от заданной.
4.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16217.
4.2.3. Среда агаровая "Delvotest^{®}" со спорами Bac. stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпуром, фасованная в герметично укупоренные ампулы вместимостью 1,0 см3, собранные в блоки.
4.2.4. Среда питательная таблетированная "Delvotest^{®}" , фасованная в бутылочки из темного стекла с навинчивающимся колпачком.
4.2.5. Шприц-дозатор автоматический вместимостью 1,0 см3, настроенный на объем пробы 0,1 см3.
4.2.6 Наконечники пластмассовые одноразовые, вместимостью 0,1 см3.
4.2.7 Пинцет.
4.2.8. Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже указанных.
4.3 Отбор проб
4.3.1. Отбор проб и подготовка их к анализу — по ГОСТ 9225.
4.3.2. Допускается хранить пробы в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6 +/- 2) °C.
4.4 Подготовка к анализу
4.4.1. Стеклянную бутылочку с питательными таблетками вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре от 15 до 25 °C.
4.4.2. Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое количество ампул (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы хранят в холодильнике.
4.4.3. Отвинчивают колпачок бутылочки и помещают его на стол вниз донышком. Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.
4.5 Проведение анализа
4.5.1 Соединительной частью шприца прокалывают укупорку ампул.
4.5.2. В каждую ампулу пинцетом помещают по одной таблетке питательной среды "Delvotest^{®}" . Бутылочку со средой плотно закрывают колпачком и сохраняют в дальнейшем при комнатной температуре.
4.5.3. Шприцем отбирают 0,1 см3 пробы молока и вносят в ампулу. Для каждой пробы молока используют новый наконечник. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C.
4.5.4. Ампулы "Delvotest^{®}" помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0 +/- 0,5) °C в течение 3 ч.
4.5.5. Контрольное определение проводят в соответствии с 4.5.1; 4.5.2 и 4.5.4. В ампулу вносят 0,1 см3 предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.
4.6 Обработка результатов
4.6.1 Ампулы извлекают из термостата и определяют цвет содержимого.
4.6.2. Желтый цвет содержимого ампул с контрольным и анализируемыми образцами молока свидетельствует об отсутствии в молоке ингибирующих веществ. Фиолетовое кольцо на поверхности содержимого ампулы (размером не более 1 мм) не учитывают.
4.6.3. Фиолетовый цвет содержимого ампул с анализируемым образцом молока свидетельствует о наличии в молоке ингибирующих веществ.
4.6.4. Вывод о наличии в молоке антибиотиков делают после дополнительных исследований молока по ГОСТ 24065 - ГОСТ 24067 и при получении отрицательных результатов.
4.7 Метрологические характеристики
4.7.1. Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 2.
5. Требования безопасности
Работу со споровой культурой тест-микроба в лаборатории проводят в соответствии с санитарными правилами по [1].
[1] СП 1.2.731-99 Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами.