ГОСТ 32012-2012. Межгосударственный стандарт. Молоко и молочная продукция. Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных микроорганизмов
(введен в действие Приказом Росстандарта от 27.06.2013 № 230-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания» (ТР ТС 027/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 16.10.2018 № 168). Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 № 80). Текст данного документа приведен с учетом поправки, опубликованной в «ИУС», № 6, 2019. Документ введен в действие с 01.07.2014.
ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ
flowchart LR n0["ГОСТ 25102-90"]:::rst click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-25102-90" "ГОСТ 25102-90. Межгосударственный стандарт. Молоко и молочные продукты. Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий (утв. и введен в действие Постановлением " n1["ГОСТ Р 54075-2010"]:::rst click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-r-54075-2010" "ГОСТ Р 54075-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Молоко и молочная продукция. Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных микроорганизмов (утв. и введен" n2["ГОСТ 32012-2012"]:::doc click n2 "https://bukva.ai/docs/gost-32012-2012" "ГОСТ 32012-2012. Межгосударственный стандарт. Молоко и молочная продукция. Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных микроорганизмов (введен в действие Приказом Рос" n1 --> n2 n0 --> n1 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
от 27 июня 2013 г. № 230-ст
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СПОР МЕЗОФИЛЬНЫХ АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Milk and milk product. Methods for determination of the spores content of mesophilic anaerobic microorganisms
1 июля 2014 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».
Сведения о стандарте
1. Подготовлен Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМС Россельхозакадемии).
2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии.
3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол от 3 декабря 2012 г. № 54-П).
4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июня 2013 г. № 230-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32012-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.
5. Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 54075-2010.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Настоящий стандарт распространяется на сырое и подвергнутое термизации или низкотемпературной пастеризации молоко, сыры и другую молочную продукцию и устанавливает методы определения в них содержания общего количества спор мезофильных анаэробных микроорганизмов (бактерий) и спор мезофильных лактатсбраживающих анаэробных микроорганизмов (бактерий).
2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия
ГОСТ 490-2006 Кислота молочная пищевая. Технические условия
ГОСТ 745-2003 Фольга алюминиевая для упаковки. Технические условия
ГОСТ 779-55 Мясо — говядина в полутушах и четвертинах. Технические условия
ГОСТ 975-88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4025-95 Мясорубки бытовые. Технические условия
ГОСТ 4147-74 Реактивы. Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия
ГОСТ 4199-76 Реактивы. Натрий тетраборнокислый 10-водный. Технические условия
ГОСТ 4201-79 Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 5556-81 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 9412-93 Марля медицинская. Общие технические условия
ГОСТ 10163-76 Крахмал растворимый. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия
ГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу
ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
ГОСТ 19881-74 Анализаторы потенциометрические для контроля pH молока и молочных продуктов. Общие технические условия
ГОСТ 23683-89 Парафины нефтяные твердые. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия
ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3. ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В настоящем стандарте применены термины, установленные ГОСТ ISO 7218, а также следующие термины с соответствующими определениями:
3.1. общее количество спор мезофильных анаэробных бактерий: Количество микроорганизмов, сохранившихся после тепловой обработки исследуемого продукта или его разведений при температуре (75 +/- 1) °C в течение 30 мин, способных прорастать, размножаться и давать видимые признаки роста в анаэробных условиях на соответствующих основных питательных средах при температуре (37 +/- 1) °C.
3.2. количество спор мезофильных лактатсбраживающих анаэробных бактерий: Количество микроорганизмов, сохранившихся после тепловой обработки исследуемого материала или его разведений при температуре (75 +/- 1) °C в течение 30 мин, способных прорастать, размножаться и давать видимые признаки роста в анаэробных условиях при температуре (37 +/- 1) °C на соответствующих дифференциально-диагностических питательных средах, содержащих в качестве источника углеводного питания только лактаты.
3.3. основная питательная среда (общего назначения): Среда, предназначенная для выращивания различных микроорганизмов.
3.4. дифференциально-диагностическая питательная среда: Среда, предназначенная для разграничения отдельных групп (видов) микроорганизмов.
3.5. сухие питательные среды (СДА, ЛАССА и др.): Порошкообразные или гранулированные питательные среды промышленного производства, отвечающие требованиям соответствующих документов, предназначенные для приготовления рабочих питательных сред, а также среды зарубежного производства, имеющие разрешение на их применение.
3.6. рабочая питательная среда: Среда, приготовленная из одноименной сухой питательной среды или отдельных компонентов и подготовленная для выполнения микробиологических посевов.
3.7. полужидкая (полутвердая) питательная среда: Рабочая питательная среда, содержащая микробиологического агара от 0,3% до 0,8%.
3.8. рабочая питательная среда СДА: Полужидкая основная питательная среда для определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий при контроле молока, сыров и другой молочной продукции.
3.9. рабочая питательная среда ЛАССА: Полужидкая дифференциально-диагностическая питательная среда для определения спор лактатсбраживающих маслянокислых бактерий.
3.10. признак роста: Внешнее изменение питательной среды, свидетельствующее о росте и развитии микроорганизмов.
4. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ
Анализатор потенциометрический для контроля pH по ГОСТ 19881, диапазоном измерения pH 3 — 8, погрешностью измерения pH +/- 0,02.
Весы лабораторные среднего класса точности, с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания +/- 0,01 и +/- 0,1 г.
Термостат жидкостный (редуктазник), позволяющий поддерживать температуру от 25 °C до 55 °C, с отклонением от заданной температуры +/- 1 °C.
Термостат жидкостный, позволяющий поддерживать температуру от 15 °C до 55 °C, с отклонением от заданной температуры +/- 1 °C.
Термостат суховоздушный с естественной или принудительной циркуляцией воздуха, с охлаждением.
Стерилизатор паровой медицинский (автоклав).
Баня водяная с обогревом, позволяющая поддерживать температуру от 0 °C до 100 °C, с отклонением от заданной температуры +/- 2 °C.
Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025.
Термометр стеклянный жидкостный (нертутный) по ГОСТ 28498, диапазоном измерения от 0 °C до 100 °C, ценой деления шкалы 1 °C.
Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание температуры (160 +/- 5) °C.
Анаэростаты или другие устройства, создающие анаэробные условия.
Часы по ГОСТ 27752 или таймер.
Плитка электрическая по ГОСТ 14919.
Холодильник бытовой по ГОСТ 26678.
Емкости металлические или кастрюли, используемые для растворения, расплавления, нагревания или охлаждения питательных сред и воды.
Вспомогательное оборудование для отбора проб: трубка, отборник, шпатель, щуп, ложка, мешалка, нож, пробник.
Фольга алюминиевая по ГОСТ 745.
Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.
Бумага индикаторная универсальная.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Марля медицинская по ГОСТ 9412.
Пипетки 1-1(2)-1 по ГОСТ 29169.
Пипетки 1-1(2)-1(2)-1(2, 5, 25) по ГОСТ 29227.
Колбы мерные 2-50(100, 200, 500, 1000)-2 по ГОСТ 1770.
Колбы конические Кн-2-100(250)-34 ТХС по ГОСТ 25336.
Цилиндры 1(2)-25(50, 100)-1 по ГОСТ 1770.
Пробирки П1, П2-16-150 ТС по ГОСТ 25336.
Пробирки П1, П2-21-200 ТС по ГОСТ 25336.
Стаканчики для взвешивания (бюксы) типов СВ и СН по ГОСТ 25336.
Ступки лабораторные фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147.
Агар микробиологический по ГОСТ 17206.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор объемной долей 20%.
Кислота молочная по ГОСТ 490, раствор объемной долей 20%.
Кальций молочнокислый по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор массовой долей 20%.
Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201, ч.д.а.
Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199, ч.д.а.
Натрий хлористый по ГОСТ 4233.
Натрий тетраборнокислый 10-водный по ГОСТ 4199, ч.д.а.
Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.
Гидролизат белков молока по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Мясо — говядина по ГОСТ 779.
Автолизат дрожжевой сухой по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Глюкоза кристаллическая гидратная по ГОСТ 975.
Крахмал растворимый по ГОСТ 10163.
Кислота аскорбиновая пищевая по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Цистеин солянокислый по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Железо (III) хлорид 6-водный по ГОСТ 4147, ч.д.а.
Индикатор нейтральный красный (нейтральрот) по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Среда сухая для определения спор мезофильных анаэробных бактерий (СДА) по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Среда сухая для определения лактатсбраживающих анаэробных бактерий (ЛАССА) по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Спирт этиловый ректификованный и спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.
Вода питьевая по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Допускается применение других средств измерений, реактивов, по качеству и метрологическим характеристикам не уступающих перечисленным выше.
5. ОТБОР ПРОБ
Отбор проб и подготовка их к анализу — по ГОСТ 13928, ГОСТ 26809.
6. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА СПОР МЕЗОФИЛЬНЫХ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
6.1 Сущность метода
Метод основан на способности спор мезофильных анаэробных микроорганизмов (бактерий), сохранившихся после тепловой обработки исследуемого материала или его разведений при температуре (75 +/- 1) °C в течение 30 мин, прорастать, размножаться и давать видимые признаки роста в питательных средах.
Метод предназначен для оценки сырого молока и выявления источника микробиологической порчи молочных продуктов.
6.2 Подготовка к анализу
6.2.1 Приготовление раствора хлористого натрия (физиологический раствор) для приготовления разведений
В 1 дм3 питьевой воды растворяют 8,5 г хлористого натрия, затем раствор разливают по 10 см3 в чистые стеклянные пробирки диаметром 21 мм, по 93 см3 — в колбы. Емкости закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (20 +/- 5) мин. После стерилизации в пробирках должно остаться около 9 см3, а в колбах — около 90 см3 раствора хлористого натрия.
6.2.2. Приготовление рабочей питательной среды СДА для определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий
6.2.2.1. (50 +/- 5) г сухой среды СДА вносят в 1 дм3 воды, тщательно перемешивают, нагревают и кипятят 3 — 5 мин, не допуская пригорания. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20%-ным раствором гидроокиси натрия или 20%-ным раствором молочной или соляной кислоты до значения (7,3 +/- 0,1) pH. Готовую среду разливают в пробирки по (12 +/- 1) см3, закрывают ватными или ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.
Готовая рабочая питательная среда должна иметь интенсивно-красный цвет.
Готовую рабочую питательную среду хранят в холодильнике при температуре (8 +/- 2) °C не более 1 мес. или при температуре от 18 °C до 23 °C не более 7 сут при условии сохранения внешнего вида среды.
6.2.2.2. Допускается приготовление рабочей питательной среды для определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий из отдельных ингредиентов. Для этого в 1 дм3 питьевой воды вносят 33,3 г гидролизата белков молока, 15,0 г микробиологического агара, 0,5 г солянокислого цистеина или 1,0 г аскорбиновой кислоты, 1,0 г растворимого крахмала и 5,0 г уксуснокислого натрия. Растворяют добавленные компоненты, нагревая смесь в текучем паре. Добавляют 5,0 г глюкозы и 4,0 г сухого дрожжевого автолизата. Устанавливают pH (7,1 +/- 0,1), разливают среду в пробирки по (10 +/- 2) см3, закрывают ватными или ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.
При длительном хранении рабочей питательной среды (более 20 сут) после охлаждения пробирок со средой в стерильных условиях ватные пробки заменяют на стерильные резиновые пробки.
Рабочую питательную среду хранят в холодильнике при температуре (8 +/- 2) °C не более 1 мес. или при температуре от 18 °C до 23 °C не более 7 сут при условии сохранения внешнего вида среды.
6.2.3 Приготовление водного агара
В 1 дм3 питьевой воды вносят 15 г агара и нагревают до кипения. После расплавления агара раствор в горячем состоянии разливают в пробирки по 15 см3 или в колбы по 50 — 100 см3, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.
6.3 Подготовка образцов к анализу
6.3.1 Подготовка образцов сырого молока и жидкой молочной продукции
Пробы жидкой молочной продукции (сырое молоко, восстановленное молоко и другие, аналогичные по консистенции продукты) тщательно перемешивают и отбирают для анализа стерильной пипеткой по 15 см3, переносят в стерильные пробирки, которые закрывают стерильными ватными пробками. При этом необходимо следить, чтобы капельки продукта не попадали на стенки пробирок.
Подготовленные пробирки вместе с контрольной пробиркой, в которой находятся 10 см3 раствора хлористого натрия по 6.2.1 или воды и термометр, помещают в водяную баню. Уровень воды в водяной бане должен быть выше уровня продукта на 10 — 15 мм. Пробирки выдерживают при температуре (75 +/- 1) °C в течение (30 +/- 3) мин, затем быстро охлаждают до комнатной температуры, погружая их в холодную воду.
В зависимости от предполагаемой обсемененности исследуемого жидкого молочного продукта спорами мезофильных анаэробных бактерий из прогретых проб готовят десятикратные разведения в соответствии с требованиями ГОСТ Р 53430.
Допускается приготовление разведений из непрогретых проб продуктов с последующим совместным прогревом проб исходных продуктов и их разведений при температуре (75 +/- 1) °C в течение (30 +/- 3) мин.
6.3.2 Подготовка проб сыра и аналогичной по консистенции молочной продукции
В зависимости от предполагаемой обсемененности исследуемого сыра или иной молочной продукции спорами мезофильных анаэробных бактерий из отобранных проб готовят десятикратные разведения в соответствии с нормативными документами стран, присоединившихся к стандарту.
Подготовленные пробирки с разведениями проб сыра или иной молочной продукции вместе с контрольной пробиркой, в которой находятся термометр и 10 см3 раствора хлористого натрия по 6.2.1 или воды, помещают в водяную баню и выдерживают при температуре (75 +/- 1) °C в течение (30 +/- 3) мин.
6.4 Проведение анализа
6.4.1 Техника посева споровых анаэробных бактерий
Для создания условий развития анаэробных микроорганизмов могут быть использованы следующие приемы:
- посев в высокий столбик рабочей питательной среды;
- культивирование посевов в анаэростатах или других устройствах, создающих анаэробные условия;
- применение специальных реагентов для создания анаэробных условий.
6.4.1.1. Посев анаэробных микроорганизмов проводят в пробирки с рабочей питательной средой, разлитой высоким столбиком.
Непосредственно перед посевом для снижения содержания свободного кислорода рабочие питательные среды кипятят в водяной бане в течение 10 — 20 мин. При кипячении из среды вытесняются газообразные вещества, в том числе кислород.
Пробирки с прокипяченными рабочими питательными средами быстро охлаждают до (40 +/- 1) °C и используют для посева.
Засев рабочей питательной среды проводят соответствующим разведением посевного материала пипеткой. Посевной материал при этом должен свободно вытекать из пипетки без принудительного выдувания.
После проведения посева для уменьшения диффузии кислорода из воздуха рабочие питательные среды сверху заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином, или водным агаром толщиной слоя (1,5 +/- 0,5) см.
При посеве анаэробных микроорганизмов возможно использование анаэробных инкубаторов или настольных анаэробных систем с газогенераторными пакетами.
6.4.2 Посев и культивирование
Для определения количества спор мезофильных анаэробных бактерий проводят посев 1 см3 подготовленной пробы (для молока — нулевое, первое и второе, для сыра — первое и второе разведения; для других молочных продуктов — в зависимости от предполагаемого уровня обсемененности) в пробирку с 10 — 12 см3 рабочей питательной среды, приготовленной по 6.2.2 или 6.2.3, выдержанной перед анализом в кипящей водяной бане в течение 30 мин и охлажденной до температуры (40 +/- 1) °C.
Каждое из выбранных разведений исследуемого продукта засевают в две пробирки с рабочей питательной средой, внося посевной материал на дно пробирки, не допуская взбалтывания среды и не выдувая посевной материал.
Сверху посевы заливают слоем вазелинового масла или парафина, или водного агара по 6.2.3, предварительно расплавленного до температуры (45 +/- 1) °C. Высота слоя должна быть не менее (1,5 +/- 0,5) см.
При использовании для посева пробирок с рабочей питательной средой, разлитой высоким столбиком, допускается не заливать посевы защитным слоем вазелинового масла или парафина, или водного агара.
Пробирки с посевом помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 72 ч.
6.5 Обработка результатов
Наличие спор мезофильных анаэробных бактерий в засеянных объемах исследуемого продукта определяют по изменению окраски среды с красной на желтую и газообразованию (появлению разрывов агарового столбика).
В посевах без защитного слоя рост мезофильных анаэробных бактерий определяют по пенообразованию, образованию «карманов» в столбике рабочей питательной среды и изменению цвета рабочей питательной среды с красного на желтый. В данном случае основным признаком роста является изменение окраски, так как процесс газообразования может быть не зафиксирован.
Наиболее вероятное число (НВЧ) спор мезофильных анаэробных бактерий при анализе определяют по числу пробирок, в которых они дали рост согласно таблице 1.
Результаты, в которых количество пробирок с видными признаками роста мезофильных анаэробных бактерий при посевах 1; 0,1 и 0,01 см3 молока или сыра, соответственно, равно 002, 012, 021, 022, 102, 112, 122, не могут быть использованы для расчета, так как в 95% случаев они вызваны несовершенной техникой приготовления разведений или присутствием антибактериальных веществ. В данных случаях исследования повторяют.
Признаки роста споровых анаэробных бактерий на среде СДА представлены в Приложении А.
7. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА СПОР МЕЗОФИЛЬНЫХ ЛАКТАТСБРАЖИВАЮЩИХ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
7.1 Сущность метода
Метод основан на способности спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов (бактерий), сохранившихся после тепловой обработки исследуемого материала или его разведений при температуре (75 +/- 1) °C в течение 30 мин, прорастать, размножаться и давать видимые признаки роста в соответствующих дифференциально-диагностических питательных средах.
Метод предназначен для оценки сыропригодности сырого молока или выявления источника микробиологической порчи молочной продукции, в том числе сыров.
7.2 Подготовка к анализу
7.2.1. Растворы хлористого натрия и водного агара готовят по 6.2.1, 6.2.3.
7.2.2 Приготовление мясо-пептонного бульона
Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю; заливают двойным количеством питьевой воды, отмечают первоначальный объем и поставляют на 18 — 24 ч при температуре (5 +/- 1) °C. После этого для ускорения процесса экстракции питательных веществ из мяса содержимое кастрюли подогревают до температуры (50 +/- 5) °C, выдерживают в течение 60 мин и затем кипятят 30 — 40 мин. После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный фильтр. Фильтрат доводят питьевой водой до первоначального объема, добавляют к нему (1,0 +/- 0,1)% бактериологического пептона и (0,5 +/- 0,1)% хлористого натрия и устанавливают с помощью раствора гидроокиси натрия массовой долей 20% активную кислотность (7,3 +/- 0,1) pH. Подготовленный бульон стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.
7.2.3. Приготовление рабочей питательной среды ЛАССА для определения количества спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих бактерий
7.2.3.1. (50 +/- 5) г сухой среды ЛАССА вносят в 1 дм3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают, нагревают и кипятят 3 — 5 мин, не допуская пригорания. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20 — 30%-ным раствором гидроокиси натрия или 20%-ным раствором молочной кислоты до значения (5,7 +/- 0,1). Полученную рабочую питательную среду разливают в пробирки по (12 +/- 1) см3, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.
7.2.3.2. Допускается приготовление рабочей питательной среды для определения количества спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих бактерий из отдельных ингредиентов.
Для этого к 900 см3 мясо-пептонного бульона, приготовленного по 7.2.2, добавляют 5,0 г молочнокислого кальция, 5,0 г уксуснокислого натрия, 0,8 г солянокислого цистеина или 1,0 г аскорбиновой кислоты, 4,0 г сухого дрожжевого автолизата и 20,0 г агара.
Смесь нагревают до температуры (95 +/- 2) °C, выдерживают при постоянном помешивании до расплавления агара и добавляют 10 см3 0,01%-ного раствора треххлористого железа, 10 см3 0,01%-ного раствора тетраборнокислого натрия, 10 см3 1%-ного раствора кислого углекислого натрия и 1 см3 0,4%-ного раствора индикатора нейтрального красного. С помощью раствора 20%-ной молочной кислоты доводят активную кислотность до (5,70 +/- 0,05) pH. Приготовленную смесь разливают в пробирки по 10 — 12 см3, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин. Затем в стерильных условиях ватные пробки заменяют на стерильные резиновые.
Готовая рабочая питательная среда должна иметь интенсивный малиново-красный цвет.
Допускается замена мясо-пептонного бульона гидролизатом казеина и пептоном. Для этого к 1 дм3 гидролизата казеина добавляют 10 г пептона, устанавливают pH (7,0 +/- 0,1), нагревают до кипения, фильтруют через бумажный фильтр в чистые колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин.
7.3 Проведение анализа
7.3.1 Подготовку образцов проводят по 6.3.
7.3.2. Посев образцов проводят по 6.4.1 и 6.4.2, используя рабочую питательную среду для определения лактатсбраживающих анаэробных бактерий.
Культивирование посевов проводят в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 72 ч.
7.4 Обработка результатов
7.4.1. Рост мезофильных лактатсбраживающих анаэробных спорообразующих бактерий в посевах определяют по изменению цвета рабочей питательной среды с малиново-красного до соломенно-желтого и газообразованию (образованию разрывов столбика агара).
7.4.2. Определение наиболее вероятного числа спор мезофильных лактатсбраживающих анаэробных бактерий проводят по 6.5.
Признаки роста споровых анаэробных лактатсбраживающих бактерий на среде ЛАССА представлены в Приложении Б.
А.1. Признаки роста споровых анаэробных бактерий представлены на рисунке А.1.
- среда без признаков роста;
- среда с признаками ростаБ.1. Признаки роста споровых анаэробных бактерий представлены на рисунке Б.1.
- среда без признаков роста;
- среда с признаками роста