Временные методические указания по определению актеллика в биологическом материале хроматографическими методами

(утв. Минздравом СССР 21.11.1985 № 4038-85)

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ АКТЕЛЛИКА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

(Дополнение к № 2085-79)

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Агропрома СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Срок действия временных методических указаний устанавливается до утверждения гигиенических регламентов.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками Госагропрома СССР.

Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Марциновского Е.И. и Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.

1. Краткая характеристика пестицида

Актеллик (пиримифос-метил), его активное вещество — 0,0-диметил-0-(2-диетиламино-6-метилпиримидил-4)-тиофосфат.

Структурная формула:

H C
 3  //\   OP(OCH )

//	\ /	3 2 S

  N\\  /N
    \\/

C H -N-C H

     2 5    2 5

    Эмпирическая формула: C  H  O N PS.

                       11 20 3 3

Молекулярная масса: 305,35.

Актеллик представляет собой светло-желтую жидкость, температура плавления 15 — 18 °С. Разлагается сильными кислотами, щелочами, а также при температуре 100 °С.

Актеллик хорошо растворяется во многих органических растворителях и -4 слабо в воде. Давление пара 1,1 х 10 мм рт. ст. при 30 °С. Показатель 25 преломления — n = 1,527.

Применяется в виде порошка, содержащего 2% актеллика; 25-процентного концентрата эмульсии — «Актеллик 25 ЕС» (jF 2520); 50-процентного концентрата эмульсии — «Актеллик 50 ЕС» (jF 2764).

Актеллик эффективен против вредителей хлебных злаков; рекомендован для борьбы с эктопаразитами птиц. Он отличается быстрым проявлением инсектицидной активности при сравнительно невысокой норме его расхода.

Актеллик мало токсичен. При внесении внутрь крысам ЛД — 2050 мг/кг. 50 При нанесении на кожу ЛД — 2000 мг/кг. Он не кумулируется в жировых 50 тканях. МДУ актеллика в мясе и яйцах кур не установлен.

Допустимая суточная доза актеллика для человека установлена на уровне 0,01 мг/кг массы тела в сутки, что составляет примерно 0,5 — 0,7 мг/человека/сутки (данные ФАО/ВОЗ).

2. Методика определения актеллика

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Метод основан на извлечении актеллика из исследуемой пробы смесью ацетона и воды (1:1), очистке экстракта и определении методом хроматографии в тонком слое с энзимным проявлением либо методом газожидкостной хроматографии.

2.1.2 Метрологическая характеристика метода (приведена в таблице).

Таблица

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

Метод анализа	Наименование объекта	Диапазон определяемых концентраций, мкг	Нижний предел обнаруж., мг/кг	Среднее значение определ., %	Стандартное откл.	Доверительный интервал среднего, %
Энзимо-хроматографический Газожидкостная хроматография	Мясо кур Яйца кур Мясо кур Яйца кур	0,005 — 0,1 -«- 0,0001 — 0,002»	0,02 -«- 0,001 -»-	78 65 80 68	4,0 3,1 2,6 3,2	78 +/- 6,1 65 +/- 5,2 80 +/- 3,2 68 +/- 5,4

2.2. Реактивы и растворы

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Натрий сернокислый безводный, ч.д.а., ГОСТ 4166-76.

Бром, ч., ГОСТ 4109-74.

Силикагель марки КСК, ГОСТ 3956-77, дробленый и просеянный через сито 100 меш, или пластинки «Силуфол».

    Кальций  сернокислый (CaSO  х 2H O),  ч.д.а., ГОСТ 3210-77, просушенный
                              4     2

в шкафу при температуре 160 °С в течение 6 часов.

Индоксилацетат, ч.д.а., ТУ 6-09-07-1156-78, или фирмы «Хемапол» (Чехословакия).

Буферный раствор (рН = 8,69). К 2,1 мл ортофосфорной кислоты прибавляют 2,3 мл уксусной и 2,47 г борной кислот, доводят дистиллированной водой до 1 л. Для получения буфера с рН = 8,69 к 100 мл указанной смеси прибавляют 65 мл 0,2 н раствора едкого натра.

Уксусная кислота, х.ч., ГОСТ 18290-72.

Ортофосфорная кислота, х.ч., ГОСТ 6552-80.

Борная кислота, х.ч., ГОСТ 9656-75.

Натрий серноватистокислый, ч.д.а., 0,1 М водный раствор.

Калий железосинеродистый, х.ч., ГОСТ 4206-75, 1,6-процентный водный раствор.

Калий железистосинеродистый, х.ч., ГОСТ 4207-75, 2-процентный водный раствор.

Этиловый спирт, 96%, ТУ 6-09-1710-77.

Ферментный препарат получают из печени крупного рогатого скота. Свежую, однократно замороженную и сохраняемую в дальнейшем в холодильнике печень можно использовать в течение 6 месяцев.

Для приготовления ферментного раствора 1 г печени гомогенизируют с 9 мл буферного раствора и фильтруют через вату. К 1 мл полученной сыворотки прибавляют 4 мл буферного раствора. Этот раствор используют для опрыскивания пластинок. Раствор готовят непосредственно перед обработкой.

Основной стандартный раствор «А» актеллика, концентрация 100 мкг/мл.

Рабочие стандартные растворы «Б» — 5,0 мкг/мл и «В» — 1,0 мкг/мл готовят разбавлением основного стандартного раствора в ацетоне.

Проявляющий раствор. 10 мг индоксилацетата растворяют в 6 мл этанола, прибавляют 6 мл буферного раствора рН = 8,69, 2 мл железосинеродистого и 2 мл железистосинеродистого калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед обработкой пластинок.

2.3. Приборы и посуда

Баня водяная, ТУ 64-1-2850-76.

Воронки фильтровальные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные емкостью 1000 мл, 500 мл, ГОСТ 8613-75.

Испаритель ротационный с набором колб, тип ИР-1М, ТУ 25-11-917-76.

Камера для хроматографирования, ГОСТ 10585-75.

Камера для опрыскивания, ТУ 25-11-430-70.

Колбы мерные емкостью 25, 50, 100, 1000 мл, ГОСТ 1770-74.

Колба Бунзена, ГОСТ 6514-75.

Пластинки стеклянные, 9 х 12 см.

Пробирки мерные на шлифах емкостью 5 — 10 мл, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1 мл, 5 мл, 10 мл, ГОСТ 1770-74.

Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 10391-74.

Микрошприц емк. 10 мкл, МШ-10, ТУ 5Е-2.833.024, или микропипетка на 0,1 мл, ГОСТ 1770-74.

Ступка керамическая, d = 10 см.

Шкаф сушильный, ТУ 64-1-1411-76.

Хроматограф «Цвет-164» с пламенно-фотометрическим детектором (или «Цвет-106» с термоионным детектором).

2.4. Подготовка к определению

2.4.1 Приготовление пластинок

Для приготовления пластинок берут 35 г силикагеля «КСК», 2 г сернокислого кальция и 90 мл дистиллированной воды. Силикагель с гипсом растирают в фарфоровой ступке, прибавляют воду и размешивают до образования однородной массы. 10 г суспензии наносят на пластинку и равномерно распределяют по поверхности. Сушат пластинки в горизонтальном положении в течение 18 — 20 часов при комнатной температуре, хранят в эксикаторе.

2.4.2 Подготовка проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», утв. № 2051-79 от 21.09.1979.

2.5. Проведение определения

2.5.1 Экстракция и очистка экстракта

Навеску анализируемого объекта (20 г мяса кур или 5 г желтка яйца) тщательно измельчают (желток перемешивают) и помещают в коническую колбу, приливают 20 мл смеси ацетона и воды (1:1) и экстрагируют в течение 1 часа при перемешивании пробы. Экстракцию повторяют дважды по 30 мин. в тех же условиях. Фильтруют пробы через бумажный фильтр (синяя лента) на воронке Бюхнера либо через стеклянный фильтр Шотта № 4. Экстракт помещают в холодильник на 2 часа. Фильтруют экстракт, фильтр промывают смесью ацетона и воды (1:1). Объединяют фильтраты, прибавляют дистиллированную воду (100 мл). Проводят переэкстракцию пестицида в н-гексан. Для этого к ацетоно-водному экстракту добавляют 30 — 40 мл н-гексана и встряхивают 2 — 3 мин. После разделения слоев гексановый отделяют, а к ацетоно-водному прибавляют такое же количество н-гексана, как указано выше. Встряхивают снова 2 — 3 мин. и слои разделяют. Переэкстракцию в н-гексан повторяют еще раз. Гексановые экстракты объединяют, сушат безводным сернокислым натрием и упаривают до небольшого объема (1 — 2 мл) на ротационном испарителе. Из данного объема аликвотную часть (10 — 30 мкл) наносят на пластинку или 3 — 5 мкл вводят в газовый хроматограф.

2.5.2 Определение энзимно-хроматографическим методом

    На  пластинку,  покрытую  тонким  слоем  силикагеля, или  на  пластинку
"Силуфол"  на  расстоянии 1,5 см от нижнего и бокового краев наносят 5 - 10
мкл  стандартного  раствора  актеллика  с  концентрацией  5,0  мкг/мл,  что
соответствует  0,02 - 0,05 мкг действующего начала. На расстоянии 1,5 - 2,0
*см*  от  точки  нанесения стандартного раствора наносят анализируемую пробу.

Производят хроматографирование в системе растворителей н-гексана + ацетон =

9:1.  Сушат  пластинку  на  воздухе  и  активируют  парами брома. Для этого
пластинку  на  1  мин. помещают в эксикатор, насыщенный парами брома. После
удаления  избытка  брома  с пластинки (~ 60 мин.) производят ингибирование.
Для  этого пластинку опрыскивают свежеприготовленным ферментным раствором и
инкубируют  в  течение  40 - 60 мин. в насыщенном водными парами термостате
при  температуре  38  °С.  Для увлажнения в термостате ставят чашку Петри с
водой.   После   инкубации   пластинку  опрыскивают  проявляющим  раствором

(индоксилацетат) и снова помещают пластинку в термостат, нагретый до 38 °С,

на  2  -  3  мин. Актеллик проявляется в виде белых пятен на голубом фоне с
величиной R  = 0,52.

       f

Количественное определение производят путем сравнения площади пятна с наиболее близкой к ней по величине площадью стандарта.

Содержание препарата в пробе (мг/кг) рассчитывают по формуле:

                           А х S  х Y х 1000
                                2

Х = -----------------,

                                  Р х S  х Y
                                       1    1

где:

А — количество препарата в стандарте, мкг;

S — площадь пятна стандарта, кв. мм; 1

S — площадь пятна пробы, кв. мм; 2

Y — объем экстракта, нанесенного на пластинку, мкг; 1

Y — общий объем экстракта, мл;

Р — масса пробы, взятой для анализа, г.

2.5.3 Определение методом газожидкостной хроматографии

Из подготовленного экстракта пробы отбирают аликвотную часть (3 — 5 мкл) и вводят в испаритель хроматографа.

Условия хроматографирования: хроматограф с пламенно-фотометрическим детектором:

стеклянная колонка длиной 100 см и диаметром 3 мм, заполненная 5% SE-30 на хроматоне N-AW-ДМСS (0,16 — 0,20 мм). Температура испарителя — 220 °С, температура колонки — 190 °С;

скорость газа-носителя (азота) — 40 мл/мин.;

скорость водорода — 66 мл/мин.;

скорость воздуха — 120 мл/мин.;

время удерживания актеллика в указанных условиях — 4 мин. 35 сек.; 8

входное сопротивление — 10 Ом; -2

шкала множителя — 4 х 10 в; -10

шкала по току — 4 х 10 А;

скорость движения ленты самописца — 240 мм/ч.

Условия хроматографирования при использовании хроматографа с термоионным детектором приведены в сборнике «Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде», ч. XI, 1981 г., с. 296 — 303.

Содержание препарата в пробе (мг/кг) рассчитывают по формуле:

                               Н  х Y  х А х Y
                                2    1        3

Х = ----------------,

                                 Н  х Y  х Р
                                  1    2

где:

А — количество препарата в стандарте, мкг/мл;

Н — высота пика стандарта, мм; 1

Н — высота пика препарата в пробе, мм; 2

Y — объем стандартного раствора, введенного в хроматограф, мкл; 1

Y — объем анализируемого раствора, введенного в хроматограф, мкл; 2

Y — объем экстракта пробы для анализа, мл; 3

Р — навеска пробы, г.

2.6. Обработка результатов анализа приведена в разделах 2.5.2 и 2.5.3.

3. Требования техники безопасности

Соблюдать требования техники безопасности, обычно рекомендуемые для работы с органическими растворителями, бромом.

4. Настоящие Методические указания подготовлены: Н.И. Киселевой и С.И. Гнед (ВНИИГИНТОКС, г. Киев).

5. Дополнение

Настоящие Методические указания рекомендуются в дополнение к «Энзимно-хроматографическому методу определения фосфорорганических пестицидов в растительных продуктах и биосубстратах», разработанному М.В. Письменной (ВНИИГИНТОКС, г. Киев), утв. 19 октября 1979 г. за № 2086-79, и к «Методическим указаниям по определению актеллика в растительном материале, в почве и в воде хроматографией в тонком слое и на газовом хроматографе», разработанным Т.М. Петровой, Ю.Б. Андреевым (ВНИИ защиты растений, г. Ленинград), Красных А.А. (Всероссийский НИИ защиты растений, пос. Рамонь Воронежской обл.), утв. 19 октября 1979 г. за № 2085-79.

6. Методические указания апробированы в институтах: Всесоюзный институт защиты растений, г. Ленинград (Петрова Т.М.); Всесоюзный институт экспериментальной ветеринарии, г. Москва (Полякова В.Н.).

---