МУК 4.2.3964-23. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы лабораторных исследований объектов окружающей среды и биологического материала человека на наличие ооцист криптоспоридий. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 04.12.2023)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 4 декабря 2023 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ

И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ЧЕЛОВЕКА НА НАЛИЧИЕ ООЦИСТ КРИПТОСПОРИДИЙ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3964-23

Дата введения 4 декабря 2023 года

1. Разработаны ФБУН «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора (И.В. Хуторянина, Т.И. Твердохлебова, Е.Б. Романова, О.С. Думбадзе, М.П. Черникова, Л.Л. Димидова, В.В. Агафонова); ФБУН «Тюменский научно-исследовательский институт краевой инфекционной патологии» Роспотребнадзора (Т.Ф. Степанова, М.И. Беляева); ФБУН «Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора (О.Е. Троценко, А.Г. Драгомерецкая, Л.А. Бебенина); ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (М.В. Зароченцев, Т.Г. Сыскова); ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» ФМБА России (С.М. Юдин, М.М. Асланова); ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России (Т.В. Гололобова); Управлением Роспотребнадзора по Ростовской области (Е.В. Ковалев, Е.Г. Ерганова, Н.В. Леоненко, Г.В. Портнова); Управлением Роспотребнадзора по Карачаево-Черкесской Республике (С.В. Бескакотов, К.Х. Болатчиев); ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области» (Г.В. Карпущенко, Г.В. Стрельникова).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 4 декабря 2023 г.

3. Введены впервые.

I. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают методы лабораторного контроля по определению ооцист криптоспоридий в объектах окружающей среды и биологическом материале человека в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <1>, а также методическими документами <2>.

<1> Глава XLIII СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный № 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 № 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный № 67587); от 25.05.2022 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный № 68934) (далее — СанПиН 3.3686-21).

<2> МУК 4.2.1884-04 «Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов»; МУК 4.2.2959-11 «Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения»; МУК 4.2.3963-23 «Бактериологические методы исследования воды» (вступает в силу с 01.01.2024); МУК 4.2.2314-08 «Методы санитарно-паразитологического анализа воды»; МУК 4.2.3145-13 «Лабораторная диагностика гельминтозов и протозоозов» (далее — МУК 4.2.3145-13); МУК 4.2.3533-18 «Иммунологические методы лабораторной диагностики паразитарных болезней».

1.2 МУК носят рекомендательный характер.

II. Общие положения

2.1. Криптоспоридиоз <3> - протозойное заболевание человека и животных, вызываемое кокцидиями семейства Cryptosporidiidae (Leger, 1911). Основной механизм передачи инфекции — фекально-оральный. Заражение происходит при непосредственном контакте с инфицированным человеком или животным, а также с объектами внешней среды (чаще водой), контаминированными криптоспоридиями.

<3> Код А07.2 — криптоспоридиоз по Международной классификации болезней МКБ-10.

2.2. Возбудителями протозойной инфекции являются облигатные внутриклеточные паразиты криптоспоридии (Cryptosporidium) из типа Apicomplexa, принадлежащие к классу споровиков (Sporozoasida), подклассу кокцидий (Coccidiasina). Основными видами криптоспоридий, инфицирующих человека, является зоонозный вид Cryptosporidium parvum (поражает человека и животных) и антропонозный вид — Cryptosporidium hominis, также у больных ВИЧ/СПИД были выделены C. baileyi.

2.3. В организме человека и животных возбудители кишечных протозоозов паразитируют в вегетативной форме. Попадая во внешнюю среду (почва, песок, сточные воды очистных сооружений канализации и их осадки, донные отложения, вода питьевого и хозяйственно-бытового водоснабжения, вода плавательных бассейнов и аквапарков, вода поверхностных открытых водоемов), они формируют цистные формы, способные сохранять жизнеспособность в течение нескольких недель, а иногда и нескольких месяцев. Заражение происходит при попадании ооцисты вместе с водой или пищей в пищеварительный тракт. Весь жизненный цикл паразита протекает в организме единственного хозяина (животного или человека), который выделяет инвазионные ооцисты с испражнениями.

2.4. Механизм передачи заболевания — фекально-оральный. Больной человек или животное с криптоспоридиозом являются источниками инфекции. Факторы передачи — питьевая вода, молоко и молочные продукты, контаминированные ооцистами криптоспоридий. Также инфицирование может происходить через воду (в том числе плавательных бассейнов) или контактным путем (через грязные руки). Можно заразиться от животных: собак, кошек, телят, ягнят, козлят, поросят, жеребят, кроликов, грызунов, а также от домашних и диких птиц. Максимальная инфицированность животных отмечается в теплый период года, когда температура окружающего воздуха благоприятствует длительному сохранению жизнеспособности ооцист во внешней среде.

2.5. Попав в организм человека, возбудитель поселяется в тонкой кишке и обрастает паразитофорной вакуолью. Инкубационный период составляет 5 — 15 дней. Начало болезни чаще всего острое. Отмечаются схваткообразные боли в животе, тошнота, рвота, частый водянистый стул, лихорадка, головная боль. Продолжительность заболевания в среднем составляет 5 — 7 дней и при отсутствии иммунодефицита заканчивается спонтанным выздоровлением. У маленьких детей и иммуноскомпрометированных лиц криптоспоридиоз может протекать в тяжелой форме. У больных ВИЧ/СПИД регистрируются более тяжелые формы криптоспоридиоза, характеризующиеся выраженной диареей (до 20 раз в сутки и более) и высоким риском развития тяжелых осложнений (гиповолемический шок).

Диагноз основывается на обнаружении ооцист в фекалиях. При этом следует учитывать, что ооцисты выделяются с периодичностью 1 раз в 10 — 14 дней.

2.6. В группу риска входят дети раннего возраста; туристы, посещающие страны с неблагополучными санитарными условиями жизни (криптоспоридии — одна из причин так называемой диареи путешественников); лица с иммунодефицитом; беременные; ветеринары и зоотехники. Уязвимы люди, пострадавшие от радиации.

2.7. Ооцисты криптоспоридий имеют округлую форму, покрыты тонкой оболочкой, размер 2,5 — 10 мкм. Кислотоустойчивы, хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. Малые размеры, позволяющие возбудителю проходить через многие фильтры, а также устойчивость к хлорированию, способствуют реализации водного пути передачи инфекции.

2.8 Особенностями криптоспоридиоза являются:

• убиквитарное распространение;
• возможность одномоментного заболевания сотен людей (вспышечный характер заболеваемости);
• устойчивость Cryptosporidium spp. к большинству дезинфицирующих средств, которые используются для обработки питьевой воды (а также в плавательных бассейнах и аквапарках), обеззараживания эндоскопического оборудования в медицинских организациях;
• развитие тяжелой диареи у пациентов с иммунодефицитом (например, ВИЧ/СПИД, химиотерапия рака, трансплантация органов);
• малая инфицирующая доза — 20 — 30 ооцист Cryptosporidium spp.;
• длительная жизнеспособность возбудителей в водной среде;
• трудности лабораторной идентификации паразитов.

III. Отбор, хранение и подготовка проб к исследованию <4>

<4> Примечание: оборудование, лабораторная посуда, материалы и реактивы приведены в приложении 1 к настоящим МУК.

Отбор проб объектов окружающей среды

3.1. Отбор проб почвы, песка, воды систем централизованного и нецентрализованного питьевого водоснабжения, воды поверхностных водных объектов, морской воды, воды плавательных бассейнов и аквапарков, сточных вод и их осадков, смывов с рук и поверхностей предметов осуществляется для исследования на наличие ооцист криптоспоридий <5>.

<5> Приложение 36 к СанПиН 3.3686-21.

Отбор проб почвы, песка, донных отложений, осадков сточных вод

3.2. Периодичность (частота) исследования зависит от цели лабораторного контроля. Отобранные пробы объектов внешней среды этикетируют с указанием места отбора, даты, характера исследуемого участка и доставляют в лабораторию.

3.3. Отбор проб почвы, песка на обследуемой территории производят из пробных площадок (размером 5 x 5 м), количество которых закладывается с учетом эпидемиологической значимости объекта и его общей площади. Объединенная проба весом 200 г состоит из 10 точечных проб каждая массой 20 г. Точечные пробы отбирают на пробной площадке методом конверта, по диагонали или любым другим способом с таким расчетом, чтобы каждая проба представляла собой часть почвы, типичной для генетических горизонтов или слоев данного типа. Точечные пробы отбирают ножом, совком или шпателем из прикопок или почвенным буром (Некрасова) послойно с поверхности и глубины 10 — 20 см. При необходимости отбор проб проводят из более глубоких (40 — 60 см) слоев почвы послойно. Пробы помещают в банки с крышками или пакеты из полиэтилена, пластика.

3.4. Анализ проб почвы проводят в день доставки их в лабораторию. При невозможности немедленного проведения исследований пробы почвы хранят в холодильной камере при температуре плюс 5 (+/- 2) °C не более 7 суток.

3.5. При необходимости хранения проб более 1 месяца почву пересыпают в кристаллизатор и применяют один из консервирующих растворов:

• жидкость Барбагалло — раствор формалина с физиологическим раствором (3 мл формалина 40%-го, 97 мл физиологического раствора или 30 мл формалина 40%-го, 1 л дистиллированной воды, 8,5 г хлорида натрия);
• раствор формалина 4%-й;
• смесь раствора формалина 4%-го с равным количеством глицерина;
• раствор уксусной кислоты 3 — 10%-й;
• 3%-й раствор соляной кислоты.

Затем хранят в холодильнике при температуре плюс 5 (+/- 2) °C.

3.6. Перед исследованием объединенную пробу почвы рассыпают на бумаге или кальке, разминают пестиком крупные комки, выбирают из нее, например, корни растений, камни, насекомых, стекло, уголь, кости животных. Затем почву переносят в ступку, растирают пестиком и просеивают через сито с ячейками диаметром 1 мм.

3.7. Отбор проб донных отложений поверхностных водоемов. Для отбора проб применяют различные системы пробоотборников: дночерпатели, драги и трубки различных конструкций. Отбор проб донных отложений ручным или механизированным способом проводят с берега или с различных плавсредств. Пробы объемом 200 г помещают в широкогорлые стеклянные или пластиковые емкости с крышками и хранят в холодильнике при температуре плюс 5 (+/- 2) °C не более 7 суток <6>.

<6> ГОСТ Р 70151 «Качество воды. Отбор проб для проведения паразитологических исследований», введенный приказом Росстандарта от 17.06.2022 № 482-ст (далее — ГОСТ Р 70151).

3.8. Отбор проб «сырых» (97 — 98% влажности) осадков сточных вод из первичных и вторичных отстойников, а также с иловых площадок очистных сооружений производят с помощью черпака или кружки отдельными порциями по 100 — 200 мл и сливают в широкогорлые стеклянные или пластиковые сосуды объемом 1 л с притертыми или завинчивающимися крышками и хранят в холодильнике при температуре плюс 5 (+/- 2) °C не более 7 суток.

3.9. Отбор проб обезвоженных (до 70% влажности) осадков сточных вод производят совком или лопатой навесками по 50 г с 4 — 5 мест иловых площадок (2 — 3-летнего выдерживания осадка), компостных бургов; объединяют в одну пробу массой 200 г. Пробы помещают в пластиковые пакеты или банки с крышками и хранят в холодильнике при температуре плюс 5 (+/- 2) °C не более 7 суток.

Отбор проб различных видов вод

3.10. Отбор проб воды с объекта (точка отбора пробы воды) проводят несколькими способами.

3.10.₁. С каждой точки отбора пробы воды обследуемого объекта отбирают непосредственно в закрывающиеся емкости от 10 до 50 л (например, фляги, бутыли, канистры), пригодные для обеззараживания дезинфицирующими средствами и доставки этих объемов воды для исследования в лабораторию.

3.10.2. С последующим концентрированием проб с применением коагулянтов: сульфата алюминия, сульфата железа, сульфата меди из расчета 0,1 — 0,5 г/л непосредственно на обследуемом объекте. Отстаивают в течение 40 — 50 мин, затем надосадочную жидкость сливают, а осадок переливают в емкости с завинчивающейся крышкой, маркируют и доставляют в лабораторию.

3.10.3. С помощью фильтровальных приборов на объектах водозабора и доставкой на исследование в лабораторию концентрированного осадка на мембранных или порошковых фильтрах.

3.11. Отбор пробы воды водоочистных станций хозяйственно-питьевого водоснабжения проводят перед подачей в распределительную сеть из крана с применением гибких шлангов, водораспределительных сеток, насадок. Объем пробы — 50 л. При отборе проб воды с концентрированием осадка на фильтрах применяют насадки аппаратов напорного фильтрования, напор воды при этом регулируют с таким расчетом, чтобы он был достаточным для фильтрации через мембранные фильтры. Из систем нецентрализованного питьевого водоснабжения отбирают пробы воды объемом 50 л.

3.12. Отбор проб воды питьевой на объектах транспорта (железнодорожном, водном, автобусном) осуществляют в точках водоразбора. Объем пробы — 50 л.

3.13. Отбор проб воды природных биотопов (вода поверхностных водоемов, прибрежные воды морей и рекреационных зон), воды плавательных бассейнов и аквапарков проводят с поверхностного и глубинного слоев. Объем отбираемых проб: в природных биотопах — 25 л, в бассейнах и аквапарках — 50 л, поливной воды — 50 л.

3.14. Отбор проб сточных вод проводят в местах до проведения очистки (при необходимости расчета эффективности дегельминтизации и дезинвазии), в местах после проведения очистки. Количество сточных вод на одну пробу до очистки — не менее 10 л, сточных вод после очистки — 25 л.

3.15. Емкости с пробами воды маркируют в соответствии с актом отбора проб и доставляют в лабораторию в течение 24 ч. Допускается хранение проб разных видов вод до начала исследований в течение 48 ч при температуре плюс 15 — 25 °C. Концентраты проб можно хранить в холодильнике при температуре плюс 5 (+/- 3) °C не более 4 суток <7>.

<7> ГОСТ Р 70151.

Отбор проб смывов с поверхностей предметов

3.16. Смывы берут с оборудования, инвентаря, предметов обихода, инструментов, одежды, игрушек, поручней, а также с рук детей, персонала организаций для детей.

3.17. Для отбора смывов применяют кисточки из натурального или искусственного сырья, смоченные в 1%-м растворе едкого натра, или в 10%-м растворе глицерина. В центрифужные пробирки наливают до половины объема 10%-й раствор глицерина. Для каждой группы предметов берут отдельную пробирку и кисточку, которые нумеруют (номер кисточки и пробирки должны совпадать). В одну пробу (в пробирку) собираются смывы с нескольких однородных предметов.

3.18. При взятии смывов с поверхностей кисточкой, смоченной в растворе, многократно и с нажимом проводят по поверхности однородных предметов обследуемого объекта (например, стулья, столы, подоконники, ручки дверей). Кисточку в процессе отбора тщательно ополаскивают в пробирке и вновь делают смывы с поверхности предметов. Площадь исследуемой поверхности для одной пробы смывов составляет не менее 0,25 м2 (0,5 x 0,5 м); для одной пробы смывов с однородных предметов обрабатывают не менее 10 экземпляров (например, тарелки, куклы, ручки дверей). После отбора проб пробирки с вложенными в них кисточками в штативах доставляются в лабораторию.

3.19. Для взятия смывов с поверхностей используют моющий пылесос. Обеззараженные съемные части моющего пылесоса заправляют питьевой водой, добавляют в нее моющее средство из расчета 5 — 10 капель средства на каждые 10 л воды и пылесосят исследуемые объекты по группам или подряд в режиме влажной уборки. Моющий раствор из пылесоса процеживают от грубых загрязнений в чистую емкость с завинчивающейся крышкой и направляют на исследование.

Отбор проб кала <8>

<8> МУК 4.2.3145-13.

3.20. Пробу кала после дефекации отбирают из разных участков в количестве не менее 50 г. Пробу помещают в чистую сухую стеклянную или пластмассовую посуду с крышкой. Материал доставляют в лабораторию и исследуют в день отбора пробы. Допускается хранение пробы кала при температуре от 0 до плюс 4 °C не более 24 ч.

3.21. При использовании иммунологических методов диагностики криптоспоридиоза в случае невозможности проведения анализа в день доставки материала пробы кала можно заморозить и хранить при температуре минус 20 (+/- 2) °C (в течение 12 месяцев). Перед проведением анализа образцы необходимо разморозить. Возможно использование консервантов, рекомендованных производителем диагностических тест-систем.

Регистрация проб объектов внешней среды

3.22. Каждая проба, направляемая на исследование в лабораторию, сопровождается актом отбора проб (приложение 2 к настоящим МУК), где указывается: наименование предприятия, организации (заявителя), наименование пробы (образца), объем отбираемой пробы, метод отбора пробы; нормативные документы на оценку объекта испытания, место отбора, дополнительные сведения (например, цель исследований).

3.23 Поступившую в лабораторию пробу регистрируют в рабочем журнале (формуляре), указывая следующие данные:

• порядковый номер (лабораторный номер);
• код пробы (образца);
• дату поступления пробы (образца) в лабораторию;
• цель направления пробы (образца);
• определяемые показатели;
• метод исследования.

IV. Лабораторные методы обнаружения ооцист криптоспоридий в объектах окружающей среды и биологическом материале человека <9>

<9> Примечание: оборудование, лабораторная посуда, материалы и реактивы приведены в приложении 1 к настоящим МУК.

4.1. Флотационный метод. Сущность флотационных методов основана на выявлении ооцист криптоспоридий, всплывающих на поверхность флотационного раствора, и дальнейшем их обнаружении при микроскопии. За время флотации ооцисты криптоспоридий, удельный вес которых меньше веса насыщенного раствора, всплывают на поверхность и концентрируются на поверхностной пленке. Метод применяется для исследований проб почвы, песка, донных отложений, воды питьевой, воды бассейнов, аквапарков, поверхностных водоемов.

4.1.1. Исследование почвы, песка, донных отложений, сухого осадка сточных вод флотационным методом.

4.1.1.1. В химический стакан помещают 25 г исследуемого образца, наливают 50 мл одного из флотационных растворов (приложение 3 к настоящим МУК); тщательно размешивают стеклянной палочкой, отстаивают в течение 5 мин и далее центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость переносят в воронки прибора для фильтрования и фильтруют через аналитические трековые мембраны (далее — АТМ) малого диаметра (35 мм) с диаметром пор 2,5 мкм с использованием предфильтров. Мембрану тщательно высушивают в лотке на воздухе. Фиксируют в смеси Никифорова 5 мин и высушивают в лотке на воздухе.

4.1.1.2. Окрашивают фильтр АТМ в кювете (лотке, чашке Петри) карболовым фуксином (окраска по Цилю-Нильсену) в течение 20 мин (приложение 4 к настоящим МУК). Тщательно высушивают на воздухе. Сухой окрашенный фильтр (АТМ) помещают на предметное стекло, предварительно смазанное тонким слоем иммерсионного масла (для лучшей адгезии), накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

4.1.1.3. Учет результатов. Микроскопируют окрашенные препараты под иммерсией при увеличении (окуляр x10, объектив x90 или x100). При окраске по Цилю-Нильсену ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки ярко-красного цвета и имеют вид округлых образований диаметром 3 — 7 мкм с отчетливо видной оболочкой и структурированным содержанием (можно видеть наличие четырех веретенообразных темноокрашенных спорозоитов) на синем, сиреневом или зеленом основном фоне (приложение 5 к настоящим МУК).

4.1.2. Исследование воды питьевой, воды бассейнов, аквапарков, поверхностных водоемов, поливной флотационным методом. Метод применяется для исследования концентрированного осадка воды после фильтрации через мембранные или порошковые фильтры.

4.1.2.1. Пробу воды фильтруют на одном из фильтровальных приборов (в соответствии с инструкцией) через мембранные фильтры типа МФАС-СПА или АТМ, или порошковый фильтр гидробиологический. Осадок с мембранных фильтров смывают кисточкой в 10 мл дистиллированной воды (на один фильтр) в химический стакан, чашку Петри или лоток. При использовании порошкового фильтра гидробиологического его необходимо отстаивать в течение 10 мин и исследовать надосадочную жидкость. Весь полученный смыв с мембранных фильтров или надосадочную жидкость порошкового фильтра центрифугируют в пробирках емкостью 10 мл и более в течение 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость осторожно удаляют. В пробирку с осадком добавляют 6 — 8 мл дистиллированной воды или 2%-го водного раствора формалина (если не проводится исследование на жизнеспособность) и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Суспензию вновь центрифугируют в течение 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость осторожно удаляют или отсасывают пипеткой. К осадку добавляют 3 мл одного из флотационных растворов с удельным весом 1,3 — 1,4, но не менее 1,26, и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно отбирают пипеткой и переносят в центрифужную пробирку, разбавляя дистиллированной водой в соотношении 1:4. Центрифугируют в течение 5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно удаляют.

4.1.2.2. Из осадка готовят препараты в виде мазка или капли (в зависимости от прозрачности осадка) на предметных стеклах. Окрашивают карбоновым фуксином по Цилю-Нильсену (приложение 4 к настоящим МУК).

4.1.2.3 Учет результатов (п. 4.1.1.3).

4.2. Метод Падченко. Метод применяется для исследований проб почвы, песка, донных отложений, сточных вод и их осадков.

4.2.1 Исследование почвы, песка.

4.2.1.1. Из объединенной пробы берут 25 г исследуемого образца, помещают в фаянсовую ступку, постепенно добавляют к ней дистиллированную воду, тщательно растирают пестиком до гомогенной кашицы. Выливают ее в цилиндр емкостью 1 л, предварительно наполненный на 3/4 объема дистиллированной водой. Смесь размешивают стеклянной палочкой или магнитной мешалкой и отстаивают в течение 15 мин. Образовавшуюся на поверхности смеси пленку удаляют микробиологической петлей, а жидкую ее часть отсасывают пипеткой в чистый цилиндр. Осадок повторно промывают дистиллированной водой объемом 100 мл (не менее 3 раз), собирая промывные воды в одном цилиндре. Промывные воды отстаивают, через 24 ч надосадочную жидкость удаляют. Анализ осадка проводят в течение первых 2 — 3 суток после его получения. Из 1 мл осадка готовят препараты на предметных стеклах и окрашивают (п. 4.1.2.2).

4.2.1.2. Учет результатов (п. 4.1.1.3) осуществляют с последующим пересчетом на общий объем осадка.

4.2.2 Исследование осадков сточных вод, донных отложений.

4.2.2.1. Пробу осадка сточных вод (донных отложений) объемом 1 л или 200 г при плотной консистенции помещают в большую фарфоровую ступку. Тщательно растирают пестиком до гомогенного состояния, постепенно добавляют к нему дистиллированную воду до общего объема 1,5 л. Полученную взвесь переливают в цилиндр емкостью 2 л, отстаивают в течение 15 мин. Надосадочную жидкость переливают в цилиндр емкостью 5 л. Осадок повторно отмывают (2 — 3 раза) дистиллированной водой путем встряхивания в цилиндре емкостью 2 л. Полученную при отмывании и собранную в большом цилиндре (5 л) жидкую часть отстаивают 24 ч. Надосадочную жидкость удаляют. Из осадка готовят препараты на предметных стеклах и окрашивают (п. 4.1.2.2).

4.2.2.1. Учет результатов (п. 4.1.1.3) осуществляют с последующим пересчетом на общий объем осадка.

4.2.3 Исследование сточных вод.

4.2.3.1. Пробу сточной воды отстаивают в течение 12 — 16 ч. Затем надосадочную жидкость сливают, осадок переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют пипеткой. Из осадка готовят препараты на предметных стеклах в виде мазка или капли и окрашивают (п. 4.1.2.2).

4.2.3.2. Учет результатов (п. 4.1.1.3) осуществляют с последующим пересчетом на общий объем осадка.

4.3. Метод последовательной фильтрации через систему прозрачных АТМ. Метод применяется для исследований проб воды питьевой, воды бассейнов, аквапарков, поверхностных водоемов, поливной.

4.3.1. Предварительно на заборное устройство прибора для фильтрования крепится предфильтр с размерами ячейки 70 мкм. АТМ с диаметром пор 5 мкм помещают на фритту фильтродержателя прибора для фильтрования и сверху укладывают фильтр с размером пор 25 мкм, применяют уплотнительное кольцо. Закрепляют крышкой и проводят фильтрацию в соответствии с инструкцией к прибору. Пробу воды фильтруют в отдельную емкость, т.к. она будет подвергаться повторной фильтрации. После фильтрации обе мембраны последовательно по одной осторожно снимают пинцетом с фритты и переносят в лоток. Профильтрованную в отдельную емкость пробу воды повторно фильтруют с использованием АТМ с диаметром пор 2,5 мкм, которую укладывают на фритту фильтродержателя между двумя уплотнительными кольцами. После фильтрации АТМ осторожно снимают пинцетом с фритты и переносят в лоток. Со всех трех фильтров аккуратно и тщательно, придерживая диск с мембраной пинцетом за край, производят смыв осадка с обеих поверхностей мембран. Смыв проводят плоской средней жесткости кисточкой в лоток с дистиллированной водой. При этом периодически споласкивают мембраны и диски дистиллированной водой из химического стакана. Общий объем дистиллированной воды при смыве осадка со всех 3 фильтров не должен превышать 300 — 500 мл. Концентрированный смыв сливают из лотка в воронки прибора для фильтрования и фильтруют через АТМ с диаметром пор 2,5 мкм. В зависимости от первоначальной загрязненности воды используют 1, 2 или 3 воронки. Если прибор с одной воронкой, то фильтруют последовательно, меняя мембраны. Мембраны тщательно высушивают в лотке на воздухе. Фиксируют в смеси Никифорова 5 мин и вновь тщательно высушивают в лотке на воздухе. Окрашивают фильтры АТМ (п. 4.1.1.2) и микроскопируют.

4.3.2 Учет результатов (п. 4.1.1.3).

4.4. Метод центрифугирования. Метод применяется для исследований проб смывов с поверхностей, отобранных согласно п. 3.17.

4.4.1. Пробирки со смывами проб центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок переносят на предметное стекло. Препараты окрашивают карболовым фуксином по Цилю-Нильсену (п. 4.1.2.2).

4.4.2 Учет результатов (п. 4.1.1.3).

4.5. Метод фильтрации с использованием прозрачных АТМ. Метод применяется для исследований проб смывов с поверхностей, отобранных согласно п. 3.19.

4.5.1. На фритту фильтродержателя прибора для фильтрования помещают прозрачный фильтр АТМ (с диаметром пор 2,5 мкм). Закрепляют воронку или диск прибора и проводят фильтрацию раствора со смывом в соответствии с инструкцией к прибору. После окончания фильтрования мембрану АТМ осторожно снимают пинцетом с фильтродержателя и переносят на предметное стекло. Мембрану тщательно высушивают в лотке на воздухе. Фиксируют в смеси Никифорова 5 мин и вновь высушивают в лотке на воздухе. Окрашивают фильтр АТМ (п. 4.1.1.2) и микроскопируют.

4.5.2 Учет результатов (п. 4.1.1.3).

4.6. Метод иммуномагнитной сепарации (разделения) (далее — ИМС) и мечения флуоресцирующими антителами для обнаружения ооцист криптоспоридий. Метод применяется для исследований проб почвы, песка, разных видов вод, кала.

4.6.1. Метод представлен двухэтапной реакцией, при которой обнаружение искомого антигена в комплексе антиген-антитело (АГ-АТ) происходит с помощью иммуномагнитной суспензии для выделения ооцист криптоспоридий <10>.

<10> Примечание: допускается использование устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками; все иммунореагенты и буферные растворы диагностического набора перед использованием необходимо довести до комнатной температуры (выдерживать не менее 1 ч при комнатной температуре).

4.6.1.1. Подготовка проб воды к проведению ИМС. Пробы воды фильтруют с использованием прибора для фильтрования через АТМ с диаметром пор 2,5 мкм. После фильтрации воды осадок с фильтров смывают 10 мл дистиллированной воды. Переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. Удаляют надосадочную жидкость пипеткой, осадок разделяют на порции по 1 мл (в пробирках) и в каждую добавляют 3 мл дистиллированной воды. Далее исследуют каждую порцию данной пробы по методу ИМС.

4.6.1.2. Подготовка проб почвы, песка к проведению ИМС. Пробу объемом 25 г помещают в фаянсовую ступку, добавляют небольшое количество дистиллированной воды, растирают до образования гомогенной кашицы. Образовавшуюся смесь переносят в чистый стакан, заливают дистиллированной водой в соотношении 1:2. Взвесь перемешивают и отстаивают в течение 20 мин или центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин. Переливают надосадочную жидкость в центрифужные пробирки. Центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин. Удаляют надосадочную жидкость пипеткой, к осадку объемом 1 мл добавляют 3 мл дистиллированной воды и исследуют по методу ИМС.

4.6.1.3. Подготовка проб смывов и смывных вод к проведению ИМС. Отбор проб смывов с поверхностей производят в центрифужные пробирки. В лаборатории в каждую пробирку добавляют дистиллированную воду до объема 8 мл. Взвесь центрифугируют в течение 3 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют пипеткой, к 1 мл образовавшегося осадка добавляют 3 мл дистиллированной воды. Далее исследуют порцию пробы методом ИМС.

4.6.1.4. Подготовка проб кала к проведению ИМС. В пробу кала объемом 1 г, состоящую из пробы свежего нативного кала или трехкратной пробы кала, отобранную в консервант, добавляют дистиллированную воду до общего объема пробы 8 мл. Пробу тщательно перемешивают встряхиванием или стеклянной палочкой. Помещают в центрифужную пробирку объемом 10 мл путем фильтрования через воронку с двумя слоями марли металлическими или пластмассовыми ситечками. Центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин. Из полученной взвеси пипеткой удаляют надосадочную жидкость. Осадок разделяют на порции по 0,5 мл (в пробирках) и в каждую добавляют 3 мл дистиллированной воды. Далее исследуют каждую порцию данной пробы <11>.

<11> Примечание: в одной ИМС-пробирке обрабатывается не более 0,5 мл концентрата пробы, ресуспендированного в 3 мл дистиллированной воды. Больший объем осадка необходимо перемешать с дистиллированной водой, разделить на части, в каждой из которых должно содержаться не более 0,5 мл исходного осадка, и далее обрабатывать как две и более пробы.

4.6.2. Иммунохимическое связывание, магнитная сепарация и промывка. В пробирку для ИМС (ИМС-пробирку или плоскостенную пробирку) вносят 5 мл 2-концентрированного буфера A из диагностического набора. Закрывают пробирку крышкой и вращают, смачивая ее внутренние стенки. С помощью пипетки, предварительно омытой дистиллированной водой, переносят в ИМС-пробирку с буфером исследуемую порцию пробы. Омывают пробирку, в которой находилась порция пробы, дистиллированной водой по 1,0 мл дважды и переносят ИМС-пробирку. Плотно закрывают крышку пробирки и перемешивают раствор, переворачивая пробирку 3 раза. По выполнении всех процедур переноса пробы общий объем раствора в ИМС-пробирке составляет 10 мл. Затем весь объем иммуномагнитной суспензии из диагностического набора перемешивают на вортексе в течение 20 с, отбирают из флакона дозатором 100 мкл (0,1 мл) суспензии и переносят ее в пробирку для ИМС, в которой уже находится порция исследуемой пробы. Закрепляют закрытую пробирку для ИМС в штативе лабораторного ротатора перпендикулярно к оси вращения и перемешивают в течение 1 ч при скорости 18 об/мин при комнатной температуре маятникообразными движениями, не переворачивая пробирку. Извлекают ИМС-пробирку из ротатора и помещают в магнитный штатив плоской стороной к магниту. Осторожно (не переворачивая) покачивают штатив с пробиркой вручную в течение 3 мин, поворачивая ее на 90 градусов от себя и наоборот, при этом плоская сторона пробирки находится снизу. По мере движения на плоской стороне ИМС-пробирки будет образовываться осадок (налет). Не вынимая ИМС-пробирку из магнитного штатива, в вертикальном положении открывают крышку пробирки, осторожно сливают жидкость из пробирки, при этом не повредив осадок (налет) на плоской стороне пробирки. Продолжая фиксировать пробирку на магните с помощью пастеровской пипетки, удаляют остатки жидкости со дна пробирки, не задевая осадок. Извлекают пробирку из штатива и добавляют 0,48 мл (480 мкл) буфера B, вращая пробирку и осторожно смывая суспензию с плоской стенки ИМС-пробирки. С помощью пастеровской пипетки переносят 480 мкл суспензии из ИМС-пробирки в пробирку типа Эппендорф на 1,5 мл. Дважды омывают плоскую стенку ИМС-пробирки 0,48 мл буфера B, осторожно поворачивая пробирку и используя пастеровскую пипетку. Последовательно переносят оба смыва в пробирку типа Эппендорф на 1,5 мл с помощью одной пастеровской пипетки, избегая при этом образования пузырей. Ждут 15 с и переносят остатки жидкости из ИМС-пробирки в ту же пробирку типа Эппендорф. Закрывают крышку пробирки типа Эппендорф и помещают в магнитный штатив. Затем штатив с пробиркой покачивают вручную в течение 1 мин, поворачивая ее на 180 градусов от себя и наоборот, при этом пробирка находится сверху. Не вынимая пробирку типа Эппендорф из магнитного штатива и не касаясь суспензии на стенке пробирки, с помощью пастеровской пипетки осторожно удаляют всю жидкость из пробирки.

4.6.3. Диссоциация иммунного комплекса. Извлекают пробирку типа Эппендорф из магнитного штатива и добавляют в нее 50 мкл 0,1 Н раствора соляной кислоты. Перемешивают суспензию в пробирке на вортексе в течение 50 с. Инкубируют пробирку в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем перемешивают суспензию в пробирке на вортексе в течение 30 с. Помещают пробирку в магнитный штатив. Через 30 с осторожно, не касаясь осадка на стенке пробирки, с помощью автоматической пипетки отбирают 50 мкл супернатанта и переносят его в окно (лунку) слайда (предметного стекла), в котором находится 6 мкл 1,0 Н раствора NaOH. Повторяют процедуры диссоциации. По итогу обе порции исследуемого раствора вносят в одно и то же или в два окна слайда для последующего иммунофлюоресцентного мечения. Для положительного контроля отбирают 10 мкл положительного антигена из диагностического набора или от 200 до 400 инактивированных ооцист криптоспоридий и вносят во второе окно слайда (предметного стекла). Подсушивают слайд в потоке теплого (не горячего) воздуха или с помощью устройства для сушки слайдов (примерно 15 — 30 мин). Дальнейшие процедуры осуществляют для опытных и контрольных образцов (помещенных в лунки предметного стекла).

4.6.4. Подготовка к иммунофлуоресцентному мечению. Растворяют 1 таблетку таблетированного фосфатного буфера (PBS) в 100 мл дистиллированной воды. Готовят рабочий раствор DAPI: разводят 1 мкл 5000-концентрированного раствора из комплекта диагностического набора в 5 мл приготовленного фосфатного буфера (PBS). Рабочий раствор DAPI готовят в день выполнения исследования и используют только свежеприготовленный. Избегают воздействия прямого солнечного света.

4.6.5. Флуоресцентное и иммунофлуоресцентное мечение. По завершении сушки слайда в его окна с пробой и контролем вносят по 50 мкл рабочего раствора DAPI. Инкубируют при комнатной температуре 1 мин. Вносят в окна слайда 50 — 100 мкл моющего буфера из диагностического набора, ждут 1 мин. Осторожно наклоняют слайд (предметное стекло) краем вниз и с помощью фильтровальной бумаги удаляют моющий буфер, не касаясь поверхности окон. Подсушивают препараты на воздухе. Вносят по одной капле (45 мкл) иммунореагента для ИМС из диагностического набора в окна слайда. При необходимости с помощью аппликатора или стеклянной палочки распределяют реагент по окну (лунке), не касаясь поверхности самого окна. Помещают препараты в ячейку влажности и инкубируют в термостате в течение 25 мин при температуре плюс 37 °C или в течение 40 мин при комнатной температуре <12>. Вносят в окна слайда 50 — 100 мкл моющего буфера из диагностического набора, ждут 1 мин. Осторожно наклоняя слайд (узким краем вниз), с помощью фильтровальной бумаги удаляют моющий буфер, не касаясь поверхности окон. Затем для снижения неспецифической флюоресценции и увеличения контрастности фона для лучшего наблюдения зеленой флюоресценции ооцист криптоспоридий вносят по одной капле (45 мкл) контрастирующего красителя из диагностического набора в каждое окно слайда и инкубируют в течение 1 мин при комнатной температуре. Отмывают предметное стекло от контрастирующего реагента — вносят в окна слайда 50 — 100 мкл моющего буфера, ждут 1 мин. Осторожно наклоняют препарат (узким краем вниз) и с помощью фильтровальной бумаги удаляют моющий буфер, не касаясь поверхности окон. Раскладывают препараты на наклонном штативе для слайдов и подсушивают в токе теплого воздуха. Наносят по 1 капле защитной среды из диагностического набора в каждую лунку и накрывают покровным стеклом. Заклеивают бесцветным лаком (рекомендуется) <13>.

<12> Примечание: допускается более длительное время инкубации.

<13> Примечание: меченые препараты, защищенные средой, хранятся в темноте при температуре плюс 5 (+/- 3) °C не более 6 месяцев. Замораживание не допускается.

4.6.6. Люминесцентная микроскопия. Препараты исследуют не менее чем при 200-кратном общем увеличении на наличие яблочно-зеленой флюоресценции, микроскопируя все поля зрения. При использовании каждой новой партии реагентов и перед началом микроскопии препаратов исследуемых проб рекомендуется предварительно просмотреть препарат положительного контроля, для чего используется контрольная суспензия с точно подсчитанным количеством ооцист криптоспоридий из диагностического набора.

4.6.7. Учет результатов. Ооцисты криптоспоридий — светящиеся и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты от овальных до сферических (от 3 до 7 мкм в диаметре) с ярко подсвеченными краями (приложение 5 к настоящим МУК).

4.7. Обнаружение цистных форм криптоспоридий методом полимеразной цепной реакции (далее — ПЦР) <14>. Метод применяется для исследования проб почвы, песка, смывов, разных видов вод, кала. Методом ПЦР определяют уникальные фрагменты ДНК ооцист криптоспоридий с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров. Метод ПЦР состоит из трех основных этапов: выделение ДНК возбудителя, амплификация ДНК и детекция продукта ПЦР с интерпретацией результатов.

<14> Примечание: приготовление растворов и буферов для метода ПЦР представлено в приложении 6 к настоящим МУК.

4.7.1. Выделение ДНК возбудителя из проб почвы, песка. Отбирают не менее 0,5 г исследуемого материала, гомогенизируют и выделяют ДНК возбудителя. Для выделения ДНК возбудителя используют готовые наборы реактивов, предназначенные для работы с почвой, или химические реактивы.

4.7.1.1. Выделение ДНК возбудителя из проб почвы с помощью химических реактивов (метод с ЦТАБ). Добавляют к пробе равный объем 1 М взвеси CaCO3 и инкубируют на вортексе в течение 1 ч при комнатной температуре. Проводят лизис образца с помощью ЦТАБ-буфера (2% ЦТАБ (цетримониум бромид), 100 мМ трис-HCl pH 7,5; 1 мМ ЭДТА; 1,5 М NaCl), инкубируют на вортексе 30 — 60 мин при температуре плюс 60 °C. Пробу центрифугируют при 3500 об/мин 5 мин. Отбирают надосадочную жидкость и добавляют к ней равный объем хлороформа, встряхивают на вортексе 3 мин, инкубируют 5 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 мин при температуре плюс 4 °C. К отобранной верхней водной фазе добавляют CaCl2 до конечной концентрации 50 мМ. После инкубируют 20 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 1 мин. Отбирают надосадочную жидкость и добавляют к ней равный объем изопропанола и ацетат натрия до конечной концентрации 0,3 М. Инкубируют в течение 1 ч при температуре минус 20 °C, затем центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 мин при температуре плюс 4 °C. Осадок подсушивают в течение 10 мин при комнатной температуре, затем растворяют в ТЕ буфере (20 мМ трис-HCl pH 7,5; 1 мМ ЭДТА).

4.7.1.2. Выделение ДНК возбудителя из проб воды/смывов. Для выделения ДНК возбудителя предварительно из воды готовят концентрированный осадок при помощи метода последовательной фильтрации через систему АТМ (п. 4.3). Из полученного осадка ДНК выделяется с помощью различных методов с использованием химических реактивов (п. 4.7.1.1) или наборов для выделения ДНК в соответствии с инструкцией.

4.7.1.3. Выделение ДНК возбудителя из кала. Для выделения ДНК возбудителя криптоспоридиоза из цельного кала рекомендуется использовать специализированные наборы реактивов.

4.7.2. Амплификация ДНК. Для проведения реакции используются наборы реагентов для ПЦР, зарегистрированные в установленном порядке и валидированные для соответствующих целей. ПЦР-система включает в себя Taq-полимеразу, реакционный буфер, смесь дНТФ и пару специфических олигонуклеотидов <15>, комплементарных участку ДНК Cryptosporidium spp. Состав ПЦР-смеси определяется протоколом производителя Taq-полимеразы, температурные условия реакции соответствуют свойствам конкретной пары олигонуклеотидов. При проведении ПЦР обязательно готовят пробы положительного контроля и отрицательного контроля.

<15> Примеры пар олигонуклеотидов для детекции Cryptosporidium spp.:

1) COWP-F CAAATTGATACCGTTTGTCCTTCTG; COWP-R GGCATGTCGATTCTAATTCAGCT.

2. CRU18SFc GAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGG; CRUI8SRc CTGCTTTAAGCACTCTAATTTTCTCAAAG.

3. Прямой праймер CCGAGTTTGATCCAAAAAGTTAGGAA; обратный праймер CGTTAACGGAATTAACCAGAC.

4.7.3. Детекция результатов ПЦР проводится методом гель-электрофореза и флуоресцентным методом (в режиме реального времени).

4.7.3.1. Проведение электрофореза <16>. В отдельной пробирке смешивают 2 мкл буфера для нанесения и 10 мкл реакционной смеси. Вносят смесь в лунки геля. В одну из лунок вносят маркер молекулярной массы. Помещают заполненный гель в камеру для электрофореза, заполненную буфером 1 x ТБЕ. Толщина слоя буфера над поверхностью геля 2 — 3 мм. В режиме постоянного напряжения 100 V электрофорез длится 20 — 30 мин. Гель (без формы) помещают на фильтр трансиллюминатора и просматривают в проходящем ультрафиолетовом свете. Продукты реакции наблюдают в виде полос оранжевого цвета. Документируют результат электрофореза при помощи гельдокументирующей системы.

<16> Примечание: при работе с электрофорезом следует избегать контакта с содержимым камеры (буфером и гелем), когда они находятся под напряжением. В случае прямого визуального наблюдения геля на трансиллюминаторе глаза оператора защищаются специальными очками, маской или стеклянной (или пластиковой) пластиной, непроницаемой для ультрафиолетовых лучей.

4.7.3.2. Детекция результатов ПЦР флуоресцентным методом (в режиме реального времени). При использовании детекции продуктов реакции в режиме реального времени в реакционную смесь добавляют флуоресцентный краситель ДНК, если он не содержится в компоненте тест-системы. Краситель добавляют до 1x концентрации согласно инструкции производителя (количество добавляемой воды уменьшается на число микролитров, равное числу микролитров добавленного красителя). При задании программы условий амплификации добавляют режим детекции флуоресцентного сигнала в соответствии с инструкцией к используемым реагентам, используют рекомендованные инструкцией каналы для флуорофоров.

4.7.4. Интерпретация результатов анализа методом ПЦР. Анализ результатов электрофореза проводят по визуальной оценке наличия окрашенных полос фрагментов ДНК в дорожках геля. В пробе положительного контроля содержится продукт ПЦР (ДНК анализируемого возбудителя в известной концентрации), проба отрицательного контроля остается пустой. По наличию и отсутствию продукта ПЦР делают вывод о наличии или отсутствии ДНК Cryptosporidium spp. в исходной пробе. Анализ результатов с детекцией в режиме реального времени проводят с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения данного вида ПЦР, и указаний для конкретного набора реагентов. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. При оценке корректности полученных результатов рекомендуется учитывать критерии, которые указаны в инструкции производителя (например, значения Ct в положительном и отрицательном контролях, анализируемых пробах, оценка качества выделения ДНК по внутреннему контролю).

4.8. Микроскопические методы исследования кала человека с целью выявления ооцист криптоспоридий.

4.8.1 Метод формалин-эфирной или уксусной седиментации.

4.8.1.1. В центрифужные пробирки наливают 9 мл 10%-го раствора формалина (или 5%-го водного раствора уксусной кислоты). Исследуемую пробу перемешивают и отбирают 1 г кала (в случае жидкого стула не менее 3 — 4 мл кала) и добавляют в пробирки с формалином (кислотой). Перемешивают, а затем фильтруют через 2 слоя марли или металлическое ситечко в центрифужную пробирку. Доводят объем суспензии формалином (или кислотой) до 8 мл. Добавляют 2 мл эфира, закрывают пробкой и энергично встряхивают пробирку не менее 30 с. Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 2 мин или при 2000 об/мин в течение 1 мин. После центрифугирования образуются 4 слоя: осадок, раствор формалина (кислоты), коагулированный белок и фекальный детрит — «пробка» и сверху эфир с растворенными в нем жирами. Верхние 3 слоя удаляют резким опрокидыванием пробирки.

4.8.1.2. Осадок суспендируют и исследуют модифицированным методом окрашивания по Цилю-Нильсену (п. 4.8.2).

4.8.2. Модифицированный метод окрашивания по Цилю-Нильсену является методом специфической окраски ооцист криптоспоридий <17>.

<17> МУК 4.2.3145-13.

4.8.2.1. Каплю осадка после формалин-эфирной седиментации <18> (п. 4.8.1) наносят на обезжиренное предметное стекло и равномерно распределяют с помощью стеклянной палочки или краем шлифованного стекла. Мазки высушивают на воздухе. Препараты мазков фиксируют в смеси Никифорова в течение 20 — 30 мин и сушат на воздухе.

<18> Примечание: предварительное обогащение исследуемого материала методом седиментации повышает эффективность метода по выявлению ооцист криптоспоридий.

4.8.2.2. Окрашивают препарат карбол-фуксином в течение 30 — 40 мин. Промывают мазки в нескольких сменах водопроводной воды в стаканчике. Заливают препарат 7%-м раствором серной кислоты, пока не перестанут отходить облачка краски. Промывают дистиллированной водой. На несколько секунд погружают в 5%-й раствор метиленового синего или малахитового зеленого для подкраски фона. Промывают дистиллированной водой и высушивают мазки.

4.8.2.3. Микроскопируют препараты с использованием иммерсии при увеличении: окуляр x10, объектив x90 или x100. Ооцисты криптоспоридий — очень мелкие округлые объекты размером около 3 — 7 мкм — окрашиваются в красный цвет; внутри определяются овально вытянутые полукруглые образования — спорозоиты.

4.9. Методы определения антигенов криптоспоридий в пробах кала. Иммунологические методы диагностики криптоспоридиоза относят к косвенным методам, когда выявляются не сами паразиты, а их антигены. Данные методы являются дополняющими к комплексу паразитологических, клинических и лабораторно-инструментальных методов диагностики, используются для скрининговых исследований как вспомогательный метод для постановки диагноза. Эффективность данных методов зависит от стадии инвазии, состояния иммунного статуса инвазированного человека, а также от иммунохимических характеристик диагностического набора, условий хранения и сроков годности реагентов. Иммунологические исследования проводят с использованием наборов реагентов согласно инструкции по применению <19>.

<19> МУК 4.2.3533-18.

4.9.1. Иммунохроматографический метод (далее — ИХА) — экспресс-метод диагностики на основе иммунохроматографического теста для обнаружения антигенов Cryptosporidium parvum в пробах кала. Относится к экспресс-методам, позволяющим проводить предварительные исследования в полевых условиях. Является одностадийным тестом, основанным на иммунохроматографическом принципе, при котором используются специфичные к каждому паразитическому организму моноклональные антитела, фиксированные на мембране тест-кассеты и окрашенные латексными частицами. Образец кала суспендируют в буфере для экстракции. Аликвоту супернатанта без примеси нерастворенных частиц образца вносят в окошко тест-кассеты. Если образец содержит выявляемые антигены, то происходит образование комплекса «антиген-антитело-латексная частица». Необходимая подготовка, ход исследования и учет результатов выполняются в соответствии с инструкцией производителя.

4.9.2. Метод иммуноферментного анализа (далее — ИФА). Реакция ИФА основана на специфическом взаимодействии антигена и антител с предварительной иммобилизацией (фиксацией) одного из компонентов реакции на твердофазном носителе в лунках полистироловых планшетов, стрипов и выявлении образовавшегося комплекса «антиген-антитело» посредством ферментной метки (конъюгата). Выявление образовавшегося комплекса осуществляется по измерению интенсивности окраски — оптической плотности (далее — ОП) — субстратной смеси, содержащей вещество, с которым реагирует фермент — индикатор, изменяющий цвет под действием продуктов реакции «фермент-субстрат». Определяется ОП с помощью сканирующего спектрофотометра (планшетного ридера). Необходимая подготовка, ход исследования и учет результатов выполняются в соответствии с инструкцией производителя.

V. Количественный учет ооцист криптоспоридий

5.1. Метод количественного учета ооцист криптоспоридий. Во флакон или пробирку добавляют 4 мл 10%-го раствора формалина до первой отметки. Затем вносят 1 мл исследуемого материала — концентрат воды, диагностический осадок, флакон закрывают пробкой и тщательно встряхивают до получения равномерной суспензии. После встряхивания во флакон до верха доливают 10%-й раствор формалина. Полученную жидкость повторно тщательно встряхивают. Для исследования берут 3 капли содержимого флакона и наносят на одно предметное стекло, камеру Горяева или слайд-планшет. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену аналогично п. 4.1.2.2. Микроскопируют препарат под иммерсией при увеличении: окуляр x10, объектив x90 или x100. Последовательно считают число ооцист в препарате. Результаты записывают отдельно. Подсчеты повторяют 3 раза. Среднее число 3 подсчетов соответствует содержанию ооцист криптоспоридий в 5 мл исследуемого материала. Количество ооцист в пробе получают математическим пересчетом на 1 л и затем на весь объем пробы воды.

5.2. Определение количества ооцист криптоспоридий с помощью счетной камеры Горяева. 1 г анализируемой пробы размешивают в ступке с 15 см3 дистиллированной воды и тщательно растирают пестиком. Полученную суспензию фильтруют через сито. 10 см3 фильтрата помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют с частотой вращения 2000 об/мин в течение 2 мин. Жидкость из пробирки сливают, к осадку добавляют 10 см3 флотационного раствора хлористого натрия, тщательно перемешивают. Из смеси отбирают пипеткой 0,15 см3 для заполнения счетной камеры Горяева <20>. Заполненную камеру Горяева или предметное стекло выдерживают в течение 2 мин, чтобы ооцисты могли подняться к поверхности. Под микроскопом подсчитывают количество ооцист. Полученное число, умноженное на 100, показывает содержание ооцист криптоспоридий в 1 г пробы. Для более точного определения количества ооцист используют две-три камеры.

<20> Примечание: при отсутствии счетной камеры используется предметное стекло, на которое наносят 0,15 см3 суспензии, и накрывают покровным стеклом.

Приложение 1 к МУК 4.2.3964-23

ОБОРУДОВАНИЕ, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

Таблица 1

Оборудование

Таблица 2

Лабораторная посуда и расходные материалы

Таблица 3

Реактивы

Приложение 2 к МУК 4.2.3964-23 (рекомендуемый образец)

Название организации

Адрес организации

АКТ ОТБОРА ПРОБ _________________ N ___ от «___» ____________________ _____ г.

1. Наименование, место нахождения (регистрации) заявителя (заказчика)

2. Наименование объекта, где проводился отбор проб (образцов), и его адрес _____________________________________________________________________

3. Наименование пробы (образца)

4. Цель отбора: ___________________________________________________________

5. Цель исследования: _____________________________________________________

6. Документы, устанавливающие метод отбора проб:

7. Дата и время отбора проб:

8. Дата и время доставки проб в лабораторию:

9. Условия транспортировки проб:

10. Сведения об отобранных пробах:

11. Дополнительная информация:

Должность представителя объекта, присутствовавшего при отборе проб _____________________ ФИО подпись

Должность лица, проводившего отбор ____________________ ФИО подпись

Приложение 3 к МУК 4.2.3964-23

СОСТАВ ФЛОТАЦИОННЫХ РАСТВОРОВ

Приложение 4 к МУК 4.2.3964-23

МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ ООЦИСТ КРИПТОСПОРИДИЙ

1. Окрашивание мазков по Цилю-Нильсену

1.1. Осадок исследуемого материала, полученного любым из методов санитарно-паразитологического исследования на наличие ооцист криптоспоридий, наносят на обезжиренное предметное стекло и равномерно распределяют с помощью стеклянной палочки или краем шлифованного стекла. Мазки высушивают и фиксируют.

1.2 Фиксацию препарата проводят одним из приведенных способов.

1.2.1. Фиксируют препарат в смеси Никифорова (смесь равных частей эфира и 96%-го этилового спирта) на 20 — 30 мин. Пинцетом или специальными щипцами берут за боковые концы препарат и трижды медленно проводят через верхнюю треть пламени спиртовки или газовой горелки до исчезновения признаков запотевания стекла. Общая продолжительность пребывания препарата в пламени не должна превышать 3 — 5 секунд. Затем стекла помещают на специальную подставку («рельсы») для окрашивания.

1.2.2. Предметные стекла с мазками раскладывают на жестяные или эмалированные подносы и помещают в сушильный шкаф, где сначала высушивают при температуре плюс 37 °C. Затем температуру повышают до плюс 105 °C и спустя 10 мин шкаф выключают. При таком методе достигается надежное прикрепление материала к стеклу. Высушенные и фиксированные мазки должны сразу окрашиваться.

1.3. Процедура окраски. Препараты помещают на подставку («рельсы») так, чтобы они не касались друг друга и расстояние между ними составляло порядка 1 см, а маркировка (номер) была направлена в одну сторону. Максимально на стандартные «рельсы» помещают не более 12 стекол. На каждое стекло накладывают полоску фильтровальной бумаги так, чтобы она полностью закрывала мазок. Это делают для того, чтобы краска не разливалась по стеклу. Одновременно за счет использования фильтровальной бумаги предотвращается осаждение на препарат кристаллов краски, которые при микроскопическом исследовании могут быть ошибочно приняты за паразитарный агент.

Наливают на бумагу раствор карболового фуксина с избытком и нагревают препарат над пламенем горелки до легкого появления паров. При подогревании препарата следят за тем, чтобы краска не закипела, а фильтровальная бумага не высыхала. Подогретый препарат оставляют на 5 мин для полного его прокрашивания.

Пинцетом снимают и удаляют фильтровальную бумагу. Осторожно смывают остатки краски слабой струей дистиллированной воды до тех пор, пока не прекратится видимое отхождение краски. Перед тем как нанести на стекло следующий раствор щипцами или пинцетом берут каждое стекло за маркированный конец и наклоняют, чтобы с него стекла вода, — это предотвращает разбавление следующего реактива. Препарат обесцвечивают 3 мин одним из обесцвечивающих растворов, полностью покрывая всю поверхность мазка. Тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают в течение 1 мин (не превышая экспозицию) 0,3%-м раствором метиленового синего. Вновь аккуратно промывают проточной водой, наклоняя каждое стекло, чтобы стекала вода. Высушивают на открытом воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении (не промокая препарат).

1.4. Учет результатов. Препарат исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе при увеличении x900, x1000. Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки ярко красного (малинового, вишневого) цвета и имеют вид округлых образований диаметром 3 — 7 мкм с отчетливо видимой оболочкой и структурированным содержанием (можно наблюдать наличие 4 веретенообразных темно окрашенных спорозоитов) на синем (сиреневом) или зеленом фоне (приложение 5 к настоящим МУК).

2. Окрашивание по Романовскому-Гимза (альтернативный метод окраски препаратов)

2.1. На подсушенный мазок для фиксации наносят метанол или жидкость Никифорова (смесь равных частей эфира и 96%-го этилового спирта), подсушивают на воздухе или путем быстрой проводки над пламенем горелки, затем покрывают красителем (основным раствором краски Романовского-Гимза). Оставляют окрашиваться на 10 — 30 мин. Промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе при комнатной температуре.

2.2. Учет результатов. Препарат исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе при увеличении 900x, 1000x. Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в бледно-голубой цвет с малозаметными красноватыми гранулами в спорозоитах.

3. Окраска препаратов для люминесцентной микроскопии

3.1. Мазки для люминесцентной микроскопии предпочтительно готовить из осадка после обработки материала детергентом с последующим отмыванием и центрифугированием. Перед нанесением материала осадка на предметное стекло рекомендуется добиться значения его pH 6,8 — 7,0. Для этого осадок нейтрализуют несколькими каплями 6%-го раствора соляной кислоты или 6%-го раствора едкого натра (в зависимости от метода обработки материала), тщательно встряхивают и с помощью индикаторной тест-полоски определяют уровень pH осадка.

Во всех сомнительных случаях микроскопической картины для контроля рекомендуется использовать микроскопию мазка, повторно окрашенного по методу Циля-Нильсена.

Промывание мазков в процессе окраски рекомендуется проводить только дистиллированной водой, так как водопроводная вода содержит соединения хлора, которые могут изменять флюоресценцию.

В случае невозможности проведения немедленной микроскопии окрашенные мазки рекомендуется сохранять, прикрыв черной бумагой во избежание ослабления флюоресценции.

При окраске мазков необходимо:

• избегать неполного обесцвечивания;
• не делать толстых мазков, так как это затрудняет обесцвечивание и фиксацию мазка на стекле;
• при окраске флюорохромными красителями не подогревать мазки и пользоваться накладками из фильтровальной бумаги.

При использовании каждой новой партии реагентов и перед началом микроскопии препаратов исследуемых проб следует предварительно приготовить препарат положительного контроля, для чего используют контрольную суспензию с точно подсчитанным количеством ооцист криптоспоридий.

4. Метод окраски аурамином O

4.1. Приготовление растворов для люминесцентного окрашивания аурамином O.

Раствор 1. Спиртовой раствор аурамина O: растворить 0,1 г аурамина O в 10 мл этилового спирта 96°-го.

Раствор 2. Раствор фенола: расплавить 3,0 г фенола кристаллического (температура плавления плюс 41 °C) и растворить его в 87 мл дистиллированной воды, пользуясь подогреванием на водяной бане, довести общий объем до 90 мл.

Раствор 3. Раствор аурамина O: смешать растворы 1 и 2 и перелить в плотно закрывающуюся емкость из темного стекла. Хранить в прохладном затемненном месте. В процессе хранения раствор может стать мутным, что не влияет на качество окрашивания.

Раствор 4. Обесцвечивающий раствор: аккуратно добавить 0,5 мл концентрированной соляной кислоты к 100 мл 70%-го этилового спирта.

Раствор 5. Гасители фона. Для дополнительного окрашивания препаратов можно использовать растворы перманганата калия или акридинового оранжевого. Хранят готовые растворы в плотно закрывающейся темной емкости. На этикетке обозначают название раствора, дату приготовления, срок годности. Раствор может храниться при комнатной температуре в темном месте до 3 месяцев.

Раствор перманганата калия: растворить 0,5 г перманганата калия в 100 мл дистиллированной воды.

Раствор акридинового оранжевого: растворить 0,01 г безводного двузамещенного фосфата натрия в 100 мл дистиллированной воды, добавить 0,01 г акридинового оранжевого.

4.2. Процедура окраски. Стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы — «рельсы» — для окраски так, чтобы они не касались друг друга. Мазки заливают раствором аурамина O (раствор 3) на 15 мин. Затем тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой. Далее обесцвечивают 0,5%-м раствором солянокислого спирта (раствор 4) в течение 2 мин. Промывают дистиллированной водой каждое стекло до тех пор, пока не смоются все остатки краски.

Гашение фона осуществляют раствором перманганата калия или акридинового оранжевого (раствор 5) в течение 2 мин. Мазки промывают дистиллированной водой и высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

4.3. Учет результатов. Окрашенные препараты исследуют при увеличении от x250 до x450. Аурамин O связывается с ооцистами криптоспоридий, которые при облучении их возбуждающим светом начинают светиться оранжевым или ярко-желтым светом на черном или темно-зеленом фоне.

Приложение 5 к МУК 4.2.3964-23

ИЛЛЮСТРАЦИИ ООЦИСТ КРИПТОСПОРИДИЙ, ОБНАРУЖИВАЕМЫХ ПРИ МИКРОСКОПИИ

Рис. 1. Ооциста Cryptosporidium parvum в пробе кала при окраске по Романовскому-Гимзе

Рис. 2. Ооцисты Cryptosporidium parvum в пробе кала при окраске по Цилю-Нильсену

Рис. 3. Ооцисты Cryptosporidium spp. в пробе сточной воды при исследовании методом иммуномагнитной флюоресценции

Рис. 4. Ооцисты Cryptosporidium spp. в пробах воды децентрализованного водоснабжения при окраске по Цилю-Нильсену (округлые образования, отмеченные стрелками, являются ооцистами Cryptosporidium)

Приложение 6 к МУК 4.2.3964-23

СОСТАВ И СПОСОБЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАСТВОРОВ И БУФЕРОВ ДЛЯ ПЦР

1. Раствор 1 М трис-HCl (pH 7,5). В мерной колбе на 100 мл растворяют 12,11 г трис(гидроксиметил)аминометана (молекулярный вес 121) в 80 мл дистиллированной воды, доводят pH концентрированной соляной кислотой до 7,5, затем доводят объем раствора до метки деионизированной водой, перемешивают. Хранят при температуре минус 20 °C не более года.

2. Раствор 5 М NaCl. Растворяют 29,22 г натрия хлористого (молекулярный вес 58,5) в 100 мл дистиллированной воды, перемешивают. Хранят в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.

3. Раствор 0,5 М ЭДТА (pH 8,0). В мерной колбе на 100 мл растворяют 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 мл дистиллированной воды. Раствором 30%-м натрия гидроокиси доводят pH раствора до 8,0, затем дистиллированной водой доводят объем раствора до метки, перемешивают. Хранят в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.

4. Раствор 30%-й NaOH. Растворяют 3 г натрия гидроокиси (молекулярный вес 40) в 7 мл дистиллированной воды.

5. Раствор хлороформа, насыщенный водой. Смешивают 100 мл хлороформа с 20 мл деионизированной воды и оставляют на 24 часа для насыщения. Срок хранения при температуре от плюс 4 до плюс 5 °C не более 6 месяцев.

6. Раствор лизирующего буфера (2%-й ЦТАБ). Растворяют 0,5 г гексадецилтриметиламмония бромида в 10 мл деионизированной воды (при плохом растворении подогреть на водяной бане), добавляют 2,5 мл 1 М трис-HCl, 7 мл 5 М NaCl, 1 мл 0,5 М ЭДТА, доводят объем раствора деионизированной водой до 25 мл, перемешивают. Срок хранения при температуре от плюс 4 до плюс 5 °C не более 6 месяцев. Допустимо образование осадка.

Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате при температуре 65 °C до полного растворения осадка.

7. Раствор 1 М взвеси CaCO3. Карбонат кальция в количестве 10 г добавляют к 100 мл дистиллированной воды. Перемешивают 5 мин. Перед применением полученную взвесь встряхивают. Хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

10. Раствор 1 М CaCl2. К 1,11 г безводного хлорида кальция добавляют дистиллированную воду до объема 10 мл и встряхивают до полного растворения. При использовании обводненного хлорида кальция следует пересчитать количество добавляемой соли в соответствии с молекулярной массой. 50 мМ концентрацию хлорида кальция получают, добавляя к образцу 5% от объема образца 1 М хлорида кальция. Хранят при температуре минус 20 °C не более года.

11. Раствор CH3COONa 3 М. Добавить к 24,6 г CH3COONa дистиллированную воду до 100 мл. Размешать до полного растворения. Для получения конечной концентрации 0,3 М добавляют полученный раствор в количестве 11% от объема образца.

12. ТЕ буфер. К 9,78 мл дистиллированной воды добавить 200 мкл 1 М трис-HCl pH 7,5 и 20 мкл 0,5 М ЭДТА и тщательно перемешать. Хранить при температуре минус 20 °C не более года.

13. Буфер для нанесения. К 9 мл воды добавляют 1 мл глицерина и 0,625 г бромфенолового синего и тщательно перемешивают до полного растворения. Раствор разливают по порциям.

14. 1x ТБЕ буфер для электрофореза. В мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 мг трис(оксиметил)аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, довести дистиллированной водой до метки, перемешать до полного растворения. Срок хранения 1x раствора 10 дней. Обычно готовят 10x и перед употреблением разбавляют до 1x; используют трис-основания, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М ЭДТА, доливают деионизированной водой до метки. Полученный концентрированный раствор перед употреблением разводят в 50 раз. Используют для проведения электрофореза не более двух раз.

15. Раствор бромистого этидия C21H20N3Br (10 мг/мл). Растворяют 1 г бромистого этидия в 100 мл дистиллированной воды. Срок хранения в посуде из темного стекла (обязательно при температуре от 4 до 5 °C) не более 12 месяцев. Бромистый этидий потенциально канцерогенен, работать с ним и содержащими его гелями можно только в перчатках.

16. 1%-й раствор агарозного геля. Взвешивают агарозу из расчета 1 г агарозы на 100 мл буфера ТБЕ. Нагревают агарозу вместе с буфером до полного растворения (в микроволновой печи или на водяной бане). Нагревание проводят с осторожностью (опасность перегретых жидкостей). Остужают растворенный гель до примерно 56 °C (учитывать указания производителя электрофорезного прибора). Добавляют в гель раствор бромистого этидия до концентрации 0,2 — 0,5 мкг/мл (2 — 5 мкл на 100 мл раствора геля) и перемешивают. Гель заливают в собранную заливочную кассету с установленными гребенками. После застывания геля (гель становится слегка мутным и плотным) удаляют гребенки. Допускается хранение готового геля в 1x ТБЕ буфере для электрофореза в холодильнике при температуре от 4 до 5 °C не более 2 суток.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ

1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

3. СанПиН 1.2.3685-21 «Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания».

4. СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий».

5. МУК 4.2.3963-23 «Бактериологические методы исследования воды».

6. МУК 4.2.2661-10 «Методы санитарно-паразитологических исследований».

7. МУК 4.2.2314-08 «Методы санитарно-паразитологического анализа воды».

8. МУК 4.2.1884-04 «Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов».

9. МУК 4.2.3145-13 «Лабораторная диагностика гельминтозов и протозоозов».

10. МУК 4.2.3533-18 «Иммунологические методы лабораторной диагностики паразитарных болезней».

11. ГОСТ Р 70151 «Качество воды. Отбор проб для проведения паразитологических исследований».

12. ГОСТ 57782 «Удобрения органические. Методы паразитологического анализа. Методы определения ооцист и цист простейших».

13. Дехнич А.В. Клинические и микробиологические аспекты криптоспоридиоза // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. Т. 2. № 3. С. 51 — 57.

14. Паразитарные болезни человека (протозоозы и гельминтозы): руководство для врачей / под ред. В.П. Сергиева, Ю.В. Лобзина, С.С. Козлова. ООО «Издательство Фолиант» (Санкт-Петербург), 2016. 640 с.

15. Исследование воды на наличие ооцист криптоспоридий, цист лямблий, яиц гельминтов на основе адсорбции. / Л.В. Скрипова // Инструкция по применению, Минск, 2008. 9 с.

16. Guy R.A., Payment P., Krull U.J., Horgen P.A. Real-time PCR for quantification of Giardia and Cryptosporidium in environmental water samples and sewage // Applied and Environmental Microbiology. 2003. V. 69. № 9. P. 5178 — 5185.

17. Hadfield S.J., Robinson G., Elwin K., Chalmers R.M. Detection and differentiation of Cryptosporidium spp. in human clinical samples by use of real-time PCR // Journal of clinical microbiology. 2011. V. 49. N. 3. P. 918 — 924.