МУК 4.2.3250-14. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Микробиологическое измерение концентрации Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ B-9029 в воздухе рабочей зоны. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 30.12.2014)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 30 декабря 2014 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ AZOTOBACTER CHROOCOCCUM BH-1811 ВКПМ B-9029 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3250-14

1. Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. № 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

Введение

Сборник методических указаний «Измерение концентраций штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны» (выпуск 2) разработан с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций микроорганизмов их предельно допустимым концентрациям (ПДК), что является обязательным при осуществлении санитарно-эпидемиологического контроля.

Включенные в данный список методические указания по контролю биотехнологических штаммов в воздухе рабочей зоны разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССТБ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ 8.563-96 ГСИ. «Методики выполнения измерений».

Методики выполнены с использованием современных и адекватных микробиологических методов исследования и позволяют контролировать концентрации биотехнологических штаммов на уровне и ниже их ПДК в воздухе рабочей зоны, установленных в гигиенических нормативах.

Методические указания по измерению концентраций штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны предназначены для лабораторий центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, санитарно-микробиологических лабораторий промышленных предприятий, а также для научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований, для осуществления контроля за содержанием штаммов в воздухе рабочей зоны.

1. Назначение и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ B-9029 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м3 воздуха.

1.2 Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Биологическая характеристика штамма Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ B-9029 и его гигиенический норматив в воздухе рабочей зоны

Штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ B-9029 выделен из почв Подмосковья, не является генетически модифицированным штаммом. Штамм продуцирует гетероауксин, антибиотики. Предполагается использовать в растениеводстве.

На среде Федорова штамм образует крупные, круглые, выпуклые, непрозрачные, гладкие колонии с ровными краями. Через 18 — 20 ч при t 28 — 30 °C можно видеть мелкие полиморфные клетки. Через 48 ч роста наблюдаются мелкие палочки, которые могут располагаться парами.

Желатин разжижает, крахмал быстро гидролизует. Восстанавливает лакмусовое молоко. Нитраты восстанавливает до нитритов, каталазоположительный, образует сероводород, вызывает гемолиз.

Штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ B-9029.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны — 50 000 кл/м3.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Методы измерений

Прямой метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений бактерий на среду Федорова и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

5.1. Средства измерений

Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст.	ТУ 2504-1799-75
Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг	ГОСТ Р 53228-08
Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3	ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3	ГОСТ 1770-74
Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 — 55 °C	ТУ 25-2021.003-88
Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C	ТУ 9452-010-00141798-02
Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (28 +/- 2) и (37 +/- 2) °C	ТУ 9452-002-00141798-97
Автоклав электрический	ГОСТ 9586-75
Стерилизаторы паровые медицинские	ГОСТ Р ЕН 13060-11, ГОСТ Р 51935-2002
Дистиллятор	ТУ 4952-007-33142130-2000
Облучатель бактерицидный настенный	ТУ 9444-015-03965956-08
Холодильник бытовой	ГОСТ 26678-85
Микроскоп биологический с иммерсионной системой
Лупа с увеличением x 10	ГОСТ 25706-83
Пробирки типов П1, П2	ГОСТ 25336-82
Спиртовки лабораторные стеклянные	ГОСТ 23932-90
Чашки биологические (Петри)	ГОСТ 23932-90
Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм	ГОСТ 25336-82
Груша резиновая	ТУ 9398-005-0576-9082-03
Петля бактериологическая
Марля медицинская	ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
Бумага фильтровальная лабораторная	ГОСТ 12026-76
	Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды
Агар микробиологический	ГОСТ 17206-96
Аммоний молибденово-кислый, хч ГОСТ 3765-78
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-90
Железо серно-кислое, хч	ГОСТ 6981-94
Калий однозамещенный фосфорно-кислый, хч	ГОСТ 4198-75
Кальций углекислый, хч	ГОСТ 4530-76
Кислота борная, хч	ГОСТ 18704-78
Магний серно-кислый, хч	ГОСТ 4523-77
Марганец серно-кислый 5-водный, чда	ГОСТ 435-77
Меласса свекловичная Р 52304-05
Натрий хлористый, хч	ГОСТ 4233-77
Спирт этиловый ректификованный	ГОСТ Р 51652-2000 или
ГОСТ 18300-87	Спирт этиловый технический ГОСТ 17299-78
	Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

6.2. СП 1.3.2518-09. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха	(20 +/- 5) °C;
- атмосферное давление	(760 +/- 20) мм рт. ст.;
- влажность воздуха	не более 80%.

9. Приготовление питательных сред

Для приготовления агаризованной среды Федорова смешивают указанные компоненты: калий однозамещенный фосфорно-кислый — 0,5 г; магний серно-кислый — 0,3 г; натрия хлорид — 0,3 г; железо серно-кислое — 0,005 г; марганец серно-кислый — 0,005 г; аммоний молибденово-кислый — 0,005 г; борная кислота — 0,005 г; кальций углекислый — 3,5 г; меласса — 30,0 г; агар-агар — 17,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1 000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

Смесь нагревают до растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 121 °C в течение 15 мин и охлаждают до 60°. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C в течение 14 дней, не более.

10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96. ГСИ. «Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96°-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (среда Федорова) расплавляют, остужают до 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее, чем на 18 ч. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 — 8)° C не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28 +/- 2) °C. Через 1 — 2 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред (МУК 4.2.2316-08). Для этого эталонный музейный штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ B-9029 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

К = (П x 1000)/С x Т, кл/м3, где

К — концентрация Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ B-9029 в воздухе, кл/м3;

П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1 000 — коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;

С — скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т — время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.

Протокол № количественного микробиологического анализа Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ B-9029 в воздухе рабочей зоны

1. <a id="p100153"></a>Дата проведения анализа ____________________________________________

2. <a id="p100154"></a>Рабочее место (профессия работающего) ______________________________

3. <a id="p100155"></a>Место  отбора  пробы  (название и адрес  организации,  производство,

технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________

3. <a id="p100156"></a>Вид пробоотборника _________________________________________________

4. <a id="p100157"></a>Дата  последней  метрологической  поверки  оборудования  для  отбора

проб ______________________________________________________________________

5. <a id="p100158"></a>Питательная среда, время инкубации _________________________________

6. <a id="p100159"></a>Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ____________

7. <a id="p100160"></a>Количественная  и  качественная  характеристика   выросших   колоний

(количество типичных колоний) _____________________________________________

8. <a id="p100161"></a>Результаты  идентификации  микроорганизмов  Azotobacter  chroococcum

BH-1811 ВКПМ B-9029 (морфологические признаки) ____________________________

9. <a id="p100162"></a>Результаты расчета концентрации штамма _____________________________

10. <a id="p100163"></a>Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК     ______________
                                                    р.з.

11. <a id="p100164"></a>Отбор пробы произведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________

---

12. <a id="p100165"></a>Идентификация  штамма  и  расчет концентрации  произведены (Ф.И.О.,

должность, дата, подпись) _________________________________________________

---

---