МУК 4.2.3256-14. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Микробиологическое измерение концентрации клеток микроорганизма Yarrowia lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 в воздухе рабочей зоны. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 30.12.2014)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 30 декабря 2014 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМА YARROWIA LIPOLYTICA 2kp ВКПМ Y-4043 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3256-14
1. Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. № 2).
3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 декабря 2014 г.
Введение
Сборник методических указаний «Измерение концентраций штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны» (выпуск 2) разработан с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций микроорганизмов их предельно допустимым концентрациям (ПДК), что является обязательным при осуществлении санитарно-эпидемиологического контроля.
Включенные в данный список методические указания по контролю биотехнологических штаммов в воздухе рабочей зоны разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССТБ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ 8.563-96 ГСИ. «Методики выполнения измерений».
Методики выполнены с использованием современных и адекватных микробиологических методов исследования и позволяют контролировать концентрации биотехнологических штаммов на уровне и ниже их ПДК в воздухе рабочей зоны, установленных в гигиенических нормативах.
Методические указания по измерению концентраций штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны предназначены для лабораторий центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, санитарномикробиологических лабораторий промышленных предприятий, а также для научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований, для осуществления контроля за содержанием штаммов в воздухе рабочей зоны.
1. Назначение и область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Y. lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 5 000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 Методические указания носят рекомендательный характер.
2. Биологическая характеристика штамма Y. lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 и его гигиенический норматив в воздухе рабочей зоны
Дрожжевая культура Yarrowia lipolytica 2kp выделена из загрязненных нефтепродуктами воды/стоков Московской области, природный изолят. Штамм отобран по способности эффективно снижать содержание нефти в загрязненной ею воде, песке и почвах. Растет на средах с гексадеканом и нефтью в качестве единственных источников углерода. Является компонентом биопрепарата по биоремедиации почв, грунтов, водоемов и стоков от нефти и нефтепродуктов.
По результатам проведенного анализа нуклеотидной последовательности, кодирующей часть 18S рРНК исследуемого штамма, установлено, что исследуемый штамм — Yarrowia lipolytica (98%).
Аэроб. Способен к росту на средах, содержащих источники углерода.
Мезофил. Рост очень хороший — через 24 ч при 25 — 28 °C образует колонии на глюкозо-пептонном агаре (ГПА). При температуре 42 °C не растет. Выдерживает концентрации хлорида натрия до 1% и немного более.
Штамм растет на агаризованных средах — глюкозо-пептонном агаре (ГПА), мясо-пептонном агаре (МПА), АГВ-среде, картофельном агаре (КА). Можно культивировать в LB-бульоне, на LB-агаре и глюкозо-пептонной среде (ГПС).
На ГПА на 1 — 2-е сутки вырастают колонии белого цвета, сухие, круглые, поднимающиеся над агаром. Края колонии ровные, у старой культуры возможно образование складок и концентрических кругов различной плотности. Максимальный диаметр — 10 — 12 мм.
Клетки круглые, эллипсоидные или удлиненные. Бесполое размножение — многосторонним почкованием на узком основании. Образуется псевдомицелий или истинный мицелий, который может иногда распадаться на артроспоры. Аски не конъюгативные, образуются из диплоидных клеток гиф. Оболочка аска быстро растворяется. В аске 1 — 4 аскоспоры, шаровидные, полусферические или шляповидные.
Способен расти в присутствии циклогексимида, обладает уреазной активностью, нитрат не использует, сахара не сбраживает. В роде Yarrowia один вид lipolytica, известный своей способностью к интенсивному образованию липолитических и протеолитических ферментов. Телеоморфа — Candida paralipolytica. Встречается у человека и других млекопитающих, в зерне, маслинах и нефтепродуктах.
Штамм Yarrowia lipolytica 2kp депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-4043.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны — 500 кл/м3, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 5 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Методы измерений
Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток псевдомицелия и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.
5.1. Средства измерений
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799-75 |
|---|---|
| Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228-08 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1 000-2 | ГОСТ 1770-74 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3 | ГОСТ 29227-91 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770-74 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003-88 |
| Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
5.2. Вспомогательные устройства и материалы
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798-02 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (28 +/- 2) и (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798-97 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586-75 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060-11, ГОСТ Р 51935-02 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130-2000 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956-08 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678-85 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | |
| Лупа с увеличением x 10 | ГОСТ 25706-83 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336-82 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932-90 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932-90 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336-82 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-9082-03 |
| Петля бактериологическая | |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412-77 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026-76 |
| Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
5.3. Реактивы и питательные среды
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206-96 |
| Вода дистиллированная ГОСТ 6709-90 | |
| Глюкоза | ГОСТ 6038-79 |
| Пептон сухой ферментативный | ГОСТ 13805-76 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299-78 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652-2000 или |
| ГОСТ 18300-87 | Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233-77 |
| Глюкозо-пептонная среда стандартная | |
| Циклогексимид син. актидион | ГОСТ 51921-02 |
| Однозамещенный фосфорно-кислый натрий | ГОСТ 245-76 |
| Серно-кислый магний, хч | ГОСТ 4523-77 |
| Куриный желток | |
| Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками. | |
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток гриба в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.
6.1. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
6.2. СП 1.3.2518-09. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08.
6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях: - температура воздуха (20 +/- 5) °C; - атмосферное давление (760 +/- 20) мм рт. ст.; - влажность воздуха не более 80%.
9. Приготовление питательных сред
9.1. Глюкозо-пептонный агар (ГПА)
Для приготовления используют сухую готовую глюкозо-пептонную среду (ГПА): 50,0 г порошка размешивают в 1 000 см3 дистиллированной воды. Можно использовать отдельные компоненты среды следующего состава: пептон — 20,0 г; глюкоза — 10,0 г; хлорид натрия — 5,0 г; агар-агар — 15,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1 000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.
Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.
9.2. Желточный агар
Для приготовления желточного агара смешивают указанные компоненты: пептон — 20 г; однозамещенный фосфорно-кислый натрий — 2,5 г; хлорид натрия — 1 г; 0,5%-й раствор серно-кислого магния — 1 см3, глюкоза — 1 г; агар — 12,5 г; дистиллированная вода — 500 см3. Смесь нагревают до растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 121 °C в течение 15 мин и охлаждают до 60 °C.
Скорлупу яйца дезинфицируют спиртом. Яйцо разбивают, отделяют желток от белка и переносят с соблюдением правил асептики в расплавленный агар. Агар перемешивают до получения однородной суспензии, разливают по чашкам и оставляют до полного затвердевания.
Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C в течение 10 дней, не более.
10. Проведение измерения
10.1. Отбор проб воздуха
Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96. ГСИ. «Методики выполнения измерений».
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96°-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
10.2. Выполнение анализа
При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (ГПА) расплавляют, остужают до 50 — 60 °C, с соблюдением правил асептики вносят стерильный раствор циклогексимида из расчета 0,5 г/л среды (для подавления посторонней микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.
Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее, чем на 18 ч. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 — 8) °C не более 10 дней.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28 +/- 2) °C. Через 1 — 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам (прямой метод).
Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Y lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
Дополнительным функциональным методом является отбор пробы воздуха на чашки Петри с желточным агаром. После отбора проб воздуха чашки инкубируют в термостате при (28 +/- 2) °C в течение 48 — 72 ч и внимательно просматривают в косом освещении. Вокруг колоний штамма, продуцирующего липазу, образуются маслянистые, блестящие с переливами или перламутровые зоны.
11. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток производят по формуле:
К = (П x 1 000)/C x T, кл/м3, где
К — концентрация штамма в воздухе, кл/м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1 000 — коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
C — скорость аспирации воздуха, л/мин;
12. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.
Протокол № количественного микробиологического анализа Y. lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 в воздухе рабочей зоны
1. <a id="p100156"></a>Дата проведения анализа ____________________________________________
2. <a id="p100157"></a>Рабочее место (профессия работающего) ______________________________
3. <a id="p100158"></a>Место отбора пробы (название и адрес организации, производство,
технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________
3. <a id="p100159"></a>Вид пробоотборника _________________________________________________
4. <a id="p100160"></a>Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб
_______________________________________________________________________
5. <a id="p100161"></a>Питательная среда, время инкубации _________________________________
6. <a id="p100162"></a>Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ____________
7. <a id="p100163"></a>Количественная и качественная характеристика выросших колоний
(количество типичных колоний) _____________________________________________
8. <a id="p100164"></a>Результаты идентификации микроорганизмов Y. lipolytica 2kp ВКПМ
Y-4043 (морфологические признаки) _________________________________________
9. <a id="p100165"></a>Результаты расчета концентрации штамма _____________________________
10. <a id="p100166"></a>Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК ______________
р.з.
11. <a id="p100167"></a>Отбор пробы произведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________
_______________________________________________________________________
12. <a id="p100168"></a>Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (Ф.И.О.,
должность, дата, подпись) _________________________________________________ _______________________________________________________________________