Скачать PDF

МР 4.2.0219-20. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Выделение и очистка F1-антигена чумного микроба. Методические рекомендации

№ МР 4.2.0219-20Действующий акт

Актуально на 30.10.2026.

Как цитировать: "МР 4.2.0219-20. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Выделение и очистка F1-антигена чумного микроба. Методические рекомендации". МР 4.2.0219-20. https://bukva.ai/docs/mr-4-2-0219-20

(утв. Роспотребнадзором 10.11.2020)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 10 ноября 2020 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ

И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА F1-АНТИГЕНА ЧУМНОГО МИКРОБА

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МР 4.2.0219-20

1. Разработаны ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора (С.Ф. Бикетов, Б.В. Баранова, П.Х. Копылов, О.Н. Перовская, Р.З. Шайхутдинова, Т.Б. Кравченко, С.А. Иванов, С.В. Дентовская, П.В. Соловьев, В.В. Фирстова, М.В. Храмов, И.А. Дятлов), ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт „Микроб“ Роспотребнадзора (А.В. Бойко, Т.Л. Захарова, Н.А. Осина, З.Л. Девдариани, Н.А. Сырова, С.А. Щербакова, В.В. Кутырев).»

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 10 ноября 2020 г.

3. Введены впервые.

I. Область применения

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее — МР) определяют алгоритм получения препаратов нативного и рекомбинантного капсульного антигена чумного микроба (F1, Caf1).

1.2. МР разработаны для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами других лабораторий, проводящих разработку диагностических и вакцинных препаратов против чумы и имеющих разрешение на работу с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) <1>.

<1> СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2008 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 21.02.2008, регистрационный номер 11197), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 02.06.2009 № 42 (зарегистрировано Минюстом России 08.07.2009, регистрационный номер 14280); от 29.06.2011 № 86 (зарегистрировано Минюстом России 12.07.2011, регистрационный номер 21317) (далее — СП 1.3.2322-08).

II. Общие положения

2.1. Yersinia pestis — один из наиболее патогенных для человека микроорганизмов, который в течение длительного времени циркулирует на территориях природных очагов, находящихся на всех континентах, кроме Австралии и Антарктиды [1]. Штаммы Y. pestis ежегодно выделяют в природных очагах чумы, находящихся на территории Российской Федерации и сопредельных государств. Сохраняется угроза применения чумного микроба в качестве агента биотерроризма [2 - 4].

Одним из основных иммунодоминантных антигенов Y. pestis является капсульный антиген или «фракция 1» (F1, Caf1). Капсула, придающая клетке чумного микроба устойчивость к фагоцитозу, является основным компонентом противочумных субъединичных вакцин [5 - 8] и мишенью для лабораторной диагностики чумы [9]. Синтез F1-антигена детерминируется локализованным на плазмиде pFra опероном caf, включающим ген структурной субъединицы капсульного антигена caf1, гены периплазматического шаперона caf1M и молекулярного ашера caf1A, ответственные за сборку субъединиц и транспорт капсульного антигена на поверхность бактерий, а также ген caf1R температурозависимого регулятора экспрессии трех остальных генов оперона. Синтез капсулы индуцируется при попадании чумного микроба в организм млекопитающего или культивировании на искусственных питательных средах при температуре 37 °C [10, 11]. Капсульный антиген F1 находится на внешней мембране Y. pestis в виде грануляционного слоя, постепенно диффундирующего в окружающую среду [12]. Капсульный полимер при физиологических условиях представляет собой гомоагрегат большого числа субъединиц гидрофобного белка. Субъединица F1-антигена изначально синтезируется в виде полипептида, состоящего из 170 аминокислот с молекулярной массой 17,6 кДа, из которого после удаления лидерного пептида из 21 аминокислоты в ходе секреции на поверхность клетки формируется белок с молекулярной массой 15,6 кДа и изоэлектрической точкой pI = 4,1 [13].

Классический метод выделения капсульного антигена существует с 1952 г. [14 - 16]. В его основе лежит экстракция белка из ацетонвысушенных микробных клеток чумного микроба 2,5%-м раствором хлорида натрия в течение суток при комнатной температуре и последующее переосаждение сульфатом аммония. Дополнительная очистка белка методами колоночной, гель-проникающей, гидрофобной хроматографии позволяет получить препараты, лишенные полисахаридных примесей и представляющие собой монокомпонентную белковую систему [17, 18]. Высокой иммунохимической и протективной активностью обладают также препараты рекомбинантного капсульного антигена, полученные из штамма-продуцента Y. pseudotuberculosis 11M/pFSK3, характеризующегося высоким уровнем биосинтеза целевого белка [19]. Работы по созданию новых и усовершенствованию существующих чумных диагностических и вакцинных препаратов обусловливают необходимость стандартизации методики выделения и очистки капсульного антигена чумного микроба.

2.2. Представленный в МР алгоритм выделения капсульного антигена F1 позволяет, в зависимости от стоящей задачи, выбрать необходимые подходы для получения препаратов различной степени чистоты или уровня полимеризации. Различия в методиках выделения, дополнительные этапы для очистки одного и того же препарата из разных штаммов обусловлены свойствами и составом исходных фракций и требованиями к чистоте целевых препаратов. Описанные методические приемы можно использовать при работе с любыми аттенуированными штаммами Y. pestis и другими штаммами, являющимися продуцентами рекомбинантного F1-антигена, при условии, что белок секретируется микробными клетками в культуральную среду. Особое внимание следует обратить на то, что от степени полимеризации белка и его концентрации зависит вязкость препаратов F1-антигена.

Данный метод, в том числе обеззараживание материала, проводится в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <2>.

<2> СП 1.3.2322-08.

2.3. Материально-техническое обеспечение метода представлено в приложении 1 к настоящим МР.

III. Получение препаративных количеств нативного капсульного антигена F1

Выделение капсульного антигена F1 из микробных клеток Y. pestis EV76

3.1. Культуру микробных клеток Y. pestis EV76 (глава 1 приложения 2 к настоящим МР) смывают с поверхности агара фосфатно-солевым буфером (pH 8,5). Микробные клетки осаждают центрифугированием при 7000 x g в течение 15 мин. Супернатант собирают. Осадок суспендируют в фосфатно-солевом буфере (pH 8,5) и центрифугируют при 7000 x g в течение 15 мин. Процедуру повторяют. На данном этапе капсульный антиген F1 смывается с поверхности микробных клеток в супернатант. Супернатанты объединяют. Наличие капсульного антигена F1 Y. pestis в супернатанте контролируют с помощью иммунохроматографической тест-системы для экспресс-выявления и идентификации возбудителя чумы (по инструкции производителя).

Очистка нативного капсульного антигена F1 Y. pestis

3.2. Принцип очистки капсульного антигена F1 Y. pestis состоит в последовательном использовании двух видов селективной преципитации белков: насыщенным раствором аммония сернокислого и в изоэлектрической точке.

К бесклеточной фракции, содержащей капсульный антиген F1 Y. pestis, постепенно при перемешивании добавляют аммоний сернокислый до 33% от насыщения, контролируя визуально полное растворение соли, и выдерживают при температуре 4 °C в течение 12 ч. Сформированный преципитат осаждают центрифугированием при 10000 x g в течение 20 мин. Преципитат растворяют в фосфатно-солевом буфере (pH 8,5) и проводят титрование раствора 0,1 М соляной кислотой до значения pH (4,05 +/- 0,05) (изоэлектрическая точка F1 Y. pestis). Преципитат капсульного антигена отделяют центрифугированием при 10000 x g в течение 20 мин и растворяют в фосфатно-солевом буфере. Препарат хранят в растворе с 60%-м насыщением аммонием сернокислым при температуре минус 20 °C. Для проведения анализа капсульного антигена F1 Y. pestis 0,002 г преципитата растворяют в 0,001 л раствора 0,002 М Трис-HCl (pH 7,2) и диализуют против дистиллированной воды в течение 4 ч.

IV. Получение препаративных количеств рекомбинантного капсульного антигена F1

Выделение рекомбинантного капсульного антигена F1

4.1. По окончании процесса культивирования (глава 2 приложения 2 к настоящим МР) микробные клетки штамма-продуцента осаждают центрифугированием при 7000 x g в течение 15 мин. Наличие капсульного антигена F1 в супернатанте контролируют с помощью иммунохроматографической тест-системы для экспресс-выявления и идентификации возбудителя чумы «ИХ тест-система Y. pestis» (по инструкции производителя).

Измеряют объем полученной надосадочной фракции (супернатанта) штамма-продуцента F1-антигена и взвешивают необходимое количество сернокислого аммония исходя из того, что его конечная концентрация после полного растворения соли должна составлять 33% от насыщения. К надосадочной фракции культуральной жидкости небольшими порциями добавляют навеску сернокислого аммония при непрерывном перемешивании таким образом, чтобы каждая часть добавленной соли растворялась полностью. Образовавшуюся взвесь перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре и оставляют на ночь при температуре 6 — 10 °C. Взвесь осветляют центрифугированием при 10000 x g в течение 20 мин, надосадочную часть удаляют. Осадок растворяют полностью в 0,01 М Трис-HCl буферном растворе (pH 8,0), объем которого составляет 1/5 от первоначального объема. Проводят повторное осаждение белка аммонием сернокислым при тех же концентрационных условиях с последующим отделением белка центрифугированием из образованной суспензии. Влажный осадок растворяют в 1 М растворе сернокислого аммония, содержащем 0,02 М Трис-HCl, pH 8,0 и отделяют нерастворившийся остаток центрифугированием при 15000 x g в течение 30 мин и температуре 20 °C.

Хроматографическая очистка рекомбинантного капсульного антигена F1

4.2. Очистку рекомбинантного капсульного антигена F1 проводят с последовательным использованием гидрофобной хроматографии, гель-проникающей хроматографии и аффинной хроматографии на сорбенте со связанным полимиксином.

Рабочие параметры используемых колонок и сорбентов (оптимальная скорость потока через 1 см2, максимальная скорость потока через 1 см2, предельное давление, высота слоя сорбента, сорбционная емкость, допустимые параметры буферных растворов, условия санации) определяют на основе данных, приведенных в соответствующих паспортах и сертификатах производителей.

Раствор рекомбинантного F1-антигена пропускают через хроматографическую колонку (размерность 50/20) с сорбентом для хроматографии фенил-сефарозой, предварительно уравновешенным 0,02 М Трис-HCl буфером, pH 8,0, содержащим 1,0 М аммония сернокислого, и промывают 1,0 л того же буфера. Затем через колонку последовательно пропускают 0,8 л 0,35 М аммония сернокислого в 0,02 М Трис-HCl буфере, pH 8,0 и 0,8 л деионизованной воды, собирая фракции объемом 0,05 л. Все собранные фракции анализируют при помощи электрофореза в 12,5%-м полиакриламидном геле (далее — ПААГ). Фракции, содержащие целевой белок, объединяют.

Удаление аммония сернокислого и замену буферного раствора производят гель-проникающей хроматографией на колонке ХК 50/100 с сорбентом для эксклюзионной хроматографии биомолекул размером до 10 кДа, предварительно уравновешенным 0,01 М фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,02 М хлористого натрия. Фракцию очищенного F1-антигена собирают сразу же после прохождения свободного объема колонки и концентрируют на мембране для ультрафильтрации (с пределом исключения 10 кДа) таким образом, чтобы концентрация белка не превышала 1,0 мг/мл.

Для удаления из препарата следов эндотоксина концентрированный раствор F1-антигена пропускают через хроматографическую колонку (размерность 16/10) с сорбентом для аффинной хроматографии, несущим полимиксин B, для удаления эндотоксина; хроматографию проводят в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,02 М хлористого натрия. Собирают фракцию, содержащую F1-антиген, после прохождения свободного объема. Регенерацию хроматографической колонки (удаление связанного эндотоксина) проводят по инструкции производителя.

Методические подходы, описанные в главах III и IV, позволяют получить препаративные количества нативного или рекомбинантного капсульного антигена F1 высокой степени чистоты (не менее 95%), пригодного для включения в состав субъединичных и комбинированных противочумных вакцин, иммунохроматографических экспресс-тестов и пр.

V. Получение полупрепаративных количеств нативного капсульного антигена F1 с помощью иммуноаффинной хроматографии

Процедура подготовки к проведению иммуноаффинной хроматографии капсульного антигена F1

5.1. Для полупрепаративного выделения капсульного F1-антигена с помощью иммуноаффинной хроматографии полученный супернатант, содержащий F1 (пункт 3.1), фильтруют через нитроцеллюлозный фильтр с размерами пор 0,2 мкм, который предварительно обрабатывают 1%-м раствором бычьего сывороточного альбумина (далее — БСА) (через фильтр дважды с интервалом в 40 — 60 мин пропускают 1%-й раствор БСА, содержащий мертиолят натрия с конечным разведением 1:10000) и доводят pH полученного фильтрата до 7,0 — 7,2. Проводят определение специфической стерильности супернатантов, содержащих капсульный антиген чумного микроба (пункт 3.1 приложения 2 к настоящим МР).

При подготовке колонок и проведении хроматографии рабочие параметры различных колонок и сорбентов (оптимальная скорость потока через 1 см2, максимальная скорость потока через 1 см2, предельное давление, высота слоя сорбента, сорбционная емкость, допустимые параметры буферных растворов, условия санации) определяют на основе данных, приведенных в соответствующих паспортах и сертификатах производителей.

Для очистки капсульного антигена осуществляют подготовку иммуноаффинного сорбента.

Приготовление иммуносорбента с моноклональными антителами (далее — МКА), специфичными к F1-антигену чумного микроба

5.2. Для приготовления иммуносорбента отбирают 10 мл сорбента сефарозы 6B и промывают его на пористом стеклянном фильтре 5 — 10 объемами дистиллированной воды. Затем удаляют большую часть воды, удерживаемой гелем. Отмытый сорбент помещают в колбу вместимостью 100 мл и вносят 20 — 25 мл 0,2 М раствора периодата натрия. Полученную смесь медленно перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре для активации геля.

Активированный гель фильтруют на пористом стеклянном фильтре, промывают 5 — 10 объемами дистиллированной воды, а затем 5 — 10 объемами 0,01 М натрийбикарбонатного буфера pH 9,5 (3 части раствора 0,1 М карбоната натрия (Na2CO3) и 7 частей раствора 0,1 М бикарбоната натрия (NaHCO3)).

Для иммобилизации МКА на активированном сорбенте готовят разведение мышиных моноклональных антител (иммуноглобулины класса G), специфичных к капсульному антигену F1 чумного микроба (гибридома IB3, 3F10 или аналог), в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) до конечной концентрации 8 мг/мл в объеме не менее 8,5 мл. К полученному раствору добавляют 0,5 мл 0,2 М раствора карбоната натрия.

Для приготовления иммуноаффинного сорбента подготовленные, как описано выше, активированный гель сефарозы и раствор моноклональных антител смешивают из расчета 1,2 — 1,5 части геля на 1 часть раствора антител (например, 10 мл активированного геля и 8,5 мл раствора антител) при постоянном помешивании. Иммобилизацию осуществляют при температуре 4 — 8 °C в течение 48 ч при медленном вращении колбы. Затем все несвязавшиеся антитела удаляют путем фильтрования на пористом стеклянном фильтре и промывают 50-кратным количеством ледяного 0,02 М фосфатно-солевого буфера pH 7,4. После этого отжимают жидкость, удерживаемую частицами сенсибилизированного моноклональными антителами геля.

Для восстановления шиффовых соединений и оставшихся свободными альдегидных групп к сенсибилизированному гелю добавляют свежеприготовленный раствор борогидрида натрия (NaBH4), содержащего 1 мг борогидрида натрия в 1 мл 0,02 М фосфатно-солевого буфера (pH 7,4). Раствор борогидрида натрия добавляют к гелю из расчета 2 мл на 1 г геля и инкубируют при температуре 4 — 6 °C при медленном помешивании в течение 1 ч. Затем гель промывают 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pH 7,2 — 7,4) (30 — 40 объемов буфера на 1 объем геля), а затем — 0,1 М глицин-HCl буфером (pH 2,7 — 2,9), используемым в дальнейшем при получении антигена F1. Отмывка продолжается до тех пор, пока после контакта с гелем оптическая плотность данного буфера, не станет менее 0,01 при длине волны 280 нм. Затем сенсибилизированный гель тщательно промывают 0,02 М фосфатно-солевым буфером pH 7,4 (объем буфера из расчета 5 — 10 объемов геля). Для хранения полученный иммуноаффинный сорбент промывают 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pH 7,2 — 7,4) с добавлением мертиолята натрия в конечном разведении 1:10000 и помещают в темное место при температуре 4 — 6 °C.

Получение капсульного F1-антигена чумного микроба методом иммуноаффинной хроматографии в центрифужных пробирках

5.3. В центрифужную пробирку вместимостью 15 мл вносят 2 мл иммуносорбента и 2 мл супернатанта, содержащего антиген F1. Пробирку инкубируют при комнатной температуре в течение 30 — 60 мин при постоянном медленном перемешивании, а затем в течение 10 — 16 ч при температуре 4 — 6 °C. После инкубации иммуносорбент со связанным антигеном F1 промывают 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pH 7,2 — 7,4) путем центрифугирования при температуре 5 °C в течение 15 мин при 2400 x g. Отмывку иммуносорбента продолжают до тех пор, пока оптическая плотность супернатанта при длине волны 280 нм будет не более 0,01.

После отмывки иммуносорбент со связанным антигеном суспендируют в 5 мл элюирующего буфера (0,1 М глицин-HCl буфер, pH 2,8). Суспензию инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин при постоянном перемешивании. Затем суспензию центрифугируют при температуре 5 °C в течение 15 мин при 2400 x g. Супернатант, содержащий антиген F1, собирают. Элюцию повторяют трижды. Надосадочные фракции с антигеном F1 всех трех порций объединяют и фильтруют на стеклянном пористом фильтре. Полученный фильтрат, содержащий антиген F1 без посторонних примесей, нейтрализуют путем диализа в 2 л 0,02 М фосфатно-солевого буфера (pH 7,2) с трехкратной сменой буфера для диализа. Для нейтрализации и замены буферного раствора может быть использована гель-проникающая хроматография с сорбентом для эксклюзионной хроматографии биомолекул размером до 10 кДа, предварительно уравновешенным 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,4), содержащим 0,02 М хлористый натрий. Фракцию очищенного F1-антигена собирают сразу же после прохождения свободного объема колонки. Затем осуществляют концентрирование полученного антигена с помощью ультрафильтрации или путем высушивания.

Выделение капсульного антигена F1 чумного микроба методом иммуноаффинной хроматографии на хроматографической колонке

5.4. В хроматографическую колонку (1 x 13 см) помещают 10 мл иммуносорбента. Затем вносят 2 мл супернатанта, содержащего антиген F1. Инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин. Затем осуществляют промывку 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pH 7,2) при комнатной температуре. Отмывку иммуносорбента продолжают до тех пор, пока оптическая плотность фосфатно-солевого буфера на выходе из колонки при длине волны 280 нм будет не более 0,01.

После отмывки иммуносорбент в колонке со связанным антигеном освобождают от лишнего буфера и добавляют 2 мл элюирующего буфера (0,1 М глицин-HCl буфер, pH 2,7 — 2,9). Колонку инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем собирают элюат в отдельные пробирки. Элюцию повторяю трижды. Все три порции элюата объединяют и нейтрализуют либо с помощью диализа, либо с помощью гель-проникающей хроматографии с сорбентом для эксклюзионной хроматографии биомолекул размером до 30 кДа. Затем осуществляют концентрирование полученного антигена с помощью ультрафильтрации или путем высушивания.

Восстановление иммуносорбента с МКА, специфичными к F1-антигену чумного микроба

5.5. Для повторного использования иммуносорбента проводят его восстановление. Гель промывают элюирующим 0,1 М глицин-HCl буфером (pH 2,7 — 2,9). Отмывка продолжается до тех пор, пока оптическая плотность данного буфера на выходе из колонки при длине волны 280 нм будет не более 0,01. Затем иммуносорбент тщательно промывают 0,02 М фосфатно-солевым буфером (pH 7,4) (объем буфера, используемого для промывки, составляет 5 — 10 объемов геля). Иммуноаффинный сорбент хранят в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (pH 7,2 — 7,4) с добавлением мертиолята натрия в конечном разведении 1:10000 в темном месте при температуре 4 — 6 °C.

VI. Валидация полученных препаратов F1-антигена

Определение концентрации капсульного антигена F1 Y. pestis

6.1. Концентрацию капсульного антигена F1 высокой степени чистоты определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм (коэффициент молярной экстинкции \epsilon = 5120\text{л} \times \text{см}^{- 1} \times \text{моль}^{- 1} ) с использованием сканирующего спектрофотометра.

Оценка чистоты препарата капсульного антигена F1

6.2. Результат освобождения препаратов F1-антигена от следов эндотоксинов оценивают путем электрофореза полученных фракций с последующей окраской геля нитратом серебра, спектрометрически и в ЛАЛ-тесте в соответствии с методическими указаниями <3>.

<3> МУК 4.1/4.2.588-96 «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям», утвержденные Госкомсанэпиднадзором России 31.10.1996 (далее — МУК 4.1/4.2.588-96).

Электрофоретическое определение чистоты препарата капсульного антигена F1

6.2.1. Проведение электрофореза. Электрофоретическое определение чистоты препарата капсульного антигена F1 проводят по методу Лэммли [19]. Для определения чистоты, гомогенности и молекулярной массы капсульного антигена F1 Y. pestis применяют метод вертикального электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия (далее — ДСН) в редуцирующих и нередуцирующих условиях с последующей окраской геля как кумасси ярко-голубым R-250, так и нитратом серебра. Образование комплекса ДСН с белком устраняет различия между белками, связанные с их зарядом, и переводит молекулы белков в конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы белка. При соблюдении этих условий подвижность белков отражает их молекулярные массы.

На рис. 1 и 2 представлены примеры анализа препаратов нативного и рекомбинантного F1-антигенов методом электрофореза в 12,5%-м ПААГ в денатурирующих условиях.

VI. Валидация полученных препаратов F1-антигена

Рис. 1. Электрофореграмма препарата нативного F1-антигена

Дорожка 1 — цитохром C (молекулярная масса 12,5 кДа); дорожки 2 — 5 - препараты F1-антигена разных серий; дорожка 6 — маркеры молекулярных масс

VI. Валидация полученных препаратов F1-антигена

Рис. 2. Электрофореграмма препарата рекомбинантного F1-антигена до (А) и после (Б) проведения дополнительной очистки

Дорожки 1, 4 — препараты F1-антигена; дорожки 2, 5 — рибонуклеаза A (мол. масса 15,7 кДа); дорожки 3, 6 — маркеры молекулярных масс

6.2.2. Определение молекулярных масс белков. Молекулярные массы мономеров и олигомеров исследуемого продукта определяют в соответствии с методическими указаниями <4> на электрофореграмме, полученной после окрашивания кумасси ярко-голубым R-250 в редуцирующих условиях при нагрузке на лунку 10 мкг белка. Проводят измерение расстояния от верхнего края нижнего разделяющего геля до белковых зон стандартных белков (дорожки 2 и 9) — величина R-белка. Таким образом определяют расстояние пробега красителя (величина R-стандарт). Для каждого стандартного белка определяют коэффициент подвижности (Ra) по формуле:

Ra = \frac{R\text{белка}}{R\text{стандарт}} . (1)

<4> МУК 4.1/4.2.588-96.

Строят график зависимости Ra стандартного белка от логарифма молекулярной массы стандартного белка. Затем определяют Ra для каждой белковой зоны исследуемого образца и по калибровочному графику определяют логарифмы молекулярной массы, из которых рассчитывают молекулярную массу соответствующих белков.

Определение молекулярных масс белков также проводится по цифровым изображениям электрофореграмм с помощью программного обеспечения.

6.2.3. Оценка результата электрофореза. После завершения электрофореза исследуемые образцы не должны содержать неидентифицированных продуктов или их агрегатов в лунках гребенки геля или на границе при вхождении в гель. Полученные препараты нативного и рекомбинантного F1-антигена должны обладать следующими характеристиками: на электрофореграмме в денатурирующих условиях мономерная форма F1-антигена представляет собой одну доминантную полосу с кажущейся молекулярной массой около 17 кДа.

Содержание нативного и рекомбинантного F1-антигена в полученных препаратах, оцениваемое по результатам денситометрии электрофореграммы, полученной в редуцирующих условиях при окрашивании кумасси ярко-голубым R-250, должно быть не менее 95%.

Спектрометрическая оценка чистоты препарата капсульного антигена F1

6.2.4. Чистота препарата капсульного антигена F1 дополнительно может быть определена путем определения спектра поглощения полученного препарата при длинах волн от 200 нм до 300 нм на сканирующем спектрофотометре (в соответствии с инструкцией к прибору).

Для препарата F1, полученного с помощью иммуноаффинной хроматографии (рис. 3), характерно наличие только 1 пика (при длине волны 218 нм).

Параметры максимума поглощения приведены ниже.

VI. Валидация полученных препаратов F1-антигена

Рис. 3. Спектр поглощения очищенного антигена F1 в интервале длин волн от 200 нм до 300 нм

Параметры максимума поглощения: длина волны — 218 нм, значение поглощения - 0,752

Определение чистоты препарата капсульного антигена F1 Y. pestis

6.2.5. Оценку результатов освобождения препаратов F1-антигена от следов эндотоксинов проводят в соответствии с методическими указаниями <5>. Тест основан на способности бактериального эндотоксина вызывать помутнение и загущение лизата амебоцитов мечехвоста Limulus polyphemus (далее — ЛАЛ-тест) в ходе энзиматической каскадной реакции активации ферментов, завершающейся расщеплением субстрата коагулогена на несколько полипептидных цепей, которые образуют пространственную гелеподобную структуру.

<5> МУК 4.1/4.2.588-96.

Концентрация эндотоксинов, определенная с помощью ЛАЛ-теста, в препаратах нативного и рекомбинантного F1-антигена не должна превышать 0,5 ЕЭ/мл.

Валидация иммунологической специфичности капсульного антигена F1

6.3. С помощью иммунологических методов (реакции двойной радиальной иммунодиффузии и иммуноблота) проводится контроль специфической активности полученных препаратов капсульного антигена F1 Y. pestis. Оба метода основаны на специфическом взаимодействии «антиген — антитело».

Реакция двойной иммунодиффузии (глава 4 приложения 2 к настоящим МР)

6.3.1. Реакцию двойной иммунодиффузии проводят по методу Оухтерлони [20]. В данном методе используют моноклональные антитела, специфичные к капсульному антигену F1 Y. pestis. Пример результата анализа приведен на рис. 4. Оценку результата проводят согласно пункту 4.4 приложения 2 к настоящим МР.

VI. Валидация полученных препаратов F1-антигена

Рис. 4. Реакция радиальной двойной иммунодиффузии с использованием моноклонального антитела, специфичного к капсульному антигену F1 Y. pestis

Лунки 1 — 4 - опытные препараты антигена F1

Иммуноблот (глава 5 приложения 2 к настоящим МР)

6.3.2. Иммуноблот проводят по общепринятой методике [21, 22] с использованием моноклонального антитела, специфичного к капсульному антигену F1 Y. pestis (рис. 5). Оценку результата проводят согласно пункту 5.2 приложения 2 к настоящим МР.

VI. Валидация полученных препаратов F1-антигена

Рис. 5. Иммуноблот препаратов F1-антигена Y. pestis

Дорожки 1 — 2 - опытный препарат F1-антигена высокой степени чистоты; дорожка 3 — препарат F1-антигена до очистки

Приложение 1 к МР 4.2.0219-20

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА <6>

<6> Примечание: допускается использование оборудования, вспомогательных материалов с аналогичными или лучшими характеристиками; реагентов, диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

1. В работе используются следующие реагенты:

  • натрий углекислый (хч) по ГОСТ 83;
  • натрий углекислый кислый (хч) по ГОСТ 4201;
  • соляная кислота (осч) ГОСТ 14261;
  • фосфатно-солевой буфер в таблетках для приготовления 0,02 М буфера с pH 7,3 — 7,5, содержащего 0,137 моль/л NaCl и 0,0027 моль/л KCl;
  • акриламид (хч);
  • бисакриламид (хч);
  • додецилсульфат натрия для электрофореза;
  • тетраметилэтилендиамин для электрофореза;
  • 2-меркаптоэтанол для электрофореза;
  • бромфеноловый синий для электрофореза;
  • Кумасси ярко-голубой R-250 для электрофореза;
  • сорбент для эксклюзионной хроматографии биомолекул размером до 10 кДа;
  • сорбент хроматографический фенил-сефароза;
  • сорбент для аффинной хроматографии несущий полимиксин B для удаления эндотоксина;
  • 3,3'диаминобензидин тетрагидрохлорид, квалификация не ниже «хч»;
  • натрия периодат NaIO4, квалификация не ниже хч;
  • натрия борогидрид NaBH4, квалификация не ниже хч;
  • натрия мертиолят, квалификация не ниже хч;
  • глицин, квалификация не ниже хч;
  • амидочерный 10B, квалификация не ниже хч;
  • твин-20, квалификация не ниже хч;
  • хлорид кальция, квалификация не ниже хч;
  • аммоний сернокислый, квалификация не ниже хч;
  • магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523;
  • натрий хлористый (хч) по ГОСТ 4233;
  • натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный (ч) по ГОСТ 4172;
  • калий фосфорнокислый однозамещенный (хч) по ГОСТ 4198;
  • натрия тиосульфат кристаллический по ГОСТ 244;
  • марганец сернокислый одноводный по ТУ 6-47-53028-10;
  • медь (II) сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165;
  • цинк сернокислый 7-водный по ГОСТ 4174;
  • железо (II) сернокислое 7-водное по ГОСТ 4148;
  • агар Хоттингера по ТУ 9385-194-78095326;
  • солянокислый гидролизат казеина по ТУ 9385-077-78095326;
  • дрожжевой экстракт по ТУ 9182-001-23206313;
  • D-глюкоза по ГОСТ 6038;
  • антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена;
  • агар;
  • маркеры молекулярных масс (смесь стандартных белков для электрофореза, диапазон 10 — 200 кДа);
  • рибонуклеаза A;
  • набор реагентов для окрашивания геля нитратом серебра;
  • бычий сывороточный альбумин;
  • физиологический раствор (0,9% раствор натрия хлорида стерильный) pH 7,2;
  • вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
  • водорода перекись 33% по ТУ 6-02-570;
  • спирт этиловый по ГОСТ 5962;
  • препарат по типу «Детергент 7X»;
  • канамицина сульфат по ТУ 64-3-189.

2. В работе используются следующие диагностические препараты:

  • бактериофаг чумной Покровской;
  • бактериофаг псевдотуберкулезный;
  • иммунохроматографическая тест-система для экспресс-выявления и идентификации возбудителя чумы «ИХ тест-система Y. pestis» по ТУ 9398-091-78095326 или другая тест-система с аналогичными характеристиками;
  • ЛАЛ-тест (лизата амебоцитов мечехвоста Limulus polyphemus) (определение эндотоксинов, хромогенный тест, 405 нм);
  • МКА — моноклональное антитело (класса G), специфичное к антигену F1 чумного микроба (например, гибридома IB3; гибридома 3F10 или аналогичные);
  • кровь гемолизированная, раствор для диагностических целей по ТУ 8991-001-01898109.

3. В работе используется следующее оборудование:

  • термостат электрический суховоздушный с температурой (37 +/- 1) °C по ТУ 9452-002-00141798;
  • холодильник для хранения крови, вакцин и медицинской продукции в условиях стабильных и низких температур по ГОСТ 25336;
  • мутномер (денситометр) для определения мутности бактериальной суспензии;
  • дистиллятор лабораторный для получения дистиллированной воды, соответствующей ГОСТ 6709;
  • стерилизатор воздушный с перфорированной П-образной панелью в камере по ТУ 9451-011-00141798;
  • микроскоп биологический для клинических исследований с принадлежностями;
  • центрифуга с охлаждением с ротором емкостью до 6,0 л, скорость вращения 6000 об./мин;
  • сканирующий спектрофотометр с диапазоном длин волн света 180 — 800 нм;
  • pH-метр с диапазоном измерений pH 1 — 14, комбинированный электрод;
  • весы лабораторные электронные до 1200 г (нелинейность +/- 0,0002 г);
  • вибрационная мешалка, скорость вращения до 1200 об./мин;
  • магнитная мешалка, скорость вращения до 600 об./мин;
  • термостатируемый шейкер орбитальный с платформой контейнерного типа, скорость вращения платформы 100 — 1300 об./мин;
  • аппарат для вертикального мини-электрофореза в полиакриламидном геле, размер гелей не менее 6 x 10 см, толщина гелей 0,75 — 1,0 мм (1,2 или более гелей одновременно);
  • аппарат для полусухого или «мокрого» переноса белков из гелей на мембраны, размер поля переноса не менее 6 x 10 см;
  • дозаторы механические лабораторные с фиксированными и переменными объемами доз, одно- и восьмиканальные (объемы 0,5 — 10, 20 — 200, 50 — 300, 100 — 1000 мкл) по ГОСТ 28311.

4. В работе используются следующие вспомогательные материалы:

  • оптический отраслевой стандарт мутности 10 ЕД;
  • спиртовка СЛ-2 по ГОСТ 25336;
  • колбы мерные вместимостью 50, 300, 500 мл по ГОСТ 1770;
  • колбы качалочные по ТС ТУ 92-891.029;
  • цилиндры мерные по 50, 100 и 500 мл по ГОСТ 1770;
  • пробирки стеклянные по ГОСТ 1770;
  • пробирки центрифужные стеклянные с делениями вместимостью (10,0 +/- 0,2) мл по ГОСТ 1770;
  • флаконы стеклянные вместимостью 50 мл;
  • пипетки, градуированные вместимостью 5,0 и 10,0 мл по ГОСТ 29227;
  • пористый стеклянный фильтр по ГОСТ 25336;
  • центрифужные пробирки вместимостью 15 мл, ФСЗ 2012/11892;
  • хроматографические колонки (размерность 16/10, 50/20, 50/100);
  • мембрана для ультрафильтрации с пределом исключения 10 кДа;
  • наконечники к дозаторам механическим (до 10 мкл, до 100 мкл, до 200 мкл, до 1000 мкл);
  • пробирки конические пластиковые;
  • пробирки микроцентрифужные вместимостью 1,5 мл, стерильные;
  • бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026;
  • перчатки хирургические резиновые по ГОСТ 3;
  • нитроцеллюлозная мембрана 0,45 мкм;
  • вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.

Приложение 2 к МР 4.2.0219-20

МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКИ F1-АНТИГЕНА Y. PESTIS

1. Культивирование штамма-продуцента F1-антигена Y. pestis EV76

1.1. Культивирование микробных клеток вакцинного штамма Y. pestis EV76 проводят на агаре Хоттингера с добавкой сульфата магния до 0,25%, кальция хлорида до 0,025%, гемолизированной крови до 0,1% при температуре 37 °C в течение 48 ч. Микробиологическую чистоту культуры контролируют микроскопией и наличием пятен лизиса после обработки бактериофагом Покровской.

2. Культивирование штамма-продуцента F1-антигена Y. pseudotuberculosis 11M/pFSK3

2.1. Культивирование посевного материала Y. pseudotuberculosis 11M/pFSK3 проводят на агаре Хоттингера с добавлением канамицина сульфата до конечной концентрации 0,04 г/мл при температуре 28 °C в течение 24 ч. Микробиологическую чистоту культуры контролируют микроскопией и наличием пятен лизиса после обработки псевдотуберкулезным бактериофагом. Для посева на жидкую питательную среду культуру с чашки Петри смывают 5,0 мл фосфатно-солевым буфером и засевают в жидкую питательную среду следующего состава (на 1,0 л):

- солянокислый гидролизат казеина (150 мг %) - 36,5 г;
- дрожжевой экстракт - 7,0 г;
- сульфат магния (MgSO4) - 0,5 г;
- фосфат натрия двузамещенный (Na2HPO4) - 6,0 г;
- фосфат калия однозамещенный (KH2PO4) - 4,0 г;
- тиосульфат натрия (Na2S2O3) - 0,6 г;
- глюкоза - 4,0 г;
- микроэлементы - 0,01 л;
- канамицина сульфат - 0,04 г.

Состав раствора микроэлементов для приготовления 0,1 л:

- сульфат цинка семиводный - 0,01 г;
- сульфат марганца пятиводный - 0,01 г;
- сульфат меди пятиводный - 0,02 г;
- сульфат железа (II) семиводный - 0,01 г.

2.2. Культивирование проводят в термостатируемом шейкере в качалочных колбах вместимостью 0,75 л, в которые вносят 0,2 л питательной среды и 0,001 л посевного материала, при температуре 28 °C и ротации 180 об./мин в течение 16 ч.

3. Проверка специфической стерильности

Посев на питательные среды

3.1. Материал, выделенный из штаммов, относящихся к III группе патогенности, должен пройти проверку на стерильность перед передачей в помещения, предназначенные для проведения биохимических работ.

Проверяемый препарат белков засевают по 0,2 мл на три чашки Петри с агаром Хоттингера, содержащем в качестве стимулятора роста 2% гемолизированной крови, а также в три пробирки с полужидкой тиогликолевой средой уколом с использованием бактериологической петли объемом 10 мкл.

Для контроля ростовых качеств плотной питательной среды на чашку агара Хоттингера, содержащего 2% гемолизированной крови, засевают по 0,1 мл суспензии исходного штамма Y. pestis (по одной чашке) из приготовленного разведения культуры, предположительно содержащего 1000 м.к./мл.

Для контроля ростовых качеств тиогликолевой среды в нее производят посев уколом петлей из той же суспензии.

Для контроля стерильности питательной среды две чашки агара Хоттингера, содержащего 2% гемолизированной крови, и две пробирки с полужидкой тиогликолевой средой оставляют незасеянными. Посевы инкубируют в течение 7 суток при температуре 28 °C.

Постановка биопробы

3.2. По 0,2 мл проверяемой белковой суспензии вводят подкожно пяти белым мышам <7> линии BALB/c. В качестве контроля трем белым мышам линии BALB/c вводят по 0,2 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия. Наблюдение за животными проводят в течение 7 дней.

<7> Для чистоты эксперимента используют мышей линии BALB/c.

При отсутствии гибели мышей и отсутствии роста в обеих питательных средах как на незасеянных чашках и пробирках, так и засеянных проверяемой белковой суспензией, а также при наличии роста контрольного штамма на обеих средах образцы считаются обеззараженными.

4. Реакция радиальной двойной иммунодиффузии

Сведения о микровариантном методе

4.1. Микровариант метода [20] основан на специфическом взаимодействии «антиген — антитело».

В слое агара равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки для внесения растворов антигена или антител. После внесения растворов в лунки эти компоненты начинают диффундировать радиально в гель. Встречаясь друг с другом, антигены и антитела начинают образовывать иммунные комплексы, которые преципитируют в ячейках геля и становятся видимыми, (линии преципитации). Двойную радиальную иммунодиффузию проводят на предметных стеклах (микрометод).

Для работы необходимо иметь специфические МКА, очищенный агар, который можно заменить агарозой. В качестве растворителей для агара используют 0,15 М хлорид натрия.

Приготовление геля и проведение иммунодиффузии

4.2. Расплавляют 1,5 г агара в 100,0 мл раствора 0,15 М хлорида натрия. Порциями по 3 мл горячий агаровый золь наносят на строго горизонтально установленные предметные стекла для того, чтобы получить равномерный слой агара толщиной приблизительно 1,5 мм. После застывания агара пластинки готовы к употреблению. Рекомендуется сначала наносить на стекла по 1,0 мл горячего золя агарозы (10 г/л), который затем высушивают при температуре 70 °C. Образующаяся при высушивании пленка агара усиливает сцепление геля с поверхностью стекла. В агаре вырезают лунки для антигена или антитела при помощи готовых штампов или вырезают их стеклянной (можно металлической) трубочкой. Лунки должны отстоять друг от друга по меньшей мере на 4 мм, расстояние более 10 мм употребляется редко.

Проведение реакции

4.3. После внесения в центральную лунку раствора моноклонального антитела, специфичного к капсульному антигену F1 Y. pestis (0,1 мг/мл), и в периферические лунки антигенов (0,1 мг/мл) иммунодиффузию проводят во влажной камере при температуре 4 °C, 20 °C или 37 °C. Продолжительность диффузии должна быть не менее 24 ч. Более продолжительная инкубация не приводит к изменениям преципитатов. В случае продолжительной иммунодиффузии пластины следует ежедневно контролировать. По окончании иммунодиффузии можно либо непосредственно оценивать результаты по влажному препарату, либо сначала отмыть непреципитирующие субстанции. Для этого замачивают пластины 2 — 3 раза на 12 часов в 0,15 М растворе хлорида натрия. Затем на поверхность геля кладут фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой, и гель высушивают при температуре 40 — 50 °C или при комнатной температуре. Высушенные пластины геля окрашивают обычно амидочерным 10B, после чего оценивают результаты иммунодиффузии.

Оценка результатов

4.4. При оптимальном соотношении между антигенами и антителами после окончания диффузии линия преципитации располагается примерно на середине расстояния между лунками. Если один из компонентов реакции присутствует в большем количестве, чем другой, то линия преципитации сдвигается в сторону лунки с меньшим содержанием реагента.

Расположение линий преципитации в результате прохождения реакции двойной радиальной иммунодиффузии свидетельствует, что испытуемые препараты содержат только идентичные антигенные детерминанты.

5. Иммуноблот

Постановка иммуноблота

5.1. Метод основан на специфическом взаимодействии «антиген — антитело». Антигены после электрофореза в 12,5%-м ПААГ переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Участки неспецифического связывания на мембране блокируют инкубацией мембраны в растворе 5,0%-го молока в фосфатно-солевой буфер-Твин (0,145 М хлористого натрия, 0,002 мМ Трис-HCl, 0,1% Твин-20, pH 7,4) при температуре 37 °C в течение 2 ч. Затем мембрану инкубируют в растворе моноклонального антитела, специфичного к капсульному антигену F1 Y. pestis (0,001 мг/мл), в течение 1 ч при температуре 37 °C. Мембрану трижды по 5 мин промывают в растворе фосфатно-солевой буфер-Твин и инкубируют в течение 1 ч при температуре 37 °C в рабочем разведении конъюгата антимышиных антител с пероксидазой хрена, определяемом в соответствии с инструкцией производителей. После четырехкратной отмывки по 5 мин мембрану помещают в раствор субстрата — 0,05% 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорида с добавлением 0,02% перекиси водорода (H2O2) в фосфатно-солевом буфере, pH 7,3 — 7,5. Результат регистрируют через 5 — 10 мин, останавливая реакцию промыванием мембраны в дистиллированной воде.

Оценка результатов

5.2. По результатам иммуноблота в препаратах нативного и рекомбинантного F1-антигена должна выявляться только одна специфически окрашенная полоса с кажущейся молекулярной массой около 17 кДа.

НОРМАТИВНЫЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и возбудителями паразитарных болезней».

3. СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».

4. МУК 4.1/4.2.588-96 «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям».

5. ГОСТ 83 «Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия».

6. ГОСТ 4201 «Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия».

7. ГОСТ 14261 «Кислота соляная особой чистоты. Технические условия».

8. ГОСТ 4523 «Магний серно-кислый 7-водный. Технические условия».

9. ГОСТ 4233 «Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».

10. ГОСТ 4172 «Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия».

11. ГОСТ 4198 «Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный».

12. ГОСТ 244 «Натрия тиосульфат кристаллический. Технические условия».

13. ГОСТ 4165 «Реактивы. Медь (II) сернокислая 5-водная. Технические условия».

14. ГОСТ 4174 «Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия».

15. ГОСТ 4148 «Железо (II) сернокислое 7-водное. Технические условия».

16. ГОСТ 6038 «D-глюкоза. Технические условия».

17. ГОСТ 6709 «Вода дистиллированная. Технические условия».

18. ГОСТ 5962 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия».

19. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».

20. ГОСТ 28311 «Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний».

21. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».

22. ГОСТ 1770 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».

23. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».

24. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».

25. ГОСТ 12026 «Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия».

26. ГОСТ 388 «Перчатки хирургические резиновые. Технические условия».

27. ГОСТ 5556 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».

28. Инструкция по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного или холерного микроба. Саратов, 1982. 8 с.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Perry, R.D. Yersinia pestis, etiologic agent of plague/R.D. Perry, J.D. Fetherson//Clin. Microbiol. Rev. 1997. Vol. 10. P. 35 — 66.

2. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири/Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. М: Медицина, 2004. 192 с.

3. Онищенко, Г.Г. Биотерроризм: национальная и глобальная угроза/Г.Г. Онищенко, Л.С. Сандахчиев, С.В. Нетесов, Р.А. Мартынюк//Вестник Российской академии наук. 2003. Т. 73. № 3. С. 195 — 204.

4. Kortepeter, M. Potential biological weapons threats/M. Kortepeter, G. Parker//Emerg. Infect. Dis. 1999. Vol. 5. P. 523 — 527.

5. Dentovskaya, S.V. Molecular bases of vaccine-prevention of plague/S.V. Dentovskaya, P.K. Kopylov, S.A. Ivanov, S.A. Ageev, A.P. Anisimov//Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2013. Vol. 28, № 3. P. 87 — 98.

6. Galen, J.E. A bivalent typhoid live vector vaccine expressing both chromosome — and plasmid-encoded Yersinia pestis antigens folly protects against murine lethal pulmonary plague infection/J.E. Galen, J.Y. Wang, J.A. Carrasco, S.A. Lloyd, G. Mellado-Sanchez, J. Diaz-McNair, et al.//Infect. Immun. 2015. Vol. 83. № 1. P. 161 — 172.

7. Huang, S.S. Development of Yersinia pestis F1 antigen-loaded microspheres vaccine against plague/S.S. Huang, I.H. Li, P.D. Hong, M.K. Yeh//Int. J. Nanomedicine. 2014. Vol. 9. P. 813 — 822.

8. Zhang, X. Kinetics of memory B cell and plasma cell responses in the mice immunized with plague vaccines/X. Zhang, Q. Wang, Y. Bi, Z. Kou, J. Zhou, Y. Cui, et al.//Scand. J. Immunol. 2014. Vol. 79. № 3. P. 157 — 162.

9. Russell, A.D. Microbial susceptibility and resistance to biocides/A.D. Russell, J.R. Fun, J.-Y. Maillard//ASM News. 1997. Vol. 63. P. 481 — 487.

10. Rowland, S. The morphology of the plague bacillus/S. Rowland//J. Hyg. 1914. Vol. 13. P. 418 — 422.

11. Schütze , H. Studies on Bacterium pestis antigens. III. The prophylactic value of the envelope and somatic antigens of B. pestis/H. Schütze //Br. J. Exp. Pathol. 1939. Vol. 19. P. 293 — 298.

12. Кадникова, Л.А. Капсульный антиген чумного микроба/Л.А. Кадникова, П.Х. Копылов, С.В. Дентовская, А.П. Анисимов//Инфекция и иммунитет. 2015. Т. 5. № 3. С. 201 — 218.

13. Karlyshev, A.V. A new gene of the f1 operon of Y. pestis involved in the capsule biogenesis/A.V. Karlyshev, E.E. Galyov, O. Yu. Smirnov, A.P. Guzayev, V.M. Abramov, V.P. Zav'yalov//FEBS Lett. 1992. Vol. 3, № 297 (1 — 2). P. 77 — 80.

14. Baker, E.E. Studies on immunization against plague. I. The isolation and characterization of the soluble antigen of the Pasteurella pestis./E.E. Baker, H. Sommer, L.E. Foster, E. Meyer, K.F. Meyer//J. Immunol. 1952. Vol. 68. P. 131 — 145.

15. Quenee, L.E. Yersinia pestis caf1 variants and the limits of plague vaccine protection/L.E. Quenee, C.A. Cornelius, N.A. Ciletti, D. Elli, O. Schneewind//Infect. Immun. 2008. Vol. 76, № 5. P. 2025 — 2036.

16. Титенко, М.М. Препаративный метод выделения и очистки капсульного антигена возбудителя чумы при помощи изоэлектрической преципитации/М.М. Титенко, В.И. Вейнблат, М.С. Веренков, А.С. Васенин//Диагностика и профилактика ООИ. Саратов, 1983. С. 34 — 39.

17. Reddin, K.M. Large-scale purification of the F1 antigen of Yersinia pestis/K.M. Reddin, T.J. Easterbrook, A. Robinson, D. Williamson, R. Rhind-tutt//Contrib. Microbiol. Immunol. 1995. Vol. 13. P. 329 — 330.

18. Kopylov, P.Kh. Yersinia pestis Caf1 protein: effect of sequence polymorphism on intrinsic disorder propensity, serological cross-reactivity and cross-protectivity of isoforms/P.Kh. Kopylov, M.E. Platonov, T.I. Kombarova, S.A. Ivanov, L.A. Kadnikova, A.N. Somov, S.V. Dentovskaya, A.P. Anisimov, V.G. Ablamunits, V.N. Uversky//PLoSONE. 2016. № 9. C. e0162308.

19. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4//Nature. 1970. Vol. 227. P. 680 — 685.

20. Ouchterlony, O. Antigen-antibody reactions in gels. Types of reactions in coordinated systems of diffusion/Acta. Pathol. Microbiol. Scand., 1953, 32, P. 231 — 242.

21. Renner S.W. Immunoblotting and dot immunobinding. Emerging echniques in protein immunochemistry//Arch. Pathol. Lab. Med. 1988. Vol. 112. P. 780 — 786.

22. Towbin, H. Immunoblotting and dot immunoblotting — current status and outlook/H. Towbin, J. Gordon//J. Immunol. Methods. 1984. Vol. 72. P. 313 — 340.