ФС.2.3.0006. Фармакопейная статья. Апротинин
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 № 377)
(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание»)
Примечание
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте https://minzdrav.gov.ru/ по состоянию на 16.08.2023. В соответствии с Приказом Минздрава России от 20.07.2023 № 377 данный документ введен в действие с 01.09.2023. Взамен ВФС 42-2175-92.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
| Апротинин Апротинин Aprotininum | ФС.2.3.0006 |
| Взамен ВФС 42-2175-92 |
| C284H432N84O79S7 [9087-70-1] |
М.м. 6511,4 |
|---|
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
S5,S55:S14,S38:S30,S51-Трицикло(L-аргинил-L-пролил-L-аспартил-L-фенилаланил-L-цистеинил-L-лейцил-L-глутамил-L-пролил-L-пролил-L-тирозил-L-треонилглицил-L-пролил-L-цистеинил-L-лизил-L-аланил-L-аргинил-L-изолейцил-L-изолейцил-L-аргинил-L-тирозил-L-фенилаланил-L-тирозил-L-аспарагинил-L-аланил-L-лизил-L-аланилглицил-L-лейцил-L-цистеинил-L-глутаминил-L-треонил-L-фенилаланил-L-валил-L-тирозилглицилглицил-L-цистеинил-L-аргинил-L-аланил-L-лизил-L-аргинил-L-аспарагинил-L-аспарагинил-L-фенилаланил-L-лизил-L-серил-L-аланил-L-глутамил-L-аспартил-L-цистеинил-L-метионил-L-аргинил-L-треонил-L-цистеинилглицилглицил-L-аланин).
Содержит не менее 90,0% и не более 110,0% заявленной активности апротинина C284H432N84O79S7 на сухое вещество.
СВОЙСТВА
Описание. Белый или почти белый порошок.
<*> Приводится для информации.
Растворимость. Растворим в воде и натрия хлорида растворе 0,9%, практически нерастворим в хлороформе.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
1. ТСХ (ОФС «Тонкослойная хроматография»).
Пластинка. ТСХ пластинка со слоем силикагеля 60 F254.
Подвижная фаза (ПФ). Вода — уксусная кислота ледяная, содержащая 100 г/л натрия ацетата безводного 40:50.
Испытуемый раствор. Готовят раствор, содержащий 27 000 КИЕ/мл апротинина.
Раствор стандартного образца апротинина. Фармакопейный стандартный образец апротинина разводят водой до получения раствора с активностью 27 000 КИЕ/мл.
Реактив для детектирования. Растворяют 0,1 г нингидрина в смеси 6 мл раствора меди(II) хлорида с концентрацией 10 г/л, 21 мл уксусной кислоты ледяной и 70 мл этанола.
На линию старта пластинки наносят по 10 мкл испытуемого раствора и раствора фармакопейного стандартного образца апротинина. Пластинку с нанесенными пробами сушат при температуре 60 °C, помещают в камеру с ПФ и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт ПФ пройдет около 80 — 90% длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей, опрыскивают реактивом для детектирования и просматривают в видимом свете.
Результат. Основная зона адсорбции на хроматограмме испытуемого раствора по положению, величине и окраске должна соответствовать зоне адсорбции апротинина на хроматограмме раствора стандартного образца апротинина.
2. Субстанция должна обладать антитрипсиновой активностью.
Испытуемый раствор. Готовят раствор, содержащий 27 000 КИЕ/мл апротинина. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора буферным раствором pH 7,2 до метки.
Раствор хлористоводородной кислоты 0,002 М. Разбавляют 2,0 мл хлористоводородной кислоты раствора 0,1 М водой до 100,0 мл.
Раствор стандартного образца трипсина. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 10 мг фармакопейного стандартного образца трипсина, растворяют в растворе хлористоводородной кислоты 0,002 М и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.
Растворитель. Уксусная кислота ледяная — вода — этанол 1:49:50.
Раствор казеина. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,2 г казеина, растворяют в буферном растворе pH 7,2 и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.
Смешивают 1,0 мл испытуемого раствора с 1,0 мл раствора стандартного образца трипсина, оставляют на 10 мин и прибавляют 1,0 мл раствора казеина. Полученный раствор термостатируют при температуре 35 °C в течение 30 мин, затем охлаждают в ледяной воде и прибавляют 0,5 мл растворителя, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 15 мин. Раствор должен мутнеть.
Контрольный раствор готовят в тех же условиях, используя буферный раствор pH 7,2 вместо испытуемого раствора. Контрольный раствор не должен мутнеть.
ИСПЫТАНИЯ
Прозрачность раствора. Раствор субстанции, содержащий 27 000 КИЕ/мл, должен быть прозрачным (ОФС «Прозрачность и степень опалесценции (мутности) жидкостей»).
Цветность раствора. Раствор, полученный в испытании «Прозрачность раствора», должен выдерживать сравнение с эталоном Y7 (ОФС «Степень окраски жидкостей», метод 2).
pH раствора. От 5,0 до 7,0 (раствор субстанции, содержащий 10 000 КИЕ/мл, ОФС «Ионометрия», метод 3).
Оптическая плотность. Оптическая плотность раствора субстанции, содержащего 5400 КИЕ/мл, измеренная при длине волны 277 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, должна быть не более 0,80 (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»).
1. Дез-Ала-апротинин и дез-Ала-дез-Гли-апротинин. Определение проводят методом капиллярного зонного электрофореза с процедурой нормализации (ОФС «Капиллярный электрофорез»).
Ведущий электролит. Растворяют 8,21 г калия дигидрофосфата в 400 мл воды и доводят pH раствора фосфорной кислотой до 3,0. Количественно переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят объем раствора водой до метки.
Испытуемый раствор. Готовят раствор субстанции в воде, содержащий не менее 1800 КИЕ/мл.
Раствор стандартного образца апротинина. Готовят раствор фармакопейного стандартного образца апротинина в воде с концентрацией, равной концентрации апротинина в испытуемом растворе.
Примесь A: апротинин-(1-56)-пептид.
Примесь B: апротинин-(1-57)-пептид.
Относительное время миграции соединений. Апротинин — 1 (около 22 мин); примесь A — около 0,98; примесь B — около 0,99.
Идентификация примесей. Для идентификации пиков примесей A и B используются электрофореграмма раствора стандартного образца апротинина и электрофореграмма, прилагаемая к фармакопейному стандартному образцу апротинина.
Пригодность электрофоретической системы
На электрофореграмме раствора стандартного образца апротинина:
- абсолютное время миграции апротинина должно составлять от 19 до 25 мин;
- разрешение (RS) между пиками примесей A и B должно быть не менее 0,8;
- разрешение (RS) между пиками примеси B и апротинина должно быть не менее 0,5;
- распределение пиков: электрофореграмма испытуемого раствора должна быть качественно и количественно аналогична электрофореграмме раствора стандартного образца апротинина;
- отношение сигнал/шум (S/N) для пика апротинина должно быть не менее 1000. При необходимости изменяют концентрацию испытуемого раствора для получения пиков достаточной высоты.
На электрофореграмме испытуемого раствора основная зона по положению должна совпадать с положением зоны апротинина на электрофореграмме раствора стандартного образца апротинина.
Допустимое содержание примесей:
2. Пироглутамил-апротинин и другие. Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).
Подвижная фаза А (ПФА). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 3,52 г калия дигидрофосфата и 7,26 г динатрия гидрофосфата гептагидрата, растворяют в 500 мл воды и доводят объем раствора водой до метки.
Подвижная фаза Б (ПФБ). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 3,52 г калия дигидрофосфата, 7,26 г динатрия гидрофосфата гептагидрата и 66,07 г аммония сульфата, растворяют в 500 мл воды и доводят объем раствора водой до метки.
Испытуемый раствор. Готовят раствор субстанции в ПФА, содержащий около 9000 КИЕ/мл.
Раствор для проверки пригодности хроматографической системы. Содержимое флакона фармакопейного стандартного образца апротинина для проверки пригодности хроматографической системы растворяют в 2,0 мл ПФА.
Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1,0 мл испытуемого раствора и доводят объем раствора ПФА до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,5 мл полученного раствора и доводят объем раствора ПФА до метки.
Примесь C ((5-оксопролил)апротинин): S6,S56:S15,S39:S31,S52-трицикло(5-оксопролил-L-аргинил-L-пролил-L-аспартил-L-фенилаланил-L-цистеинил-L-лейцил-L-глутамил-L-пролил-L-пролил-L-тирозил-L-треонилглицил-L-пролил-L-цистеинил-L-лизил-L-аланил-L-аргинил-L-изолейцил-L-изолейцил-L-аргинил-L-тирозил-L-фенилаланил-L-тирозил-L-аспарагинил-L-аланил-L-лизил-L-аланилглицил-L-лейцил-L-цистеинил-L-глутаминил-L-треонил-L-фенилаланил-L-валил-L-тирозилглицилглицил-L-цистеинил-L-аргинил-L-аланил-L-лизил-L-аргинил-L-аспарагинил-L-аспарагинил-L-фенилаланил-L-лизил-L-серил-L-аланил-L-глутамил-L-аспартил-L-цистеинил-L-метионил-L-аргинил-L-треонил-L-цистеинилглицилглицил-L-аланин).
| Колонка | 75 x 7,5 мм, силикагель для хроматографии, сильный катионит, 10 мкм; |
|---|---|
| Температура колонки | 40 °C; |
| Скорость потока | 1,0 мл/мин; |
| Детектор | спектрофотометрический, 210 нм; |
| Объем пробы | 40 мкл. |
| Время, мин | ПФА, % | ПФБ, % |
|---|---|---|
| 0 — 21 | 92 \rightarrow 64 | 8 \rightarrow 36 |
| 21 — 30 | 64 \rightarrow 0 | 36 \rightarrow 100 |
| 30 — 40 | 0 \rightarrow 92 | 100 \rightarrow 8 |
Хроматографируют раствор для проверки чувствительности хроматографической системы, раствор для проверки пригодности хроматографической системы и испытуемый раствор.
Относительное время удерживания соединений. Апротинин — 1 (17 — 20 мин); примесь C — около 0,9.
Пригодность хроматографической системы
На хроматограмме раствора для проверки чувствительности хроматографической системы отношение сигнал/шум (S/N) для пика апротинина должно быть не менее 10.
На хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы:
- разрешение (RS) между пиками примеси C и апротинина должно быть не менее 1,5;
- фактор асимметрии пика (AS) апротинина должен быть не более 1,3.
Допустимое содержание примесей. Содержание каждой из примесей в субстанции в процентах вычисляют согласно методу нормирования (ОФС «Хроматография»):
Не учитывают пики, площадь которых менее площади основного пика на хроматограмме раствора для проверки чувствительности хроматографической системы (менее 0,1%).
3. Олигомеры апротинина. Определение проводят методом эксклюзионной хроматографии (ОФС «Эксклюзионная хроматография»).
Подвижная фаза (ПФ). Ацетонитрил — уксусная кислота — вода 200:200:600.
Испытуемый раствор. Готовят раствор субстанции в воде, содержащий около 9000 КИЕ/мл.
Раствор для проверки пригодности хроматографической системы. В стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой помещают 30 мг субстанции, выдерживают в сушильном шкафу при температуре 110 +/- 5 °C в течение 4 ч, охлаждают. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 18 мг субстанции, растворяют в воде и доводят объем раствора водой до метки.
Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл испытуемого раствора и доводят объем раствора водой до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора водой до метки.
Хроматографируют раствор для проверки чувствительности хроматографической системы, раствор для проверки пригодности хроматографической системы и испытуемый раствор.
Относительное время удерживания соединений. Мономер апротинина — 1 (около 25 мин); димер апротинина — около 0,9.
Идентификация примесей. Для идентификации пика димера апротинина используют хроматограмму раствора для проверки пригодности хроматографической системы.
Пригодность хроматографической системы. На хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы:
- разрешение (RS) между пиками димера и мономера апротинина должно быть не менее 1,3;
- фактор асимметрии пика (AS) мономера апротинина должен быть не более 2,5.
Допустимое содержание примесей. Содержание каждой из примесей в субстанции в процентах вычисляют согласно методу нормирования (ОФС «Хроматография»):
Не учитывают пики, площадь которых менее площади основного пика на хроматограмме раствора для проверки чувствительности хроматографической системы (менее 0,1%).
Потеря в массе при высушивании. Не более 6,0% (ОФС «Потеря в массе при высушивании», способ 2). Для определения 0,1 г (точная навеска) субстанции сушат до постоянной массы не менее 24 ч.
Сульфатная зола. Не более 3,0% (ОФС «Сульфатная зола»). Для определения используют 0,2 г (точная навеска) субстанции.
Аномальная токсичность. Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС «Аномальная токсичность»). Тест-доза — 3600 КИЕ апротинина в 0,5 мл воды для инъекций на мышь, внутривенно. Срок наблюдения — 48 ч.
Бактериальные эндотоксины. Не более 0,877 ЕЭ на 1000 КИЕ апротинина (ОФС «Бактериальные эндотоксины»).
Гистамин. Не более 0,2 мкг гистамина-основания на 5400 КИЕ апротинина (ОФС «Испытание на гистамин»).
Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Определение проводят методом титриметрии (ОФС «Титриметрия (титриметрические методы анализа)»).
Активность апротинина определяют путем измерения ингибирующего действия на раствор трипсина с известной активностью. Ингибирующую активность апротинина рассчитывают как разность между начальным и остаточным значениями активности трипсина.
1800 единиц ингибитора протеаз (ЕИП) ингибирует 50% ферментной активности 2 микрокаталей трипсина.
Все растворы используют свежеприготовленными.
Испытуемый раствор. Готовят раствор субстанции в 0,0015 М боратном буферном растворе (pH 8,0), содержащий около 3000 КИЕ/мл.
Раствор стандартного образца трипсина. Готовят раствор фармакопейного стандартного образца трипсина с концентрацией 0,8 микрокаталей/мл в 0,001 М растворе хлористоводородной кислоты. Раствор готовят непосредственно перед использованием и хранят на ледяной бане.
Раствор стандартного образца трипсина разбавленный. Разбавляют 0,5 мл раствора стандартного образца трипсина до 10,0 мл 0,0015 М боратным буферным раствором pH 8,0. Полученный раствор выдерживают при температуре 20 — 25 °C в течение 10 мин, затем помещают на ледяную баню.
Раствор бензоиларгинина этилового эфира гидрохлорида 0,69%. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 0,345 г (точная навеска) бензоиларгинина этилового эфира гидрохлорида, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.
Раствор трипсина и апротинина. К 4,0 мл раствора стандартного образца трипсина прибавляют 1,0 мл испытуемого раствора, немедленно разбавляют до 40,0 мл 0,0015 М боратным буферным раствором pH 8,0. Полученный раствор выдерживают при температуре (20 +/- 5) °C в течение 10 мин, затем помещают на ледяную баню. Раствор используют в течение 6 ч после приготовления.
В ходе проведения испытания в реакторе обеспечивают постоянную атмосферу азота, непрерывное перемешивание и постоянную температуру (25 +/- 0,1) °C.
В реактор помещают 9,0 мл 0,0015 М боратного буферного раствора pH 8,0 с температурой 25 +/- 0,1 °C, прибавляют 1,0 мл раствора бензоиларгинина этилового эфира гидрохлорида 0,69%, доводят pH раствора 0,1 М раствором натрия гидроксида до 8,0. После того как температура достигнет равновесия при 25 +/- 0,1 °C, прибавляют 1,0 мл раствора трипсина и апротинина. Прибавляют 0,1 М раствор натрия гидроксида, поддерживая pH 8,0 и регистрируя расход титранта каждые 30 с. Испытания проводят в течение 6 мин. Определяют ежесекундный расход 0,1 М раствора натрия гидроксида в мл (n1, мл).
В тех же условиях титруют 1,0 мл раствора стандартного образца трипсина разбавленного, определяя ежесекундный расход 0,1 М раствора натрия гидроксида в мл (n2, мл).
Активность субстанции в калликреиновых единицах (КИЕ) на мг (X) вычисляют по формуле:
где n1 — ежесекундный расход 0,1 М раствора натрия гидроксида, израсходованного на титрование раствора трипсина и апротинина, мл;
n2 — ежесекундный расход 0,1 М раствор натрия гидроксида, израсходованного на титрование раствора стандартного образца трипсина разбавленного, мл.
ХРАНЕНИЕ
В герметично укупоренной упаковке, в защищенном от света месте.