ОФС.1.2.4.0007.15. Общая фармакопейная статья. Испытание на гистамин

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749)

(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I»)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["Государственная фармакопея СССР. XI издание. Выпуск..."]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gf-xi-minzdrav-sssr-ministerstvo" "Государственная фармакопея СССР. XI издание. Выпуск 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье"
  n1["Государственная фармакопея Российской Федерации. XII..."]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/gf-xii" "Государственная фармакопея Российской Федерации. XII издание. Часть 1"
  n2["ОФС.1.2.4.0007.15"]:::rst
  n3["ОФС.1.2.4.0007.15 (от 31.10.2018 N 749)"]:::rst
  click n3 "https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-2-4-0007-15" "ОФС.1.2.4.0007.15. Общая фармакопейная статья. Испытание на гистамин (утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)"
  n4["ОФС.1.1.1.0019"]:::doc
  click n4 "https://bukva.ai/docs/ofs-1-1-1-0019" "ОФС.1.1.1.0019. Общая фармакопейная статья. Испытание на гистамин (утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 11.04.2025 N 188)"
  n3 --> n4
  n2 --> n3
  n1 --> n2
  n0 --> n2
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Настоящая статья распространяется на определение содержания гистамина in vitro в лекарственных средствах для парентерального применения.

Подготовка изолированного органа

В опыт берут морскую свинку-самца массой тела 200 — 350 г. За 24 ч до эксперимента животное лишают пищи, но оставляют свободный доступ к воде. После эвтаназии у свинки вскрывают брюшную полость от лонного сочленения до грудины и находят слепую кишку. Место ее перехода в ободочную кишку является ориентиром при поиске подвздошной кишки, которая отходит от слепой за 1 — 2 см до этого участка.

Для того чтобы извлечь подвздошную кишку, тупым зажимом или пинцетом плотно захватывают ее основание и отрезают ножницами. Отсеченный конец кишки слегка приподнимают, а затем без натяжения и, не перехватывая ее, отсекают ткань брыжейки маленькими разрезами при помощи тупоконечных ножниц. Остатки брыжейки удалять не следует. Все манипуляции с подвздошной кишкой следует проводить осторожно, не растягивая ее. Для эксперимента пригоден дистальный участок подвздошной кишки, исключая 10 — 15 см, ближайшие к слепой кишке.

Подвздошную кишку нарезают на равные части (около 6 см каждая) и помещают в чашку Петри с гипокальциевым раствором Тироде (примечание 1). Этим раствором осторожно промывают полученные отрезки с помощью шприца или резиновой груши с пастеровской пипеткой с затупленным концом до полного удаления содержимого кишечника. Промытые отрезки подвздошной кишки помещают в чистый гипокальциевый раствор Тироде. Они могут быть использованы сразу или храниться в течение 24 ч при температуре от 2 °C до 4 °C (примечание 2).

Непосредственно перед экспериментом промытый отрезок кишки разрезают до длины, требуемой условиями эксперимента (10 мм при использовании электронного датчика или 20 мм при использовании механического рычага и кимографа).

Приготовление растворов сравнения и разведений испытуемого образца

1. Растворы сравнения

В качестве растворов сравнения используют растворы гистамина дигидрохлорида ч. или ч.д.а. в трех концентрациях: раствор 1 (1,30·10-6 г/мл); раствор 2 (2,5·10-6 г/мл) и раствор 3 (5,00·10-6 г/мл), вызывающие 50, 75 и 100% сокращение кишки соответственно. В качестве растворителя используют 0,9% раствор натрия хлорида. Объем введения растворов сравнения составляет 1/100 от объема ванночки.

2. Разведение испытуемого образца

Испытанию подвергают неразведенный испытуемый образец, когда максимально допустимая нормативной документацией концентрация гистамина в неразведенном препарате находится в диапазоне от 1,30·10-6 г/мл до 2,50·10-6 г/мл в пересчете на гистамина дигидрохлорид. Объем введения испытуемого образца должен составлять 1/100 от объема ванночки.

Если значение максимально допустимой концентрации гистамина в пересчете на гистамина дигидрохлорид в неразведенном испытуемом образце, меньше указанного диапазона или близко к его нижнему пределу, допустимо увеличение объема введения неразведенного испытуемого образца до 1/20 от объема ванночки.

Если максимально допустимая концентрация гистамина в пересчете на гистамина дигидрохлорид в неразведенном испытуемом образце находится выше указанного диапазона, испытуемый образец разводят 0,9% раствором натрия хлорида до предполагаемой концентрации гистамина дигидрохлорида 2,50·10-6 г/мл (объем введения 1/100 от объема ванночки).

Регистрирующая система

Для регистрации сокращений изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки в изотонических условиях в ответ на введение растворов сравнения и испытуемого образца используют регистрирующую систему, состоящую из термостатируемой ванночки с гипокальциевым раствором Тироде при температуре 34 — 36 °C, а также электронного датчика с регистрирующим устройством или механического рычага с кимографом. Ванночку аэрируют карбогеном (95% O2 и 5% CO2) или воздухом. Нагрузка обычно составляет 500 — 800 мг. В случае использования механического рычага для вычисления нагрузки следует применять правило равновесия:

сила x плечо силы = нагрузка x плечо нагрузки.

Проведение опыта

Изолированный отрезок подвздошной кишки помещают в ванночку и прикрепляют к регистрирующей системе с помощью лигатуры по диагонали за противоположные концы: один — к крючку на дне ванночки, а другой — к датчику или рычагу. Прикладывают к отрезку нагрузку и оставляют его в покое на 30 мин. За это время необходимо не менее 3 раз сменить в ванночке гипокальциевый раствор Тироде.

1. Адаптация изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки к субмаксимальной дозе гистамина

В термостатируемую ванночку вводят раствор 3 в объеме, равном 1/100 от ее емкости. Через 30 с (время экспозиции) ванночку промывают тройным объемом гипокальциевого раствора Тироде. После первого отмывания проводят второе таким же объемом раствора. Не менее чем через 4 мин после первого введения снова повторяют цикл «введение-экспозиция-два отмывания». Эти циклы повторяют до тех пор, пока не получат не менее двух одинаковых пиков. Их высоту принимают за 100% (примечание 3). Временные интервалы между введениями испытуемого вещества и между двумя отмываниями должны быть постоянными.

2. Испытание испытуемого образца на гистамин

2.0 Предварительное испытание

После достижения постоянной величины ответа отрезка кишки на введение раствора 3 проводят испытание испытуемого образца на гистамин. Для этого с интервалом не менее 4 мин однократно в случайном порядке вводят растворы 1 и 3, и неразведенный испытуемый образец. Циклы «введение-экспозиция-два отмывания» такие же, как и при проведении адаптации органа к субмаксимальной дозе.

В случае, если пик, полученный в ответ на введение испытуемого образца, по высоте не меньше, чем пик раствора 1, проводят количественное определение содержания гистамина в испытуемом образце (см. п. 2.1). Если пик, полученный в ответ на введение испытуемого образца, меньше пика раствора 1 или вообще отсутствует, проводят контрольное испытание (см. п. 2.2).

2.1 Количественное испытание испытуемого образца на гистамин

В случайном порядке поочередно вводят растворы 1 и 3 (1/100 от объема ванночки), и разведенный или неразведенный испытуемый образец (тот же объем введения, что и при предварительном испытании) до получения не менее трех пиков в ответ на введение каждого раствора. Находят среднее значение ответа отрезка кишки на каждый раствор. С помощью регрессионного анализа вычисляют параметры линейной зависимости среднего ответа кишки на введение растворов сравнения от логарифма их концентрации. Затем, подставляя полученные значения этих параметров в уравнение регрессии, вычисляют концентрацию гистамина в том разведении испытуемого образца, которому соответствует средняя высота его пика, и исходя из этого, рассчитывают содержание гистамина в неразведенном испытуемом образце.

Испытуемый образец считают прошедшим испытание, если найденное содержание гистамина не превышает максимально допустимое, указанное в нормативной документации (коэффициент пересчета гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание равен 0,6038).

2.2 Контрольное испытание

Схема проведения контрольного испытания такая же, как и при количественном определении содержания гистамина в испытуемом образце, только вместо испытуемого образца используют раствор 2 (1/100 от объема ванночки). Если средняя высота его пика соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном растворе (2,50·10-6 г/мл), то результаты опыта следует признать достоверными.

Результаты опыта следует признать недостоверными в каждом из следующих случаев:

1. Если средняя высота пика раствора 2 не соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном растворе (2,50·10-6 г/мл).

2. Если при количественном определении содержания гистамина в испытуемом образце отсутствует воспроизводимость ответов отрезка кишки на введение испытуемого образца.

3. Если в процессе эксперимента наблюдается значительное снижение высоты пиков.

В каждом из этих 3 случаев следует провести испытание испытуемого образца на вещества депрессорного действия в соответствии с ОФС «Испытание на депрессорные вещества».

Примечания

Приготовление

В мерном цилиндре вместимостью 1 л растворяют в воде очищенной навески натрия хлорида, натрия гидрокарбоната и D-глюкозы в любом порядке. Доводят объем раствора тем же растворителем до метки, перемешивают и переливают содержимое цилиндра в 10-литровую стеклянную емкость с притертой пробкой или полиэтиленовый сосуд того же объема с завинчивающейся крышкой.

Таким же образом, но по отдельности, каждую из оставшихся навесок растворяют в 1 л воды очищенной и по очереди переносят в тот же 10-литровый сосуд, строго придерживаясь следующего порядка:

1. калия хлорид,

2. кальция хлорид,

3. магния хлорид,

4. натрия дигидрофосфат.

Затем доливают воду очищенную до отметки 10 л и вновь тщательно перемешивают.

Полученный раствор может храниться при температуре от 3 °C до 5 °C не более 24 ч. Помутнение недопустимо.

Помутневший раствор следует вылить, тщательно промыть сосуд в проточной воде и прополоскать водой очищенной. Поверхностно активные моющие средства применять нельзя.

В качестве дополнительной меры по предупреждению спонтанной активности изолированного органа, в состав раствора можно добавить атропина сульфат в концентрации 0,5 мг/л или использовать растворы, указанные в Европейской фармакопее (2.6.10. HISTAMINE).

2. Сосуд, в котором находятся отрезки подвздошной кишки при хранении, плотно не закрывают, а затягивают двойным слоем марли, чтобы обеспечить доступ воздуха. Перед использованием в опыте отрезки следует подготовить. Для этого сосуд в течение 10 мин держат при комнатной температуре, а затем в течение 20 мин при температуре 34 — 36 °C в термостате. После нагревания из отрезка следует удалить слизь. Это достигается легкими поглаживающими движениями в продольном направлении.

3. Струя вводимого раствора должна быть направлена не прямо на изолированный отрезок кишки, а в сторону стенки ванночки, причем направление струи не должно меняться. Скорость введения должна быть максимально высокой и постоянной.

Регистрацию сокращений проводят непрерывно (скорость ленты 2 мм/мин). В случае использования механического рычага и кимографа писчик во время отмывания можно отводить и прекращать запись.