ФС.2.3.0004. Фармакопейная статья. Лизоцима гидрохлорид. Лизоцим
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 № 377)
(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание»)
Примечание
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте https://minzdrav.gov.ru/ по состоянию на 21.08.2023. В соответствии с Приказом Минздрава России от 20.07.2023 № 377 данный документ введен в действие с 01.09.2023.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
| Лизоцима гидрохлорид Лизоцим Lysozymi hydrochloridum | ФС.2.3.0004 |
| Вводится впервые |
Lys-Val-Phe-Gly-Arg-Cys-Glu-Leu-Ala-Ala-Ala-Met-Lys-Arg-His-Gly-Leu-Asp-Asn-Ile
<pre class="legal-pre"> │ 10 20
┌───────────────────────┘ ┌───────────────────────────────────────────┐
│ │ │
│ Arg-Gly-Tyr-Ser-Leu-Gly-Asn-Trp-Val-Cys-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Ser-Asn-Phe-Asn-Thr │
│ 30 40 │
│ │
│ │
│ Gln-Ala-Thr-Asn-Arg-Asn-Thr-Asp-Gly-Ser-Thr-Asp-Tyr-Gly-Ile-Leu-Gln-Ile-Asn-Ser │
│ 50 60 │
│ ┌───────────────────────────────────────────────────────────────┐ │
│ │ │ │
│ Arg-Trp-Trp-Cys-Asn-Asp-Gly-Arg-Thr-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Leu-Cys-Asn-Ile-Pro-Cys │
│ 70 │ 80 │
│ ┌───────┘ │
│ │ │
│ Ser-Ala-Leu-Leu-Ser-Ser-Asp-Ile-Thr-Ala-Ser-Val-Asn-Cys-Ala-Lys-Lys-Ile-Val-Ser │
│ 90 100 │
│ ┌───────────────────────┘
│ │
│ Asp-Gly-Asn-Gly-Met-Asn-Ala-Trp-Val-Ala-Trp-Arg-Asn-Arg-Cys-Lys-Gly-Thr-Asp-Val
│ 110 120</pre>
└───────────────────────────┐
│
Gln-Ala-Trp-Ile-Arg-Gly-Cys-Arg-Leu nHCl
| C616H963N193O182S10·nHCl [12650-88-3] |
М.м. 14305,0 (основание) |
|---|
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Пептидогликан N-ацетилмурамоилгидролаза из яичного белка, гидрохлорид.
Лизоцима гидрохлорид является основным пептидом, получаемым из белка куриного яйца, и обладает способностью гидролизовать мукополисахариды. Для получения исходного сырья используют животных, у которых отсутствуют опасные для человека заболевания вирусной, бактериальной и микоплазменной этиологии.
Содержит не менее 0,9 мг/мг (по активности) лизоцима C616H963N193O182S10 в пересчете на сухое вещество.
СВОЙСТВА
Описание. Белый или почти белый порошок.
<*> Приводится для информации.
Растворимость. Легко растворим в воде, практически нерастворим в спирте 95%.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
1. Спектрофотометрия (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»).
Раствор уксусной кислоты. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 5,78 мл уксусной кислоты ледяной и доводят объем раствора водой до метки.
Раствор натрия ацетата. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 8,2 г натрия ацетата безводного, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.
Буферный раствор. В мерной колбе вместимостью 1000 мл смешивают 176 мл раствора уксусной кислоты и 824 мл раствора натрия ацетата, доводят значение pH раствором уксусной кислоты или раствором натрия ацетата до 5,40.
Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 10 мг субстанции, растворяют в буферном растворе и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 20 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора буферным раствором до метки.
Раствор стандартного образца лизоцима. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 10 мг фармакопейного стандартного образца лизоцима, растворяют в буферном растворе и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 20 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объем буферным раствором до метки.
Спектр поглощения испытуемого раствора в области длин волн от 220 до 400 нм должен соответствовать спектру раствора стандартного образца лизоцима.
Раствор нингидрина. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,2 г нингидрина, растворяют в воде и доводят объем раствора водой до метки.
Растворяют 10 мг субстанции в 5 мл буферного раствора, прибавляют 1,0 мл раствора нингидрина и нагревают на водяной бане в течение 10 мин; должно появиться сине-фиолетовое окрашивание.
ИСПЫТАНИЯ
Прозрачность раствора. Раствор 0,15 г субстанции в 10 мл воды должен быть прозрачным (ОФС «Прозрачность и степень опалесценции (мутности) жидкостей»). При необходимости доводят значение pH хлористоводородной кислотой разведенной 8,3% до 3,00.
Цветность раствора. Раствор, полученный в испытании «Прозрачность раствора», должен быть бесцветным (ОФС «Степень окраски жидкостей», метод 2).
pH раствора. От 3,0 до 5,0 (1,5% раствор, ОФС «Ионометрия», метод 3).
Азот. От 16,8 до 18,6%, в пересчете на сухое вещество (ОФС «Определение азота в органических соединениях методом Кьельдаля», метод 2). Для определения используют 15 мг (точная навеска) субстанции.
Потеря в массе при высушивании. Не более 8,0% (ОФС «Потеря в массе при высушивании», способ 1). Высушивают до постоянной массы 0,1 г (точная навеска) субстанции при температуре 105 °C в течение 2 часов.
Сульфатная зола. Не более 2,0% (ОФС «Сульфатная зола»). Для определения используют 0,5 г (точная навеска) субстанции.
Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС «Остаточные органические растворители».
Аномальная токсичность. Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС «Аномальная токсичность»). Тест-доза — 5 мг лизоцима гидрохлорида в 0,5 мл воды для инъекций на мышь, внутривенно. Срок наблюдения — 48 ч.
Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Определение проводят методом спектрофотометрии (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»).
Раствор калия дигидрофосфата. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 9,08 г калия дигидрофосфата, растворяют в воде и доводят объем раствора водой до метки.
Раствор динатрия гидрофосфата. В мерную колбу вместимостью 250 мл помещают 2,365 г динатрия гидрофосфата безводного, растворяют в воде и доводят объем раствора водой до метки.
Буферный раствор. В мерной колбе вместимостью 1000 мл смешивают 800 мл раствора калия дигидрофосфата и 200 мл раствора динатрия гидрофосфата, при необходимости доводят значение pH раствором калия дигидрофосфата или раствором динатрия гидрофосфата до 6,2.
Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 25 мг (точная навеска) в пересчете на сухое вещество субстанции, растворяют в буферном растворе и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора буферным раствором до метки. Раствор используют свежеприготовленным и хранят при температуре от 2 до 8 °C.
Раствор стандартного образца лизоцима. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 25 мг (точная навеска) в пересчете на сухое вещество фармакопейного стандартного образца лизоцима, растворяют в буферном растворе и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Раствор используют свежеприготовленным и хранят при температуре от 2 до 8 °C.
Раствор сравнения А. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1,0 мл раствора стандартного образца лизоцима и доводят объем раствора буферным раствором до метки. Раствор используют свежеприготовленным и хранят при температуре от 2 до 8 °C.
Раствор сравнения Б. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,0 мл раствора стандартного образца лизоцима и доводят объем раствора буферным раствором до метки. Раствор используют свежеприготовленным и хранят при температуре от 2 до 8 °C.
Раствор субстрата. Готовят раствор лиофилизата клеток Micrococcus lysodeikticus в буферном растворе с концентрацией около 0,3 мг/мл.
В три флакона с завинчивающимися крышками добавляют по 4,0 мл раствора субстрата, предварительно нагретого при 36 +/- 1 °C в течение 10 мин, с интервалом в одну минуту прибавляют 0,1 мл испытуемого раствора в первый флакон, 0,1 мл раствора сравнения А во второй флакон и 0,1 мл раствора сравнения Б в третий флакон. Смеси выдерживают в течение ровно 12 мин на водяной бане при 36 +/- 1 °C, прибавляют в первый флакон 0,5 мл хлористоводородной кислоты раствора 1 М и перемешивают. С интервалом в одну минуту прибавляют по 0,5 мл хлористоводородной кислоты раствора 1 М во второй и в третий флакон.
Измеряют оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 640 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, используя в качестве раствора сравнения воду.
Содержание (по активности) лизоцима C616H963N193O182S10 в субстанции в пересчете на сухое вещество в мг/мг (X), вычисляют по формуле:
X = \frac{a_{0} \cdot P}{a_{1} \cdot 2} \cdot (\frac{A_{0A} - A_{1}}{A_{0A} - A_{0\text{Б}}} + 1)
где A1 — оптическая плотность испытуемого раствора;
A0А — оптическая плотность раствора сравнения А;
A0Б — оптическая плотность раствора сравнения Б;
a1 — навеска субстанции в пересчете на сухое вещество, мг;
a0 — навеска фармакопейного стандартного образца лизоцима в пересчете на сухое вещество, мг;
P — активность фармакопейного стандартного образца лизоцима, мг/мг.
ХРАНЕНИЕ
В герметично укупоренной упаковке.