МУК 4.2.4044-24. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации препарата Планталюкс № в воздухе рабочей зоны и в атмосферном воздухе городских и сельских поселений. Методические указания по методам контроля
(утв. Роспотребнадзором 31.05.2024)
Примечание
Документ введен в действие с 31.08.2024.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 31 мая 2024 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ПРЕПАРАТА ПЛАНТАЛЮКС № В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ И В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ ГОРОДСКИХ И СЕЛЬСКИХ ПОСЕЛЕНИЙ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ МУК 4.2.4044-24
Дата введения 31 августа 2024 года
1. Разработаны Федеральным государственным автономным образовательным учреждением высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 31 мая 2024 г.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания по методам контроля (далее — МУК) описывают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации штаммов препарата Планталюкс N (далее — микробиологический препарат) в воздухе рабочей зоны и в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА
2.1. Микробиологический препарат является микробиологическим удобрением (агрохимикатом), которое планируется применять в сельскохозяйственном производстве и в личных подсобных хозяйствах в открытом и защищенном грунте.
2.2. Микробиологический препарат представляет собой непрозрачную суспензионную жидкость от светло-коричневого до темно-коричневого цвета со специфическим запахом гниющей листвы.
В состав микробиологического препарата входят:
активное начало — штамм Azotobacter chroococcum A-8267;
остатки питательной среды (2 — 5%);
2.3. Штамм Azotobacter chroococcum A-8267 не является генномодифицированным, выделен из почвы, идентифицирован и депонирован под регистрационным номером B-112 VIZR <1>, не является фито- и зоопатогенным, а также не входит в состав 4-х групп патогенности <2>. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.
<1> Штамм депонирован в Государственной коллекции энтомопатогенных и фитопатогенных микроорганизмов и их антагонистов Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений — ВИЗР.
<2> Приложение 1 СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный № 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 № 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный № 67587); от 25.05.2022 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный № 68934).
2.4. Оптимальной твердой средой для выращивания и размножения штамма является среда Эшби с мелассой. Состав среды (г/дм3): меласса — 30,0; кальций углекислый — 5,0; калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный — 0,3; магний сернокислый 7-водный — 0,2; натрий хлористый — 0,2; железо сернокислое 7-водное — 0,01; марганец сернокислый 5-водный — 0,005; аммоний молибденовокислый 4-водный — 0,005; агар — 20,0; вода водопроводная до 1,0 дм3. Оптимальная температура роста плюс (30 +/- 2) °C, культивирование 24 — 48 ч.
III. ПРЕДЕЛЫ ИЗМЕРЕНИЙ
3.1. Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе в диапазоне концентраций от 50 до 50000 КОЕ в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
IV. МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЙ
4.1. Метод основан на аспирации из воздуха колониеобразующих клеток микроорганизма и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на агаризованной среде (среда Эшби с мелассой). При наличии в воздухе высоких концентраций штамма препарата возможно использование седиментационного метода Коха.
V. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы, приведенные в таблицах 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов |
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | - |
| Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228-2008 |
| Колбы мерные лабораторные конические КН-2-50-34, КН-2-250-50, КН-2-500-50, КН-2-1000-50 | ГОСТ 1770-74 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227-91 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770-74 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения от 0 до плюс 55 °C | - |
| Аспирационный бактериологический пробоотборник (со скоростью до 40 л/мин, расход регулируется по ротаметру, диаметр чашек Петри 90, 100, 120 мм, определение в диапазоне 25 — 10000 КОЕ/м3) | - |
| Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование вспомогательных устройств и материалов | Обозначение и наименование документов |
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру плюс (160 +/- 5) °C | - |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру плюс (28 +/- 2) °C и плюс (37 +/- 2) °C | - |
| Автоклав электрический | - |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060-2011 ГОСТ 31598-2012 |
| Дистиллятор | - |
| Облучатель бактерицидный настенный | - |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678-85 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | - |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706-83 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336-82 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932-90 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932-90 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336-82 |
| Груша резиновая | - |
| Петля бактериологическая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412-2021 |
| Вата медицинская гигроскопическая | ГОСТ 5556-2022 |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026-76 |
| Примечание: допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
| Наименование реактивов и питательных сред | Обозначение и наименования документов |
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206-96 |
| Аммоний молибденовокислый 4-водный (NH4)2MoO4·4H2O | ГОСТ 3765-78 |
| Вода дистиллированная H2O ГОСТ 6709-90 | |
| Железо сернокислое 7-водное FeSO4·7H2O | ГОСТ 4148-78 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный K2HPO4·3H2O | ГОСТ 2493-75 |
| Кальций углекислый CaCO3 | ГОСТ 8253-79 |
| Магний сернокислый 7-водный MgSO4·7H2O | ГОСТ 4523-77 |
| Марганец сернокислый 5-водный MnSO4·5H2O | ГОСТ 8736-77 |
| Меласса | ГОСТ 30561-2017 |
| Натрий хлористый NaCl | ГОСТ 4233-77 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299-78 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652-2000 |
| Примечание: допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
| VI. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ | |
6.1. Выполнение измерений концентрации клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны и в атмосферном воздухе осуществляют в соответствии с методическими документами <3>, а также документами по стандартизации <4>.
<3> МУК 4.2.1054-01 «Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест», утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 06.06.2001 (далее — МУК 4.2.1054-01).
<4> ГОСТ 12.1.005-88 «Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны», утвержденный и введенный в действие постановлением Госстандарта СССР от 29.09.1988 № 3388.
6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками <5> и инструкции по эксплуатации прибора.
<5> ГОСТ 12.1.019-2017 «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты», введенный приказом Росстандарта от 07.11.2018 № 941-ст.
6.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VII. УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
7.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
температура воздуха — плюс (20 +/- 5) °C;
атмосферное давление — 760 +/- 20 мм рт. ст.;
влажность воздуха — не более 80%.
VIII. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СРЕДЫ ЭШБИ С МЕЛАССОЙ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА
8.1. При проведении исследований готовят маточные растворы микроэлементов. Для этого взвешивают навески: 1,0 г FeSO4·7H2O, 0,05 г (NH4)2MoO4·4H2O и 0,05 г MnSO4·5H2O и каждое соединение растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят количественно в мерную колбу объемом 100 см3, доводят объем до метки и тщательно перемешивают. Растворы хранят в холодильнике при температуре (5 +/- 3) °C в течение месяца. В случае помутнения и выпадения осадка раствор использовать не рекомендуется.
8.2. Навески остальных компонентов среды (кроме микроэлементов) растворяют последовательно в небольшом количестве теплой водопроводной воды. В раствор вносят по 10 см3 маточных растворов FeSO4·7H2O, (NH4)2MoO4·4H2O и MnSO4·5H2O. Объем среды доводят до 1,0 дм3 водопроводной водой. Затем нагревают, вносят навеску агара. Выдерживают при перемешивании до полного расплавления агара. Устанавливают значение pH (7,1 — 7,5) ед. 25% раствором едкого натра.
8.3. Горячую среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разливают в колбы 250 — 300 см3, стерилизуют при давлении 1,0 атм, при температуре плюс (120 +/- 1) °C в течение 20 мин, затем остужают и разливают по стерильным чашкам Петри.
8.4. Среду Эшби с мелассой хранят в холодильнике при температуре плюс (5 +/- 3) °C не более 1 месяца.
IX. ПРОВЕДЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЯ
9.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с методическими документами <6>, а также документами по стандартизации <7>.
<6> МУК 4.2.1054-01.
<7> ГОСТ Р 8.563-2009 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений», введенный приказом Ростехрегулирования от 15.12.2009 № 1253-ст.
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма (таблица 9.1).
Время и скорость отбора проб воздуха
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2 Выполнение анализа
9.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (среда Эшби с мелассой) расплавляют, остужают до плюс (50 — 60) °C и разливают в чашки Петри.
9.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методами контроля <8>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс 37 °C не менее чем на 18 ч. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре плюс (2 — 8) °C не более 10 дней.
<8> Подпункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред», утвержденный руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008 (далее — МУК 4.2.2316-08).
9.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри культивируют при температуре плюс (28 +/- 2) °C. Через 2 — 4 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
9.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с ростовыми свойствами питательных сред <9>. Для этого музейный штамм высевают на 2 — 3 чашки используемой среды.
<9> Пункт 7 МУК 4.2.2316-08.
9.2.5. Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
X. ВЫЧИСЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ
10.1 Расчет концентрации клеток производят по формуле (1):
\text{К } = \frac{\text{П } \times 1000}{\text{С } \times \text{Т}} , (1)
где К — концентрация штамма в воздухе, КОЕ/м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета дм3 на м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, дм3/мин;
XI. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, рекомендуемый образец которого приведен в приложении к настоящим МУК.
Приложение к МУК 4.2.4044-24 (рекомендуемый образец)
Пример оформления протокола N ____ количественного микробиологического анализа препарата Планталюкс № в воздухе рабочей зоны и/или атмосферном воздухе городских и сельских поселений
1. Дата проведения анализа __________________
2. Рабочее место (профессия работающего) ____________________
3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) __________________________
4. Вид пробоотборника _____________________
5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ______________________
6. Питательная среда, время инкубации _____________________
7. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ___________________________
8. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) _____________________
9. Результаты идентификации микроорганизмов препарата Планталюкс N (микро-морфологические признаки) _______________________
10. Результаты расчета концентрации штамма __________________
11. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКр.з или ПДКа.в _____________
12. Отбор пробы произведен (ФИО, должность, дата, подпись) ___________
13. Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (ФИО, должность, дата, подпись)
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
3. МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».
4. МУК 4.2.1054-01 «Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест».
5. ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
6. ГОСТ 12026-76 «Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия».
7. ГОСТ 17299-78 «Спирт этиловый технический. Технические условия».
8. ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
9. ГОСТ 25706-83 «Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования».
10. ГОСТ 26678-85 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия».
11. ГОСТ 12.1.005-88 «Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны».
12. ГОСТ 22340-89 «Аквадистилляторы медицинские электрические. Общие технические требования и методы испытаний».
13. ГОСТ 23932-90 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия».
14. ГОСТ 29227-91 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
15. ГОСТ 17206-96 «Агар микробиологический. Технические условия».
16. ГОСТ Р 51945-2002 «Аспираторы. Общие технические условия».
17. ГОСТ Р 53228-2008 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
18. ГОСТ Р 8.563-2009 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений».
19. ГОСТ Р ЕН 13060-2011 «Стерилизаторы паровые малые».
20. ГОСТ 31598-2012 «Стерилизаторы паровые большие. Общие технические требования и методы испытаний».
21. ГОСТ 5962-2013 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия».
22. ГОСТ 12.1.009-2017 «Электробезопасность. Термины и определения».
23. ГОСТ 12.1.019-2017 «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
24. ГОСТ Р 58144-2018 «Вода дистиллированная. Технические условия».
25. ГОСТ 9412-2021 «Марля медицинская. Общие технические условия».
26. ГОСТ 5556-2022 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».