МУК 4.2.3910-23. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации штамма Beauveria bassiana ВКПМ F-1357, активной субстанции биопрепарата Боверикс,Ж в воздухе рабочей зоны. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 29.06.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 29.09.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 июня 2023 года
Дата введения 29 сентября 2023 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ШТАММА BEAUVERIA BASSIANA ВКПМ F-1357, АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ БИОПРЕПАРАТА БОВЕРИКС,Ж В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3910-23
1. Разработаны ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой «29» июня 2023 г.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации штамма Beauveria bassiana ВКПМ F-1357 активной субстанции биопрепарата Боверикс,Ж в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА BEAUVERIA BASSIANA ВКПМ F-1357
2.1. Штамм Beauveria bassiana <1> является активной субстанцией биопрепарата Боверикс,Ж <2>. Содержание жизнеспособных клеток бактерий не менее 108 КОЕ/мл.
<1> Штамм депонирован во ФГУП ГосНИИГенетика под номером ВКПМ F-1357.
<2> Согласно ТУ 20.20.11-006-0139241345.
2.2. Биопрепарат является микробиологическим инсектицидом. Штамм Beauveria bassiana ВКПМ F-1357 обладает селективным контактным механизмом действия на личинки насекомых отряда чешуекрылых, равнокрылых и трипсы, эффективен против личинок младших возрастов капустной моли, капустной совки, яблонной и плодовой моли, табачного и цветочного трипса, тепличной белокрылки, яблонной тли. Штамм продуцирует нейротоксин — боверицин, вызывающий паралич мускулатуры насекомого.
2.3. Источником выделения штамма Beauveria bassiana ВКПМ F-1357 является хлопковый клоп Dysdercus sp. Штамм не является генномодифицированным. Колонии штамма шерстистые, белые, затем часто светло-желтоватые. Обратная сторона неокрашенная, желтоватая или возможно темно-красноватая, в последнем случае с диффундирующим в среду растворимым пигментом. Спороношение в массе белое. Вегетативные гифы септированные, гиалиновые, до 2 мкм шириной, гладкие. Конидиогенные клетки обычно в группах по 5 и более, образуются на гифах воздушного мицелия на приповерхностных клетках гиф субстратного мицелия. Конидии (симподулоконидии) 2 — 3 мкм в диаметре, шаровидные до широкоэллиптических, иногда с заострением на верхушке. Рост при плюс 22 — 28 °C в течение 7 суток.
2.4. Для культивирования Beauveria bassiana ВКПМ F-1357 используется агаризованная полусинтетическая питательная среда следующего состава: калий фосфорнокислый двузамещенный 10 г/л, аммоний фосфорнокислый однозамещенный 10 г/л, магний сернокислый 0,7 г/л, железо сернокислое семиводное 12,5 мг/л, медь сернокислая пятиводная 3 мг/л, марганец сернокислый пятиводный 12,5 мг/л, цинк сернокислый семиводный 3 мг/л, глюкоза 10 г/л, pH 4,5 — 5,5. Плотную среду готовят, добавляя к указанному составу агар до 30 г/л.
2.5. Штамм относится к микроорганизмам, не патогенным для человека <3>. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.
<3> Согласно классификации микроорганизмов, приведенных в СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021 № 62500) (далее — СанПиН 3.3686-21).
III. ПРЕДЕЛЫ ИЗМЕРЕНИЙ
3.1. Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
IV. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЙ
4.1. Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток микроорганизма и подсчета общего количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на агаризованной полусинтетической питательной среде. При наличии в воздухе высоких концентраций штамма возможно использование седиментационного метода Коха.
V. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы, приведенные в таблицах 1 - 3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799 |
| Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения плюс 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003 |
| Аспирационный бактериологический пробоотборник (со скоростью до 40 л/мин, расход регулируется по ротаметру, диаметр чашек Петри 90, 100, 120 мм, определение в диапазоне 25 — 10000 кл./м3) | - |
Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование аппаратуры и материалов | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру плюс (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру плюс (28 +/- 2) °C и плюс (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060; ГОСТ Р 51935 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | - |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-908 |
| Петля бактериологическая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412 |
| Вата медицинская гигроскопическая | ГОСТ 25556 |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026 |
Примечание: допускается применение устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
| Наименование реактивов и питательных сред | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206 |
| Аммоний фосфорнокислый однозамещенный NH4H2PO4 | ГОСТ 3771 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
| Глюкоза | ГОСТ 6038 |
| Железо сернокислое семиводное FeSO4·7H2O | ГОСТ 4148 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный K2HPO4·3H2O | ГОСТ 2493 |
| Магний сернокислый семиводный MgSO4·7H2O | ГОСТ 4523 |
| Марганец сернокислый пятиводный MnSO4·5H2O. | ГОСТ 435 |
| Медь сернокислая пятиводная CuSO4·5H2O | ГОСТ 4165 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652 |
| Цинк сернокислый семиводный ZnSO4·7H2O | ГОСТ 4174 |
Примечание: допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.
VI. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
6.1. При выполнении измерений концентрации клеток микроорганизмов в воздухе рабочей зоны соблюдают законодательство в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения <4>.
<4> СанПиН 3.3686-21; ГОСТ 12.1.005 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны», утв. и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 29.09.1988 № 3388.
6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками <5> и инструкции по эксплуатации прибора.
<5> ГОСТ 12.1.019 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты», введен в действие Приказом Росстандарта от 07.11.2018 № 941-ст.
6.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VII. УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
7.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
- <a id="p100129"></a>температура воздуха плюс (20 +/- 5) °C;
- <a id="p100130"></a>атмосферное давление 760 +/- 20 мм рт. ст.;
- <a id="p100131"></a>влажность воздуха не более 80%.
VIII. ПРИГОТОВЛЕНИЕ АГАРИЗОВАННОЙ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ
8.1. Для приготовления агаризованной полусинтетической питательной среды на 1,0 дм3 дистиллированной воды добавляют калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 10 г, аммоний фосфорнокислый однозамещенный 10 г, магний сернокислый семиводный 0,7 г, железо сернокислое семиводное 12,5 мг, медь сернокислая пятиводная 3 мг, марганец сернокислый пятиводный 12,5 мг, цинк сернокислый семиводный 3 мг, глюкоза 10 г, агар микробиологический до 30 г. Помешивая, нагревают до полного растворения агара. В готовой среде pH 4,5 — 5,5.
8.2. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при плюс 120 °C в течение 15 — 20 мин.
8.3. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше плюс 8 °C в течение 10 дней, не более.
IX. ПРОВЕДЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЯ
9.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с МУК 4.2.1054-01 и ГОСТ 8.563-09.
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависят от предполагаемой концентрации микроорганизма (таблица 4).
Время и скорость отбора проб воздуха
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с Инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2 Выполнение анализа.
9.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду расплавляют, остужают до плюс 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.
9.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методами контроля <6>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре плюс (2 — 8) °C не более 10 дней.
<6> Пункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред», утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008 (далее — МУК 4.2.2316-08).
9.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой плюс 28 +/- 2 °C. Через 1 — 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
9.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии ростовыми свойствами питательных сред <7>. Для этого музейный штамм, входящий в состав препарата, высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
<7> МУК 4.2.2316-08.
9.2.5. Лиофилизованную культуру музейных штаммов необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
X. ВЫЧИСЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ
10.1 Расчет концентрации клеток производят по формуле:
K = \frac{\text{П } \times 1000}{\text{С } \times \text{Т}} , (1)
где: К — концентрация штамма в воздухе, кл./м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета дм3 на м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, дм3/мин;
XI. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, приведенным в приложении к настоящим МУК.
Пример оформления протокола № количественного микробиологического анализа штамма Beauveria bassiana ВКПМ F-1357 в воздухе рабочей зоны
1. <a id="p100190"></a>Дата проведения анализа ____________________________________________
2. <a id="p100191"></a>Рабочее место (профессия работающего) ______________________________
3. <a id="p100192"></a>Место отбора пробы (название и адрес организации, производство,
технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________
3. <a id="p100193"></a>Вид пробоотборника _________________________________________________
4. <a id="p100194"></a>Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора
проб ______________________________________________________________________
5. <a id="p100195"></a>Питательная среда, время инкубации _________________________________
6. <a id="p100196"></a>Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ____________
7. <a id="p100197"></a>Количественная и качественная характеристика выросших колоний
(количество типичных колоний) _____________________________________________
8. <a id="p100198"></a>Результаты идентификации микроорганизма препарата (морфологические
признаки) _________________________________________________________________
9. <a id="p100199"></a>Результаты расчета концентрации штамма _____________________________
11. <a id="p100201"></a>Отбор пробы произведен (ФИО, должность, дата, подпись) ____________
12. <a id="p100202"></a>Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (ФИО,
должность, дата, подпись) _________________________________________________