МУК 4.2.2788-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа. Дополнение 1 к МУК 4.2.1955-05 «Метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа». Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 06.12.2010)
Примечание
Документ введен в действие с 6 декабря 2010 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
6 декабря 2010 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ LISTERIA MONOCYTOGENES В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ НА ОСНОВЕ ГИБРИДИЗАЦИОННОГО ДНК-РНК АНАЛИЗА
ДОПОЛНЕНИЕ 1 К МУК 4.2.1955-05 «МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА SALMONELLA И LISTERIA MONOCYTOGENES НА ОСНОВЕ ГИБРИДИЗАЦИОННОГО ДНК-РНК АНАЛИЗА»
с момента утверждения
1. Разработаны ГУ Научно-исследовательским институтом питания РАМН; ГУ Научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН; при участии фирмы ООО «Ниармедик плюс».
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиобиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 декабря 2010 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Внести дополнения в МУК 4.2.1955-05:
1. Раздел 2. «Общие положения и область применения» дополнить пунктами 2.7 и 2.8 следующего содержания:
2.7. Настоящие методические указания устанавливают также метод ускоренного выявления бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах на основе твердофазного гетерогенного гибридизационного ДНК-РНК анализа с хемилюминесцентным детектированием. Метод может применяться в качестве дополнительного к классическим бактериологическим методам лабораторных исследований для целей выявления бактерий Listeria monocytogenes при контроле пищевых продуктов.
2.8. Метод ускоренного выявления бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах предусматривает определение наличия или отсутствия указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-2001 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе.
2. Раздел 3. «Сущность метода» дополнить пунктами 3.6, 3.7 и 3.8 следующего содержания:
3.6. Метод выявления бактерий Listeria monocytogenes предусматривает высев определенных количеств исследуемых образцов молока и молочных продуктов в специальную селективную питательную среду, инкубирование посевов для накопления микроорганизмов, обработку культуральной жидкости лизирующим буфером, денатурацию бактериальной рибосомальной РНК, гибридизацию фрагментов денатурированной рРНК с комплементарным ей меченым зондом, входящим в набор «Люмипроб-24 Listeria monocytogenes», хемилюминесцентным детектированием продуктов реакции.
3.7. При обнаружении положительных результатов присутствие бактерий Listeria monocytogenes должно подтверждаться в соответствии с методами ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes» или МУК 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах».
3.8. Мишенью в реакции ДНК-РНК гибридизации для Listeria monocytogenes является последовательность ДНК, кодирующая токсический белок листериолизин-О — основной фактор патогенности Listeria monocytogenes.
3. Раздел 10. «Нормативные ссылки» дополнить пунктом 10.19 следующего содержания:
10.19. МУК 4.2.1955-05 «Метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа».
4. Методические указания дополнить разделом 11 с названием «Проведение анализа по обнаружению бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах» следующего содержания:
11.1 Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы
и питательные среды
11.1.1 Аппаратура и инструментарий
Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH +/- 0,01 ГОСТ 19881-74
Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °С ТУ 64-1-28-70-76
Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 37 °С с отклонением от заданной +/- 1 °С ТУ 64-1-1382-83
Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 41,5 °С с отклонением от заданной +/- 1°С ТУ 64-1-1382-83
Баня водяная с подогревом (37 +/- 1) °С ГОСТ 12026-76
Баня водяная с терморегулятором, позволяющая поддерживать температуру от 0 до 100 °С ТУ 42-22-608-75
Весы лабораторные общего назначения 2 и 4 класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104-88
Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБР-1,
**МБР-3, МБС ГОСТ 8284-78** Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные ГОСТ 19569-89Е
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72
Гомогенизатор перистальтического типа «Микс-2», «Стомайкер» или других наименований AES Lab., Cat. № AESAP 1066
Штатив для 12 мм пробирок с держателем
Микропипетки на 100 — 1000 мкл BIOHIT, Cat. № 725070 или «Ленпипет»
Мультистеппер BIOHIT, Cat. № 730101
Диспенсер BIOHIT, Cat. № 723046
Распределительная емкость — объем 1,0 — 2,5 л BIOHIT
Люминометр для пробирок «Люмлайт» или «Люмлайт мини» Europrobe, Cat. № EBLL01
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов ТУ-16-535-84
Холодильник бытовой электрический ГОСТ 16317-87
Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89
Ножницы медицинские ГОСТ 21239-89
Скальпель хирургический, 15 см ГОСТ 21240-89
Часы механические сигнальные ГОСТ 3145-84
Аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (или другая аппаратура для встряхивания) ТУ 64-1-2451-78
11.1.2 Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости ГОСТ 1770-74
Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81
Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см ГОСТ 29227-91
Пробирки типов П1, П2 ГОСТ 25336-82
Стекла предметные для микропрепаратов ГОСТ 6672-75
Спиртовки лабораторные стеклянные ГОСТ 23932-90
Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С) ГОСТ 13646-68
Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов ГОСТ 23932-90
Пакеты стерильные для гомогенизатора AES Lab., Cat. № AES400/50G
Отраслевой стандарт для визуальной оценки мутности № 10 ГИСК им. Л.А. Тарасевича, МЗ РФ
Денситометр для бактериальных суспензий типа «Densi-La-Meter» или «Денсимат», ф. «Лахема», «BioMerieux»
Стандарт Макфарланда № 1, 2, 3 ф. «BioMerieux»
Петля бактериологическая, калиброванная на 1 мкл,
AES Lab., Cat. № AESDI100
11.1.3 Реактивы и питательные среды
Broth RM L «Europrobe» (Ref. ЕВ 2157, ЕВ 21502, ЕВ 21504)
Тест-система «Lumiprobe 24 Listeria monocytogenes» «Europrobe» (Ref. 11055)
Тест-штамм Listeria monocytogenes, типичный по культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам, ГИСК им. Л.А. Тарасевича
11.1.4 Набор для проведения твердофазного гибридизационного
ДНК-РНК анализа
Набор «Lumiprobe 24 Listeria monocytogenes» на 50 тестов в составе: - пробирки с фиксированным на них зондом (5 пакетов х 10 пробирок)
- <a id="p100076"></a>лизирующий буфер (1 флакон х 5 мл)
- <a id="p100077"></a>гибридизационный буфер (1 флакон х 12 мл)
- <a id="p100078"></a>20-кратный промывочный буфер (4 флакона х 30 мл)
- <a id="p100079"></a>конъюгат (1 флакон х 5 мл)
- <a id="p100080"></a>субстрат (1 флакон х 5 мл)
- <a id="p100081"></a>защитная пленка (6 шт.).
Примечание. Допускается использование других питательных сред, реактивов, диагностических препаратов, аппаратуры и инструментария с аналогичными характеристиками, прошедших регистрацию в Российской Федерации в установленном порядке, после процедуры их стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.
Питательные среды и биологические препараты отечественного и зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.
11.2 Подготовка к анализу
11.2.1 Приготовление растворов и реактивов
1. Изотонический (0,85%-ный водный) раствор хлорида натрия (ГОСТ 26669-85).
2. <a id="p100087"></a>Стерильный фосфатный буфер с pH 7,2 +/- 0,1 KH PO - 0,45 г, Na HPO
2 4 2 4
- 5,34 г в 1000 куб. см дистиллированной H O, стерилизовать при температуре 2 121 °С в течение 30 мин.
11.2.2 Приготовление питательных сред
Приготовление среды RM L Broth: навеску 52 г растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, осторожно перемешивают до растворения (при необходимости немного подогревают), устанавливают pH 7,2 +/- 0,2 при 25 °С и автоклавируют при 115 °С в течение 15 мин. Простерилизованную горячую среду (70 — 80) °С быстро охлаждают до температуры 10 — 12 °С в холодной воде. Готовую среду хранят при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней.
11.3 Подготовка к проведению твердофазного
гибридизационного ДНК-РНК анализа
11.3.1. Все реагенты наборов перед использованием необходимо прогреть при комнатной температуре в течение 30 мин., перед использованием содержимое флаконов необходимо аккуратно перемешать легким переворачиванием флакона. Пробирки с сенсибилизированными олигонуклеотидными ДНК-зондами извлекают из упаковки в количестве, соответствующем общему числу исследуемых и контрольных проб.
11.3.2. Перед началом работы необходимо проверить индикаторы уровня влажности: индикаторная полоска на пакетах с сорбентом должна иметь синий цвет, при высокой влажности она приобретает розовую окраску, что говорит о непригодности к использованию пробирок, находящихся в данном комплекте наборов.
11.3.3. Приготовление промывочного буфера: 1 флакон, содержащий 30 мл концентрированного (х20) промывочного буфера, вносят в 570 куб. см свежеприготовленной стерильной дистиллированной воды (или 1 объем концентрированного буфера на 19 объемов стерильной дистиллированной воды). Приготовление буфера рекомендуется проводить в мерном цилиндре: сначала количественно переносят содержимое флакона с концентрированным буфером, после чего постепенно по стенке цилиндра вливают дистиллированную воду, доводя общий объем до 600 куб. см, и тщательно перемешивают, избегая образования пены на поверхности смеси. Хранение готового буфера: 1 месяц при комнатной температуре.
- Содержимое гибридизационного буфера является едким веществом и не должно попадать в глаза и на кожу. В случае контакта немедленно обильно промыть и обратиться к врачу.
- При проведении анализа необходимо надеть защитную одежду и перчатки.
- Большинство реагентов содержат азид натрия в качестве консерванта.
11.4 Отбор и подготовка проб к анализу
11.4.1 Общие положения по отбору и подготовке проб
Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Методы отбора проб для микробиологических анализов», ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов», МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов», ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96), ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes», МУК 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах», ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты. Отбор и подготовка их к испытанию» и ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа».
11.4.2. Кисло-молочные продукты и сыры тщательно измельчают с помощью гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых и подвергают нейтрализации до pH 7,2 +/- 0,2 1N раствором NaOH. Топленое масло или молочный жир расплавляют при температуре 40 — 45 °С и перемешивают до получения однородной эмульсии, масло сливочное и мороженое расплавляют до сметанообразной консистенции.
11.5 Проведение анализа по обнаружению бактерий Listeria
monocytogenes в молоке и молочных продуктах
11.5.1. Подготовленную в соответствии с разделом 5 пробу исследуемого продукта (гомогената) вносят в среду накопления — обогатительный бульон RM L по п. 4.2, предварительно прогретый в течение 15 мин. при температуре 45 °С, для первичного обогащения в соотношении 1:3 (25 г продукта в 75 куб. см среды). При необходимости анализа других масс продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1:3 по объему. Пробы гомогенизируют с использованием гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых.
11.5.2. Гомогенизированную пробу в RM L бульоне термостатируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 6 ч.
11.5.3. Переносят 10 куб. см инкубированной в RM L бульоне пробы в 90 мл обогатительного бульона RM L, предварительно нагретого до температуры 41 °С. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 16 ч.
11.5.4. Маркируют пробирки, входящие в набор «Lumiprobe 24 Listeria monocytogenes» в соответствии с номерами исследуемых проб и помещают в штатив для 12 мм пробирок с держателем. Не рекомендуется одновременно анализировать более 20 проб.
11.5.5. Внесение проб (после инкубации в течение 16 ч) и всех реагентов (лизирующего и гибридизационного буферов, конъюгата, субстрата) необходимо производить быстро и не касаясь наконечником краев пробирки. Не допускается использование одного наконечника для внесения разных проб или растворов буферов.
11.5.6. Проведение лизиса бактериальных клеток: в каждую промаркированную пробирку добавляют, строго соблюдая очередность, как изложено ниже, следующие компоненты набора:
11.5.6.1 Лизирующий буфер в количестве 100 мкл.
11.5.6.2. Исследуемую пробу в обогатительном бульоне RM L в количестве 100 мкл.
В качестве отрицательного контроля (ОК) используют стерильный бульон RM L — 100 мкл. Пробу стерильного бульона RM L, используемого в качестве отрицательного контроля, термостатируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 16 ч.
В качестве положительного контроля (ПК) используют тест-культуру Listeria monocytogenes, выращенную на бульоне RM L при 37 °С, также в количестве 100 мкл.
11.5.6.3. Пробирки закрывают адгезивной уплотнительной защитной пленкой (из набора), быстро перемешивают и помещают для инкубирования в водяную баню при температуре (37 +/- 1) °С на 15 мин.
11.5.7. Проведение гибридизации: вынимают штатив из водяной бани, удаляют защитную пленку и добавляют в каждую пробирку гибридизационный буфер по 250 мкл, закрывают пробирки новой защитной пленкой и интенсивно встряхивают. Пробирки с внесенным гибридизационным буфером инкубируют в водяной бане при температуре (50 +/- 1) °С в течение 60 мин.
11.5.8 Выявление гибридов:
11.5.8.1. Удаляют защитную пленку и быстро выливают содержимое всех пробирок одновременно, не вынимая их из штатива.
11.5.8.2. Не вынимая пробирки из штатива, быстро заполняют каждую пробирку промывочным буфером по п. 4.3.3 в количестве 5 куб. см, используя диспенсер, после чего быстро опустошают пробирки. Процедуру промывки проводят еще три раза. При проведении второй промывки также быстро полностью опустошают пробирки сразу после заполнения их промывочным буфером. Третий и четвертый раз промывают пробирки следующим образом: после заполнения пробирок промывочным буфером ждут 30 с перед тем, как полностью их опустошить.
Порядок заполнения пробирок промывочным буфером:
Первую и третью промывки начинают с первой пробирки, вторую и четвертую промывки — с последней пробирки.
После четвертой промывки содержимое пробирок энергично сливают в раковину, переворачивают штатив с пробирками и помещают на фильтровальную бумагу, слегка встряхивая до тех пор, пока пробирки не осушатся (4 — 5 раз), и оставляют их в перевернутом состоянии на несколько секунд.
11.5.8.3. Во все пробирки вносят раствор конъюгата по 100 мкл. Покрывают пробирки новой уплотняющей защитной пленкой и сильно встряхивают штатив. Инкубируют в водяной бане при (37 +/- 1) °С в течение 15 мин. Штатив вынимают из водяной бани, удаляют защитную пленку и быстро выливают содержимое всех пробирок одновременно, не вынимая их из штатива.
11.5.8.4. Пробирки промывают 4 раза, выдерживая каждый раз не менее 30 с (для этого быстро опустошают пробирки и затем полностью заполняют их промывочным буфером). Следует обратить внимание на то, что, промывая пробирки в четвертый раз, буфер необходимо вносить медленно, не допуская образования пены, а после его удаления на стенках пробирок не должно оставаться пены от промывочного буфера (пробирки должны быть абсолютно прозрачными).
По окончании промывки пробирки помещают на фильтровальную бумагу и оставляют в перевернутом состоянии несколько секунд, пока они полностью не осушатся.
11.5.8.5. Во все пробирки вносят раствор субстрата по 100 мкл и осторожно встряхивают. Инкубируют в темноте при температуре не выше 20 °С в течение 15 мин. Для внесения раствора субстрата следует пользоваться отдельной пипеткой для предотвращения его контаминации.
11.5.9. Измеряют уровень хемилюминесценции в каждой пробирке на люминометре «Люмлайт» или «Люмлайт мини» с интеграционным временем 5 с в соответствии с инструкцией к прибору.
Перед измерением каждую пробирку осторожно протирают для удаления капель жидкости. Следует обратить внимание, что во время измерения хемилюминесценции в пробирочном люминометре прибор не должен находиться под прямым источником света.
- Стадия гибридизации должна начинаться не позднее 45 мин. после стадии лизиса.
- Качество гибридизации и фиксации конъюгата зависит от времени и температуры инкубации, которые необходимо строго соблюдать.
- Низкий уровень pH (<5) в обогатительном бульоне после внесения высококислотных продуктов (фруктовые соки, кисло-молочные продукты и др.) может приводить к ложноотрицательным результатам; необходимо нейтрализовать пробы (раздел 5).
11.5.10 Учет результатов.
Результат прямого измерения хемилюминесценции в пробах выражают в относительных люминесцирующих единицах в секунду (ОЛЕ/с).
Определение пороговой величины измерения:
пороговая величина (отсекающее значение) определяется как уровень хемилюминесценции пробы с отрицательным контролем (ОК), умноженный на коэффициент 3 («Cut-off» фактор).
11.5.10.1. Интерпретация полученных результатов: результат измерения считается положительным, если уровень хемилюминесценции в исследуемой пробе превышает уровень пороговой величины измерения (отсекающего значения).
Результат измерения считается отрицательным, если уровень хемилюминесценции в исследуемой пробе ниже или равен уровню пороговой величины измерения (отсекающего значения).
11.5.11. Результаты выявления Listeria monocytogenes в определенной навеске продукта записывают: «бактерии Listeria monocytogenes обнаружены в 25 г (куб. см) (в 50 — 100 г (куб. см) для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта» или «бактерии Listeria monocytogenes не обнаружены в 25 г (куб. см) (в 50 — 100 г (куб. см) для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта».