МУК 4.1.787-99. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции. Методические указания

(утв. Минздравом России 23.10.1999)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ МИКОТОКСИНОВ В ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ И ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ. ПОДГОТОВКА ПРОБ МЕТОДОМ ТВЕРДОФАЗНОЙ ЭКСТРАКЦИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Разработаны Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Скачков В.Б., Брагина И.В., Королева Н.В.) и ЗАО «БиоХимМак СТ» (ведущий научный сотрудник Васияров Г.Г., старший научный сотрудник Алексеева Г.С., старший научный сотрудник Осокин Д.М., доктор химических наук Староверов С.М.).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 23 октября 1999 г.

3. Введены впервые.

1. Назначение и область применения

Настоящие Методические указания устанавливают способы подготовки проб продовольственного сырья и пищевых продуктов методом твердофазной экстракции для последующего хроматографического анализа микотоксинов и предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции учреждениями госсанэпидслужбы РФ, а также для предприятий и учреждений, осуществляющих контроль качества и исследования продовольственного сырья и продуктов питания в соответствии с СанПиН 2.3.2.560-96 «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов» и аккредитованных в установленном порядке.

2. Способ подготовки проб

Подготовка проб включает следующие разделы:

• экстракция объекта испытания, предусматривающая получение единого экстракта, содержащего все микотоксины, нормируемые в данном объекте по СанПиН 2.3.2.560-96;
• подготовка экстракта проб методом твердофазной экстракции, включающая предварительную очистку, концентрирование и окончательную очистку на концентрирующих патронах Диапак.

3. Требования безопасности

При работе с реагентами, растворителями и веществами необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

4. Условия выполнения подготовки проб

Процессы приготовления растворов и обработки проб проводят в нормальных условиях при температуре окружающего воздуха 18 — 22 град. C.

5. Афлатоксин В1 (АТ-В1), зеараленон (ЗОН), дезоксиниваленол (ДОН) и Т-2 токсин (Т-2)

5.1. Оборудование, материалы, реактивы

5.2. Способ подготовки проб

Определяемые микотоксины извлекают экстрагентом из пробы при соотношении масса пробы — объем экстрагента 1:5. При определении афлатоксина В1 и зеараленона проводят очистку водно — ацетонитрильного экстракта на патроне Диапак А-3, концентрируют микотоксины на патроне Диапак П-3, высушивают от остатков воды и после упаривания и перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак Н (Диапак С — в случае кукурузы и продуктов из нее). Фракционным элюированием получают две фракции, содержащие афлатоксин В1 и зеараленон, готовые к хроматографическому анализу.

При определении дезоксиниваленола и Т-2 токсина проводят предварительную очистку водно — ацетонитрильного экстракта на патроне Диапак АУ-3 и концентрируют упариванием досуха. После перерастворения проводят окончательную очистку на патроне Диапак Н. Фракционным элюированием получают две фракции, содержащие дезоксиниваленол и Т-2 токсин, готовые к хроматографическому анализу.

Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения микотоксинов проводят анализ пробы методом стандартной добавки в исходный экстракт. Основные характеристики пробоподготовки методом твердофазной экстракции приведены в табл. 2.

Для достижения указанной степени извлечения необходимо точно выполнять требования к квалификации органических растворителей, их подготовке и приготовлению растворов, перечисленных в п. 5.1. Алгоритм поиска возможных потерь целевых микотоксинов при подготовке проб приведен в Приложении 1 к настоящим Методическим указаниям.

5.3. Подготовка концентрирующих патронов

Патроны Диапак представляют собой пластиковую колонку, содержащую 1 или 3 куб. см герметично упакованного сорбента.

5.3.1 Концентрирующий патрон Диапак А-3

Вскрыть выходную линию патрона Диапак А-3, сняв полимерную заглушку. Установить патрон в вертикальном положении узким концом вниз в подходящее устройство для вакуумирования и сбора элюата. Осторожно открыть полимерную крышку патрона, сформировать ровный горизонтальный верхний слой сорбента легким постукиванием по патрону и зафиксировать его с помощью небольшого ватного тампона. Подключить вакуум к устройству для вакуумирования и обеспечить подачу вакуума к патрону.

Концентрирующий патрон Диапак А-3 одноразового применения и регенерации не подлежит.

5.3.2 Концентрирующий патрон Диапак АУ-3

Подготовка концентрирующего патрона Диапак АУ-3 проводится аналогично п. 5.3.1.

Концентрирующий патрон Диапак АУ-3 одноразового применения и регенерации не подлежит.

5.3.3 Концентрирующий патрон Диапак П-3

Установить патрон Диапак П-3 вертикально в подходящее устройство для вакуумирования и открыть верхнюю крышку. Суспендировать сорбент при перемешивании стеклянной палочкой в 10 куб. см бензола, дать отстояться сорбенту и пропустить при слабом вакууме, не допуская попадания воздуха на сорбент, последовательно по 10 куб. см бензола и ацетона.

Сохранив слой ацетона около 2 см, ввести пористый полимерный фильтр (имеется в комплекте) и уплотнить его палочкой по верхнему слою сорбента. Затем пропустить оставшийся ацетон и последовательно по 10 куб. см экстрагента и смеси экстрагент — вода (1:1), не допуская попадания воздуха на сорбент со скоростью 2 — 3 капли в секунду.

Сохранив слой последнего элюента около 2 см, отключить вакуум и заглушить патрон сначала верхней крышкой, а затем (после прекращения скапывания) и нижней заглушкой. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение рабочего дня, а при случайном пересыхании приводится в рабочее состояние прокачиванием 10 куб. см смеси экстрагент — вода (1:1).

Концентрирующий патрон Диапак П-3 многоразового применения и подлежит регенерации по схеме, как указано выше, после проведения пробоподготовки.

5.3.4 Концентрирующий патрон Диапак Н

Снять с патрона Диапак Н заглушки, пропустить через него с помощью шприца 5 куб. см бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25 град. C.

Концентрирующий патрон Диапак Н многоразового применения и подлежит регенерации по следующим схемам после проведения пробоподготовки:

• после подготовки пробы ДТ — последовательно пропустить через патрон по 5 куб. см этилового спирта, ацетона и бензола;
• после подготовки пробы АЗ — последовательно пропустить через патрон по 5 куб. см ацетона и бензола.

5.3.5 Концентрирующий патрон Диапак С

Снять с патрона Диапак С заглушки, пропустить через него с помощью шприца 5 куб. см бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25 град. C.

Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.

5.4. Экстракция микотоксинов

5.4.1 Зерно и зернопродукты

25 г размолотой пробы перенести в коническую колбу и залить 125 куб. см экстрагента. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. Экстракт отфильтровать через бумажный фильтр «синяя лента».

5.4.2 Орехи и семена масличных культур

25 г размолотой пробы перенести в колбу Эрленмейера, добавить 125 куб. см экстрагента и 40 куб. см гексана. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. После перемешивания внести в экстракт 1 г хлорида натрия и продолжить перемешивание в течение 5 мин. Отфильтровать через бумажный фильтр «синяя лента». Отфильтрованный экстракт перенести в делительную воронку и после расслоения раствора собрать нижний водно — ацетонитрильный слой. Ацетонитрильный экстракт обезжирить 25 куб. см гексана в делительной воронке вместимостью 250 куб. см.

Экстракт перенести в делительную воронку, добавить еще 25 куб. см гептана и интенсивно перемешать. После расслоения собрать нижний водно — ацетонитрильный экстракт.

5.4.3 Масло растительное

25 г масла перенести в колбу Эрленмейера, добавить 40 куб. см гексана и 125 куб. см экстрагента. Провести интенсивное перемешивание содержимого колбы в течение 30 мин. После перемешивания в экстракт внести 0,2 г хлористого натрия и продолжить перемешивание в течение 3 — 5 мин. Экстракт перенести в делительную воронку и после расслоения смеси собрать нижний водно — ацетонитрильный слой. Ацетонитрильный экстракт обезжирить 25 куб. см гексана или гептана или петролейного эфира в делительной воронке вместимостью 250 куб. см.

Экстракт перенести в делительную воронку, добавить еще 25 куб. см гептана и интенсивно перемешать. После расслоения собрать нижний водно — ацетонитрильный экстракт.

5.5. Очистка и концентрирование проб

5.5.1 Очистка и концентрирование пробы при определении афлатоксина В1 и зеараленона

5.5.1.1 Предварительная очистка и концентрирование пробы

25 куб. см обезжиренного экстракта пропустить через патрон Диапак А-3 со скоростью 2 — 3 капли в секунду и отобрать 20 куб. см элюата.

Полученный элюат объемом 20 куб. см разбавить равным объемом воды. Полученный раствор пропустить через патрон Диапак П-3 со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего патрон промыть 5 куб. см воды и продуть воздухом в течение 1 мин.

Целевую фракцию элюировать с патрона Диапак П-3 последовательно 7 куб. см ацетонитрила и 7 куб. см 33-процентного бензола в ацетонитриле — со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Собранный элюат пропустить через слой безводного сульфата натрия (10 г) самотеком. Колбу ополоснуть 2 куб. см 33-процентного бензола в ацетонитриле и содержимое перенести на тот же слой безводного сульфата натрия. Промыть сульфат натрия 3 куб. см 33-процентного бензола в ацетонитриле. Высушенный фильтрат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 град. C и немедленно перерастворить в 0,5 куб. см бензола.

5.5.1.2 Окончательная очистка на патроне Диапак Н (вариант 1)

Бензольный раствор нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак Н. Колбу, содержавшую сухой остаток, обмыть еще 2 раза по 0,5 куб. см бензола и последовательно нанести растворы на патрон Диапак Н. Все смывы с патрона отбросить.

Зеараленон элюировать с патрона Диапак Н 4 куб. см 2-процентной уксусной кислоты в бензоле и упарить досуха (до исчезновения запаха уксусной кислоты) на ротационном испарителе при температуре не выше 50 град. C (Проба З). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Затем элюировать афлатоксин В1 5 куб. см 20-процентного ацетонитрила в бензоле с патрона и упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40 град. C (Проба А). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ афлатоксина В1, Мпр, — 4 г.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ зеараленона, Мпр, — 4 г.

5.5.1.3 Окончательная очистка на патроне Диапак С (вариант 2)

Рекомендуется для кукурузы и продуктов из нее.

Бензольный раствор нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак С. Колбу, содержавшую сухой остаток, обмыть еще 2 раза по 0,5 куб. см бензола и нанести растворы на патрон Диапак С при достижении верхнего фильтра патрона уровнем предыдущей порции раствора. Все смывы с патрона отбросить.

Зеараленон элюировать с патрона Диапак С 6 куб. см 10-процентного этилацетата в бензоле и упарить досуха (до исчезновения запаха бензола) на ротационном испарителе при температуре не выше 50 град. C (Проба З). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Затем через патрон Диапак С последовательно пропустить 3 куб. см 5-процентной уксусной кислоты в бензоле и 4 куб. см 25-процентного гексана в эфире. Все элюаты отбросить. Афлатоксин В1 элюировать с патрона 6 куб. см 10-процентного ацетона в дихлорметане. Элюат упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40 град. C (Проба А). Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ афлатоксина В1, Мпр, — 4 г.

Эквивалент массы пробы, взятой на анализ зеараленона, Мпр, — 4 г.

5.5.2 Очистка и концентрирование пробы при определении

дезоксиниваленола и Т-2 токсина

5.5.2.1 Предварительная очистка и концентрирование пробы

20 куб. см экстракта пропустить через патрон Диапак АУ-3 со скоростью 2 — 3 капли в секунду. Элюат собрать. Патрон промыть 5 куб. см экстрагента и отфильтровать объединенные элюаты в сердцевидную колбу, фильтр промыть 2 куб. см ацетонитрила, собирая промывочную жидкость в ту же колбу. Упарить досуха на ротационном испарителе при температуре около 60 — 70 град. C. Упаривание повторить 2 — 3 раза с добавлением в колбу 3 — 5 куб. см пропанола-2 или ацетонитрила до исчезновения капель воды на стенках колбы (Проба ДТ).

5.5.2.2 Окончательная очистка на патроне Диапак Н

Пробу ДТ растворить в 0,5 куб. см хлороформа и нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак Н. Колбу обмыть еще 2 раза по 0,5 куб. см хлороформа и последовательно нанести растворы на тот же патрон, начав сбор фракций, содержащих Т-2 токсин, в отгонную колбу. Завершить элюирование Т-2 токсина 2 куб. см хлороформа в ту же колбу. Элюат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре 40 — 45 град. C и перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению Т-2 токсина (Проба Т).

Дезоксиниваленол элюировать с патрона в другую отгонную колбу 6 куб. см 20-процентного ацетона в хлороформе. Элюат упарить досуха на ротационном испарителе при температуре 40 — 45 град. C и перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению дезоксиниваленола (Проба Д).

6. Афлатоксин М1

6.1. Оборудование, материалы, реактивы

20% ацетона в хлороформе - к 20 куб. см ацетона добавить хлороформ до 100 куб. см общего объема или 5% метанола в хлороформе - к 20 куб. см хлороформа добавить 5 куб. см метанола, объем раствора довести хлороформом до 100 куб. см.

6.2. Способ подготовки проб

Афлатоксин М1 извлекают из пробы жидкого молока пропусканием ее через патрон Диапак С16М. Затем фракцию, содержащую афлатоксин М1, элюируют хлороформом с патрона и, после высушивания и упаривания, проводят окончательную очистку на патроне Диапак С. Подготовленная проба готова к хроматографическому анализу.

Афлатоксин М1 из кисломолочных напитков и сметаны экстрагируют хлороформом в присутствии хлорида натрия и лимонной кислоты в соответствии с МУ N 4082-86 <*> и, после высушивания и упаривания, проводят окончательную очистку на патроне Диапак С.

<*> Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Утв. МЗ СССР 20.03.86 N 4082-86.

Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения микотоксинов проводят анализ методом стандартной добавки в исходный экстракт.

Время проведения пробоподготовки - 60 мин. Степень извлечения <*> - 80%. Относительное среднее квадратическое отклонение - 10%.

<*> При снижении степени извлечения афлатоксина М1 см. Приложение 1.

6.3. Подготовка концентрирующих патронов

6.3.1 Концентрирующий патрон Диапак С16М

Снять с патрона Диапак С16М заглушки и пропустить через него с помощью шприца последовательно по 5 куб. см ацетонитрила и воды. Заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25 град. C.

Концентрирующий патрон Диапак С16М одноразового применения и регенерации не подлежит.

6.3.2 Концентрирующий патрон Диапак С

Снять с патрона Диапак С заглушки и пропустить через него с помощью шприца 5 куб. см бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25 град. C.

Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.

6.4. Подготовка проб молочных продуктов к анализу

6.4.1 Подготовка, концентрирование и очистка

Пробу молока 50 куб. см центрифугировать на подходящем оборудовании в течение 5 мин. при 1000 об./мин. Для определения афлатоксина М1 отобрать 20 куб. см супернатанта, избегая попадания жира.

Сухое молоко растворяется в соответствии с инструкцией или соответствующим ТУ и обрабатывается, как описано выше.

20 куб. см подогретой до 40 град. C подготовленной пробы молока пропустить через предварительно подготовленный патрон Диапак С16М со скоростью 3 капли в секунду. Затем патрон промыть 5 куб. см дистиллированной воды и высушить продуванием воздуха в течение 1 мин. Элюаты отбросить. Патрон промыть 10 куб. см гексана и вновь высушить воздухом в течение 1 мин.

Афлатоксин М1 элюировать 6 куб. см хлороформа. Собранный элюат пропустить самотеком через слой безводного сульфата натрия (3 куб. см). Колбу обмыть 1 куб. см хлороформа, и содержимое перенести на тот же слой безводного сульфата натрия. Хлороформные растворы собрать (Экстракт М).

6.4.2 Подготовка проб сметаны и кисломолочных

    В коническую  колбу вместимостью 250 куб.  см помещают навеску
20,0 г сметаны или 40 куб.  см кисломолочного напитка.  Затем туда
же вносят 10,0 куб.  см водного раствора 2 г хлорида натрия и 0,24
г лимонной кислоты и 100 куб.  см хлороформа (все составные  части
предварительно  подогревают  до  температуры  35  -  38 град.  C).
Содержимое колбы встряхивают 2 - 3 мин.,  переносят в центрифужные

стаканы и центрифугируют 15 мин. при 3000 — 4000 об./мин. Отделяют

нижний хлороформный слой, высушивают над 10 г безводного сульфата

натрия, отфильтровывают, измеряют объем фильтрата (V ) и упаривают

ф

до 5 — 6 куб. см (Экстракт М).

6.5. Окончательная очистка пробы

Экстракт М нанести на патрон Диапак С со скоростью 3 — 4 капли в секунду. Промыть сульфат натрия 1 куб. см хлороформа, и раствор нанести на патрон Диапак С при достижении верхнего фильтра патрона уровнем предыдущей порции раствора.

Афлатоксин М1 элюировать с патрона 10 куб. см 20-процентного ацетона в хлороформе или 7 куб. см 5-процентного метанола в хлороформе. Элюат собрать и упарить досуха на ротационном испарителе или в слабом токе азота при температуре не выше 40 град. C. Сухой остаток немедленно перерастворить в растворителе, соответствующем конечному хроматографическому определению (Проба М).

    Эквивалент массы пробы молока,  взятой на  анализ  афлатоксина
М1, М  , - 20 г.

пр

Эквивалент массы пробы сухого молока рассчитывается по

формуле:

m

                         М   = --- x 20,                     (6.1)
                          пр    V

где:

М — эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;

пр

m — масса пробы сухого молока, г;

V — объем воды для растворения пробы сухого молока, куб. см.

Эквивалент массы пробы сметаны или кисломолочных напитков,

взятой на анализ, рассчитывается по формуле:

V

ф

                         M   = --- x m  ,                    (6.2)
                          пр   100    пр

где:

M — эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;

пр

V — объем фильтрата, куб. см;

ф

m — масса (объем) пробы сметаны или кисломолочных напитков,

пр

г (куб. см).

7. Патулин

7.1. Оборудование, материалы, реактивы

1,5% карбоната натрия - 1,5 г карбоната натрия растворить в 100 куб. см воды.

15% этилацетата в бензоле - 15 куб. см этилацетата разбавить бензолом до 100 куб. см.

30% этилацетата в бензоле - 30 куб. см этилацетата разбавить бензолом до 100 куб. см.

Раствор Карреза I - 15,0 г гексацианоферрата II калия растворить в 100 куб. см воды.

Раствор Карреза II - 30,0 г ацетата цинка растворить в 100 куб. см воды.

7.2. Способ подготовки проб

    Микотоксин патулин  извлекают  из  проб  осветленных  соков  и
напитков пропусканием их через патрон Диапак  П-3.  Затем  патулин
элюируют  этилацетатом  с  патрона  и  после  обработки  раствором
Na CO ,  высушивания,  упаривания   и   перерастворения   проводят
  2  3

окончательную очистку на патроне Диапак С.

    Соки и напитки с мякотью  и  консистентные  продукты  разводят
водой,  осветляют  растворами  Карреза  в  соответствии  с  ГОСТом

28038-89 <*>, фильтруют и экстрагируют патулин пропусканием

фильтрата   через   патрон  Диапак  П-3.  Затем  патулин  элюируют
этилацетатом  с  патрона  и  после  обработки  раствором   Na CO ,
                                                             2  3
высушивания,  упаривания  и перерастворения проводят окончательную

очистку на патроне Диапак С.

--------------------------------

<*> Продукты переработки плодов и овощей. Метод определения

микотоксина патулина. ГОСТ 28038-89.

Подготовленные пробы готовы к хроматографическому анализу.

Для проверки правильности проведения пробоподготовки и уточнения степени извлечения патулина проводят анализ методом стандартной добавки в пробу.

Время проведения пробоподготовки — 90 мин. Степень извлечения <*> — 60%. Относительное среднее квадратическое отклонение — 10%.

<*> При снижении степени извлечения патулина см. Приложение 1.

7.3. Подготовка концентрирующих патронов

7.3.1 Концентрирующий патрон Диапак П-3

Установить патрон Диапак П-3 вертикально в подходящее устройство для вакуумирования и открыть верхнюю крышку. Суспендировать сорбент при перемешивании стеклянной палочкой в 10 куб. см бензола, дать отстояться сорбенту и пропустить при слабом вакууме, не допуская попадания воздуха, последовательно по 10 куб. см бензола и ацетона.

Сохранив слой ацетона около 2 см, ввести пористый полимерный фильтр (имеется в комплекте) и уплотнить его палочкой по верхнему слою сорбента. Затем пропустить оставшийся ацетон и последовательно по 10 куб. см экстрагента (см. п. 5.1) и смеси экстрагент — вода (1:1), не допуская попадания воздуха на сорбент со скоростью 2 — 3 капли в секунду.

Сохранив слой последнего элюента около 2 см, отключить вакуум и заглушить патрон сначала верхней крышкой, а затем (после прекращения скапывания) и нижней заглушкой. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение рабочего дня, а при случайном пересыхании приводится в рабочее состояние прокачиванием 10 куб. см смеси экстрагент — вода (1:1).

Перед проведением пробоподготовки через патрон Диапак П-3 пропустить 10 куб. см воды.

Концентрирующий патрон Диапак П-3 многоразового применения и подлежит регенерации после проведения пробоподготовки по схеме его подготовки, как указано выше.

7.3.2 Концентрирующий патрон Диапак С

Снять с патрона Диапак С заглушки и пропустить через него с помощью шприца 5 куб. см бензола и заглушить оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 25 град. C.

Концентрирующий патрон Диапак С одноразового применения и регенерации не подлежит.

7.4. Подготовка проб к анализу

7.4.1 Подготовка осветленных соков и напитков

Отфильтровать пробу через плотный бумажный фильтр до получения 20 куб. см фильтрата (Фильтрат П).

7.4.2 Подготовка соков и напитков с мякотью

Навеску пробы массой 10,0 г поместить в стеклянный стакан, смешать с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 куб. см. В мерную колбу внести 6,0 куб. см раствора Карреза I и 6,0 куб. см раствора Карреза II. Содержание колбы довести дистиллированной водой до метки, тщательно перемешать и отфильтровать в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Измерить объем фильтрата (Фильтрат П).

7.5. Концентрирование и очистка пробы

7.5.1 Концентрирование пробы на патроне Диапак П-3

Весь объем Фильтрата П нанести на предварительно кондиционированный патрон Диапак П-3 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Промыть патрон 5 куб. см бидистиллированной воды. Все смывы отбросить.

Патулин элюировать с патрона 10 куб. см этилацетата в колбу или мерную пробирку с пришлифованной пробкой, содержащую 5 куб. см 1,5-процентного карбоната натрия, закрыть пробкой, интенсивно перемешать и дать отстояться. Декантировать верхний этилацетатный слой, высушить его безводным сульфатом натрия (3 г) и перенести в колбу для упаривания. В колбу или пробирку, содержащую оставшийся 1,5-процентный карбонат натрия, добавить еще 10 куб. см этилацетата, перемешать и, после полного расслоения, высушивания этилацетатного слоя тем же сульфатом натрия, объединить его с первой порцией этилацетатного раствора в той же колбе для упаривания. Операцию повторить с 5 куб. см этилацетата.

Упарить этилацетатный раствор на ротационном испарителе при температуре не выше 40 град. C до объема около 0,5 куб. см (не упаривать досуха!). Количественно перенести пробу в сердцевидную колбу вместимостью не более 5 куб. см или в полимерную пробирку типа Эппендорф, промыв предыдущую отгонную колбу 0,5 куб. см этилацетата, и присоединить к упариваемой пробе. Пробу упарить в токе азота при температуре не более 40 град. C в суховоздушной бане до 0,5 куб. см и добавить к ней 2,5 куб. см бензола.

7.5.2 Окончательная очистка пробы на патроне Диапак С

Бензол — этилацетатный раствор пропустить через патрон Диапак C со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Обмыть колбу еще 0,5 — 1,0 куб. см 15-процентного этилацетата в бензоле и нанести на патрон. Все смывы отбросить.

Патулин элюировать с патрона 6 куб. см 30-процентного этилацетата а бензоле, собирая элюат в сердцевидную отгонную колбу. Элюат упарить досуха в токе азота при температуре не выше 40 град. C в суховоздушной бане.

Внимание! После упаривания пробу немедленно перерастворить в 100 мкл хлороформа, охлажденного до 0 — 5 град. C (для ТСХ — анализа) или в 100 — 500 мкл охлажденной до 5 — 8 град. C бидистиллированной воды, подкисленной до pH 4,0 уксусной кислотой (для ВЭЖХ — анализа) и быстро охладить до 0 — 5 град. C (Проба П). Хранить Пробу П в холодильнике не более 1 ч.

Эквивалент массы пробы осветленных соков и напитков, взятой на

анализ, М , — 20 г, соков и напитков с мякотью и консистентных

пр

продуктов определяется по формуле:

V

Фр.П

                        М   = ----- x m  ,                   (7.1)
                         пр     50     пр

где:

М — эквивалент массы пробы, взятой на анализ, г;

пр

V — объем Фракции П, куб. см;

Фр.П

m — масса пробы соков и напитков с мякотью или консистентных

пр

продуктов, г.

Введение

Каждая партия концентрирующих патронов Диапак П-3, Диапак С16М, Диапак Н, Диапак С, а также партии сорбентов Диасорб А и Диасорб АУ подвергаются выходному контролю в соответствии с ТУ 4215-002-05451931-94 на их соответствие требованиям, предъявляемым к специализированным патронам для твердофазной экстракции микотоксинов. Этим метрологически обеспечивается их производство.

Применение настоящих испытаний рекомендуется проводить в следующих случаях:

• если результат проверки правильности проведения пробоподготовки методом стандартной добавки не соответствует нормативу коэффициента извлечения;
• если патроны Диапак подвергались неправильному хранению или нарушена целостность упаковки;
• в случаях дополнительного сверхнормативного использования регенерируемых патронов (Диапак Н, Диапак П-3).

Приведенные ниже методики проверки патронов Диапак позволяют выявить ошибку по стадиям пробоподготовки. При соответствии характеристик патронов Диапак нормативным требованиям следует искать ошибки в правильности подготовки растворителей и приготовлении растворов, контроле условий упаривания и перерастворения анализируемых проб.

Если среди стадий подготовки пробы присутствует подготовка на патроне Диапак С, рекомендуется начинать анализ возможной потери целевого компонента именно с этого патрона. Это связано с чувствительностью силикагеля к качеству используемых растворителей, и прежде всего с содержанием в них воды. Такая специфика сильной зависимости активности патрона Диапак С от условий его хранения и качества используемых растворителей может потребовать оптимизации количества элюента, используемого при работе с этими патронами в конкретной лаборатории.

Общая часть

    Настоящая Методика    предназначена    для    метрологического
обеспечения применения патронов Диапак в  анализе  микотоксинов  и
устанавливает процедуру их испытаний.  Критерием качества патронов
Диапак  является  соответствие  результатов  испытаний  нормативам
коэффициента   извлечения,   K ,   в   модельных  экспериментах  в

R

соответствии со схемами элюирования, приведенными в разделах 5 — 7

настоящих Методических указаний.

Коэффициент извлечения рассчитывают по формуле:

C' x K

d

                       K  = ------- x 100,                     (1)
                        R     C

гр

где:

K — коэффициент извлечения данных микотоксинов, %;

R

    C' - концентрация данного микотоксина,  найденная в результате
испытания,  мкг/куб.  см (или S' площадь хроматографического пика,

соответствующая концентрации C');

C — концентрация того же микотоксина, используемая для

гр

градуировки хроматографической системы, мкг/см (или S площадь

гр

хроматографического пика, соответствующая концентрации C );

гр

K — коэффициент разведения образца.

d

За окончательное значение K принимается среднее

R

арифметическое результатов двух параллельных испытаний, если

абсолютное расхождение между ними не превышает 5%.

Испытания проводятся относительным методом по схеме «введено — найдено», поэтому специальных требований к стандартным образцам микотоксинов не предъявляется.

1. Испытание патронов Диапак А-3 и Диапак П-3 по афлатоксину В1 и зеараленону

Испытание патронов Диапак А-3 проводится совместно с Диапак П-3 из-за низких концентраций афлатоксина В1 и зеараленона, а также их температурной лабильности, приводящей к невозможности концентрирования упариванием. Патрон Диапак П-3 может быть испытан независимо от Диапак А-3, что рекомендуется выполнять потребителю через каждые 10 проб после соответствующей регенерации по п. 5.3.3.

Приготовить из имеющихся стандартных растворов микотоксинов

1,0 куб. см испытательной смеси, содержащей 0,4 мкг афлатоксина В1

и 4,0 мкг зеараленона в произвольной смеси бензола и ацетонитрила.

Аликвоту  смеси  объемом  0,25  куб.  см  перенести в сердцевидную
колбу,  и упарить растворители досуха в токе азота при температуре
40  град.  C.  Немедленно  перерастворить  остаток в 0,25 куб.  см
растворителя,   соответствующего   конечному   хроматографическому
определению.  Ориентировочные значения концентраций:  0,4 мкг/куб.
*см* - для афлатоксина В1 и  4,0  мкг/куб.  см  -  для  зеараленона.
Ввести  раствор  не  менее двух раз в хроматографическую систему и
рассчитать среднее арифметическое значение площадей пиков  каждого
из микотоксинов, C  (S  ).
                  гр  гр
    Подготовить патроны Диапак А-3 и Диапак П-3 в  соответствии  с

п. п. 5.3.1 и 5.3.3.

Вторую аликвоту смеси объемом 0,25 куб. см упарить аналогично,

перерастворить в 25 мл экстрагента (смеси ацетонитрил — вода -

84:16) и нанести на патрон Диапак А-3 в соответствии с п. 5.1.1.

Полученные  20  мл элюата сконцентрировать на патроне Диапак П-3 в
соответствии   с   п.   5.1.1.   Концентрат    перерастворить    и
проанализировать аналогично градуировочному эксперименту,  получив

значение C'(S').

    Рассчитать значение  K   по  формуле (1).  Значение K  = 1,25.
                          R                              d
Коэффициент извлечения,  K ,  должен  быть  не  менее  90%  -  для

R

афлатоксина В1 и 85% — для зеараленона.

При испытании одного патрона Диапак П-3 вторую аликвоту

объемом 0,25 куб. см после упаривания перерастворить в 40 мл смеси

экстрагент — вода (1:1) (смеси ацетонитрил — вода 42:58) и

сконцентрировать в соответствии с п. 5.1.1. Рассчитать значение

K , принимая K  = 1,00. Коэффициент извлечения, K , должен быть не
 R            d                                  R

менее 95% — для афлатоксина В1 и 95% — зеараленона.

2. Испытание патронов Диапак АУ-3 по дезоксиниваленолу и Т-2 токсину

Приготовить из имеющихся стандартных растворов микотоксинов

1,0 см испытательной смеси, содержащей по 20 мкг дезоксиниваленола

и  Т-2  токсина  в  произвольной  смеси  бензола  и  ацетонитрила.
Аликвоту  смеси  объемом  0,25  куб.  см  перенести в сердцевидную
отгонную колбу и упарить  досуха  на  ротационном  испарителе  при

температуре 40 — 50 град. C. Перерастворить остаток в 0,25 куб. см

растворителя, соответствующего конечному хроматографическому

определению. Ориентировочное значение концентраций: 20 мкг/куб. см

• для дезоксиниваленола и Т-2 токсина. Для градуировки

хроматографической  системы  ввести  раствор  не  менее двух раз и
рассчитать среднее арифметическое значение площадей пиков  каждого
из микотоксинов, C  (S  ).
                  гр  гр

Подготовить патрон Диапак АУ-3 по п. 5.3.2.

Вторую аликвоту смеси объемом 0,25 куб. см упарить аналогично,

перерастворить в 20 мл экстрагента (смеси ацетонитрил — вода

84:16) и нанести на патрон Диапак АУ-3, в соответствии с п. 5.5.2.

После упаривания досуха остаток перерастворить и проанализировать

аналогично градуировочному эксперименту, получив значение C' (S').

Рассчитать значение K  по формуле 1. Значение K  = 1,00.
                     R                         d
    Коэффициент извлечения  K   должен  быть  не  менее 95%  - для

R

дезоксиниваленола и Т-2 токсина.

3. Испытания патрона Диапак Н

    Концентрирующие патроны  Диапак  Н   являются   универсальными
регенерируемыми  патронами  для  окончательной очистки афлатоксина
В1),  зеараленона,  дезоксиниваленола  и  Т-2   токсина,   поэтому
испытание  рекомендуется  выполнять  через  каждые  10  проб после

очередной регенерации по п. 5.3.4. Патроны Диапак Н обеспечивают

тонкую  очистку указанных микотоксинов с высокими метрологическими
характеристиками (K  не менее 90%),  поэтому значения K  менее 90%
                   R                                   R

чаще всего свидетельствуют об ошибках в приготовлении элюентов или

о недостаточной чистоте растворителей.

3.1 Испытание по афлатоксину В1 и зеараленону

Сухой остаток упаренной второй аликвоты испытательной смеси по

п. 1 немедленно перерастворить в 0,5 мл бензола и нанести по

условиям п. 5.1.2 на подготовленный (см. п. 5.3.4) патрон Диапак

Н.  После  элюирования  и  упаривания Пробы З и Пробы А немедленно
перерастворить их в 0,25 куб.  см  растворителя,  соответствующего
конечному   хроматографическому  определению,  и  проанализировать

аналогично градуировочному эксперименту по п. 1, получив значение

C  (S  ) и C'(S') по каждому из микотоксинов.
 гр  гр
    Рассчитать значение K  по формуле (1).  Значение  K   =  1,00.
                         R                             d
Коэффициент   извлечения  K   должен  быть  не  менее  90%  -  для

R

афлатоксина В1 и зеараленона.

3.2 Испытания по дезоксиниваленолу и Т-2 токсину

Сухой остаток упаренной второй аликвоты испытательной смеси по

п. 2 перерастворить в 0,5 мл хлороформа и нанести по условиям п.

5.1.2 на подготовленный патрон Диапак Н. После элюирования и

упаривания  Пробу  Д  и  Пробу  Т  перерастворить  в 0,25 куб.  см
растворителя,   соответствующего   конечному   хроматографическому
определению,   и   проанализировать   аналогично   градуировочному

эксперименту по п. 2, получив значения C (S ) и C'(S') по

гр гр

каждому из микотоксинов.

    Рассчитать значения K  по формуле (1).  Значение  K   =  1,00.
                         R                             d
Коэффициент   извлечения   K    должен   быть  не  менее  90%  для

R

дезоксиниваленола и Т-2 токсина.

4. Испытания патрона Диапак С

    Концентрирующие патроны   Диапак   С   являются   одноразовыми
патронами  для окончательной очистки афлатоксина В1 и зеараленона,
а также афлатоксина М1 и патулина.  Патроны Диапак С  обеспечивают
тонкую  очистку указанных микотоксинов с хорошими метрологическими
характеристиками  (K   =  75  -  90%).  Для  достижения  указанных

R

характеристик  необходимо установить оптимальный объем элюирования
моделированием порционного элюирования (1 -  3  порции  по  3  мл)

целевых фракций в ходе настоящих испытаний.

Оптимальную схему элюирования, т.е. необходимое число порций по 3 мл, потребитель устанавливает по достижению суммарного коэффициента извлечения не ниже указанного норматива. Установленный объем элюирования подлежит проверке при смене партии растворителей и их смесей, используемых для тонкой очистки микотоксинов.

4.1 Испытания по афлатоксину В1 и зеараленону

Подготовить патрон Диапак С в соответствии с п. 5.3.5.

Сухой остаток упаренной второй аликвоты испытательной смеси по

п. 1 немедленно перерастворить в 0,5 мл бензола и нанести на

патрон Диапак С в соответствии с п. 5.1.3. После элюирования и

раздельного упаривания трех фракций Пробы З и трех фракций Пробы А

немедленно  перерастворить  их  в  0,25  куб.   см   растворителя,
соответствующего   конечному  хроматографическому  определению,  и

проанализировать аналогично градуировочному эксперименту по п. 1,

получив по три значения S и одному S' по каждому из

гр

микотоксинов.

Рассчитать K по формуле (1) для каждой из трех фракций Проб З

R

и А K  = 1,00.  Суммарный коэффициент извлечения K  должен быть не
     d                                            R

менее 90% — для афлатоксина В1 и 85% — для зеараленона. Определить

минимально    возможное    число     последовательных     фракций,
обеспечивающее  суммарный  K   не ниже норматива.  Найденное число

R

фракций (от 1 до 3) и  определяет  оптимальный  объем  элюирования
данных   микотоксинов   с   патрона   Диапак  С  данной  партии  с

приготовленными растворителями.

Если значение суммарного K меньше нормативного значения, то

R

это свидетельствует об ошибках в приготовлении элюирующих смесей

и/или о недостаточной чистоте растворителей, в особенности с точки

зрения содержания в них воды.

4.2 Испытание по афлатоксину М1

    Приготовить из имеющегося стандартного раствора  1,0  куб.  см
испытательной   смеси,   содержащей   0,1  мкг  афлатоксина  М1  в
произвольной смеси бензола и ацетонитрила.  Аликвоту смеси объемом
0,25  куб.  см  перенести в сердцевидную колбу и упарить раствор в
токе азота при температуре 40 град.  C.  Немедленно перерастворить
остаток  в  0,25  -  1,0  куб.  см растворителя,  соответствующего
конечному   хроматографическому    определению.    Ориентировочные
значения  концентраций  афлатоксина  М1  0,025  - 0,1 мкг/куб.  см

соответственно. Для проведения градуировочного эксперимента ввести

раствор   не   менее  двух  раз  в  хроматографическую  систему  и
рассчитать  среднее   арифметическое   значение   площадей   пиков
афлатоксина М1, C  (S  ).
                 гр  гр

Вторую аликвоту смеси объемом 0,25 куб. см упарить, как описано выше, перерастворить в 6 мл хлороформа и нанести в условиях п. 6.5 на подготовленный (см. п. 6.3.2) патрон Диапак С. После элюирования и раздельного упаривания трех последовательных фракций Пробы М немедленно перерастворить их в 0,25 — 1,0 куб. см растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению, и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту, получив три значения C'(S') по афлатоксину М1.

Рассчитать K по формуле (1) для каждой их трех фракций Пробы

R

М  K  = 1,00.  Суммарный коэффициент извлечения K  для афлатоксина
    d                                            R
М1 должен быть не менее 85%.  Найти оптимальный объем  элюирования
афлатоксина М1 с патрона Диапак С по алгоритму,  приведенному в п.

4.1. Там же приведен алгоритм поиска ошибок.

4.3 Испытание по патулину

    Приготовить из имеющегося стандартного раствора  1,0  куб.  см
испытательной  смеси,  содержащей  4,0 мкг патулина в произвольной
смеси бензола и ацетонитрила.  Аликвоту смеси объемом 0,25 куб. см

перенести в сердцевидную колбу и упарить растворитель в токе азота

при температуре 35 — 40 град. C. Немедленно перерастворить остаток

в   0,25   куб.   см   растворителя,   соответствующего  конечному
хроматографическому    определению.    Ориентировочное    значение
концентрации   патулина:   4,0   мкг/куб.   см.   Для   проведения
градуировочного эксперимента ввести раствор не менее  двух  раз  в
хроматографическую  систему  и  рассчитать  среднее арифметическое
значение площади пика патулина, C  (S  ).
                                 гр  гр

Вторую аликвоту смеси объемом 0,25 куб. см упарить аналогично, перерастворить в 3 мл 15-процентного этилацетата в бензоле и нанести в условиях п. 7.5.2 на подготовленный (см. п. 7.3.2) патрон Диапак С. После элюирования и раздельного упаривания трех последовательных фракций Пробы П немедленно перерастворить их в 0,25 куб. см растворителя, соответствующего конечному хроматографическому определению, и проанализировать аналогично градуировочному эксперименту по п. 4.3, получив три значения C'(S') по патулину.

Рассчитать значение K по формуле (1) для каждой из трех

R

фракций  Пробы П.  K  = 1,00.  Суммарный коэффициент извлечения K
                    d                                            R
для патулина должен быть не менее  75%.  Найти  оптимальный  объем

элюирования патулина с патрона Диапак С по алгоритму, приведенному

в п. 4.1. Там же приведен алгоритм поиска ошибок.

5. Испытание патрона Диапак П-3 по патулину

Вторую аликвоту испытательной смеси по п. 4.3 объемом 0,25

куб.  см после упаривания перерастворить в охлажденной до  5  -  8
град.  C  воде,  подкисленной  уксусной  кислотой  до  pH  4,0,  и

сконцентрировать в условиях п. 7.5.1 на подготовленном (см. п.

7.3.1) патроне Диапак П-3. После элюирования и высушивания упарить

этилацетатный экстракт досуха в токе азота при температуре 35 — 40

град.  C,  немедленно перерастворить в 0,25 куб.  см растворителя,
соответствующего  конечному  хроматографическому  определению,   и
проанализировать  аналогично  градуировочному  эксперименту  по п.

4.3, получив значения C (S ) и C'(S').

                       гр  гр
    Рассчитать значение K  по формуле (1).  Значение  K   =  1,00.
                         R                             d
Коэффициент извлечения K  для патулина должен быть не менее 80%.

R

6. Испытание патрона Диапак С16М по афлатоксину М1

Вторую аликвоту испытательной смеси по п. 4.2 объемом 0,25

куб. см после упаривания перерастворить в 20 мл 5-процентного

ацетонитрила в воде и нанести в соответствии с п. 6.4.1 на

подготовленный по п. 6.3.1 патрон Диапак С16М. После элюирования и

высушивания  упарить  хлороформный  экстракт  М   на   ротационном
испарителе   при  температуре  не  выше  40  град.  C,  немедленно
перерастворить  его  в  0,25   -   1,0   куб.   см   растворителя,
соответствующего   конечному  хроматографическому  определению,  и
проанализировать аналогично  градуировочному  эксперименту  по  п.

4.2, получив значения C (S ) и C'(S') для афлатоксина М1.

                            гр  гр
Рассчитать K  по формуле (1) K  =  1,00.  Коэффициент  извлечения,
            R                 d

K , по афлатоксину М1 должен быть не менее 95%.

R