Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 20.03.1986 № 4082-86)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563). По вопросу, касающемуся применения данного документа, см. письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32
20 марта 1986 г. № 4082-86
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ АФЛАТОКСИНОВ В ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АФЛАТОКСИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Оборудование и материалы
1. Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78.
2. Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76 (завод «Химлаборприбор»).
4. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа ОЛД-41.
5. Жидкостный хроматограф высокой эффективности «Altex» модель 336 или другой хроматограф с аналогичными параметрами; колонка и предколонка с силикагелем типа «Ultrasphere Sf», с размером частиц 5 микрон; длина колонки 25 см, предколонки 4,5 см, внутренний диаметр колонок 0,46 см; флуоресцентный детектор «Kratos» модель FS-970 с кюветой, заполненной силикагелем, или другой детектор с аналогичными параметрами; ультрафиолетовый детектор «Kratos».
7. Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками, например, стеклянные четырехугольные сосуды 195 x 195 x 200 мм завода «Дружная горка».
8. Пластины для ТСХ «Силуфол» размером 15 x 15 или 20 x 20 см, ЧССР.
9. Воронки делительные ВД2-250 или ВД2-500 по ГОСТ 8613-75.
10. Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц 100 — 250 микрон (силикагель ЧССР).
11. Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, тип 2-100 ГОСТ 1770-74.
12. Цилиндры мерные на 250 мл с притертой пробкой, тип 2-250 по ГОСТ 1770-74.
13. Колбы плоскодонные конические на 250 и 500 мл с НШ 29 тип КнКШ 250-29/32 и 500-29/32 по ГОСТ 10394-72.
14. Колбы круглодонные на 1000 мл с НШ 29, тип ККШ-250-29/32 по ГОСТ 10395-72.
15. Колбы грушевидные на 50 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-72.
16. Воронки химические диаметром 150 мл по ГОСТ 8613-75.
17. Колонка стеклянная хроматографическая 2300 x 15 мм.
18. Распылитель стеклянный с грушей.
19. <a id="p100023"></a>Афлатоксин B или смесь афлатоксинов B , B , G , G .
1 1 2 1 2
20. <a id="p100024"></a>Афлатоксин M .
1
22. Гексан по ТУ 6-09-3375-73.
23. Бензол по ГОСТ 5955-75.
24. Ацетонитрил по ТУ 6-09-3543-74.
25. Метанол по ГОСТ 6995-77.
26. Хлороформ медицинский или по ГОСТ 3160-51.
27. Эфир диэтиловый медицинский по ГОСТ 6265-52.
29. Кислота лимонная по ГОСТ 3652-29.
30. Кислота азотная концентрированная по ГОСТ 4461-67.
31. Сульфат натрия безводный по ГОСТ 4166-76.
32. Натрий хлористый по ГОСТ 4233-66.
33. Свинец уксуснокислый по ГОСТ 1027-67.
34. Окись алюминия для колоночной хроматографии (нейтральный) 40/250 (ЧССР).
1. <a id="p100039"></a>Определение афлатоксинов B , B , G , G
1 2 1 2
в пищевых продуктах
1.1. Экстракция
При отборе проб следует руководствоваться требованиями ГОСТ 12330-66 «Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе». Отобранную пробу измельчают в течение 1 — 2 минут в кофемолке или лабораторной мельнице. Навеску 25 г измельченного продукта помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, тщательно перемешивают с 25 мл 10-процентного раствора хлорида натрия. Добавляют 100 мл ацетона и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбирают 50 мл фильтрата.
1.2. Очистка экстракта
К 50 мл фильтрата добавляют 20 мл 15-процентного раствора ацетата свинца и 30 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют стоять на 10 минут в темноте. Отфильтровывают образовавшийся осадок через бумажный складчатый фильтр, отбирают 80 мл фильтрата. Обезжиривают в делительной воронке гексаном (2 x 30 мл), затем переэкстрагируют в хлороформ (1-ый раз 30 мл хлороформа, 2-ой раз смесью хлороформ-ацетон, 3:1 — 45 мл). Объединенные хлороформные экстракты помещают в плоскодонную колбу на 250 мл, добавляют 5 — 7 г безводного сульфата натрия, встряхивают и оставляют стоять на 30 минут в темноте. Раствор фильтруют через кусочек ваты, помещенный в химическую воронку, в грушевидную колбу. Хлороформный раствор упаривают на ротационном испарителе до объема 1 мл. Далее производят очистку экстракта с помощью колоночной хроматографии.
На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, затем безводный сульфат натрия (толщина слоя 5 мм), наливают суспензию 2 г силикагеля в хлороформе, сверху насыпают слой безводного сульфата натрия (20 мм). Дают хлороформу стечь, затем на колонку наносят хлороформный экстракт образца, элюируют смесью хлороформ-ацетон (9:1) 60 мл. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе, остаток растворяют в 2 мл хлороформа, фильтруют через бумажный или капроновый фильтр в пробирку емкостью 5 мл, отдувают растворитель в токе азота, остаток растворяют в 400 мкл хлороформа (раствор А) и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
1.3. Приготовление стандартных растворов афлатоксинов
B , B , G , G
1 2 1 2 Стандартные растворы готовят следующим образом: навески кристаллических афлатоксинов B , B , G , G в 1 мг помещают 1 2 1 2 в мерные колбы на 100 мл и доводят до метки смесью бензол- ацетонитрил (98:2). Концентрации афлатоксинов в приготовленных
стандартных растворах составляют 10 нг/мкл.
Для приготовления рабочего раствора смеси афлатоксинов B , B ,
1 2
G и G с концентрациями 0,5 нг/мкл, 0,25 нг/мкл, 0,2 нг/мкл и 0,1
1 2
нг/мкл соответственно в мерную колбу на 50 мл помещают 2,5 мл
стандартного раствора афлатоксина B ; 1,25 мл B ; 1,0 мл G и
1 2 1
0,5 мл G , затем доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил
2
(98:2).
Стандартный раствор хранится в холодильнике при температуре ниже 0 °C, срок годности стандартного раствора 1 год.
1.4 Обнаружение и количественное определение
афлатоксинов B , B , G , G с помощью ВЭЖХ
1 2 1 2
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - эфир-метанол-вода 95:4:1,
скорость потока подвижной фазы - 1 мл/мин. Рекомендуется
использовать перегнанный метанол и бидистиллированную воду. Эфир
перед использованием пропускают через колонку с оксидом алюминия.
Все растворители необходимо предварительно отфильтровать.
Флуоресцентный детектор устанавливается на длину волны
возбуждающего излучения 360 нм (или устанавливается
соответствующий фильтр на линии возбуждения при работе с
флуоресцентным детектором без монохроматора), на линии эмиссии
устанавливается эмиссионный фильтр с полосой пропускания от 418
нм. Входное напряжение самописца - 10 мВ, чувствительность
детектора устанавливается таким образом, чтобы 1 нг афлатоксина B 1
соответствовало отклонение пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы. Предел обнаружения при таких условиях составляет около 0,1 нг афлатоксина B во вколе
1
(при флуоресцентном детектировании).
Для калибровки прибора по флуоресцентному детектору в инжектор
с помощью микрошприца вводится 1 мкл рабочего раствора для ВЭЖХ
(соответствует 0,5 нг афлатоксина B , 0,25 нг B , 0,2 нг G и 0,1
1 2 1
нг G ) и 2 мкл рабочего раствора (1 нг B , 0,5 нг B , 0,4 нг G
2 1 2 1
и 0,2 нг G ). Для каждого количества афлатоксинов определяют
2
высоту пика. В приведенных выше условиях время выхода растворителя
составляет 3,0 - 3,5 мин., время удерживания афлатоксинов: для B 9,0 - 10,0 мин., для B 11,0 - 11,8 мин., для G 13,0 - 14,0 1 2 1 мин., для G 15,6 - 17,0 мин. в зависимости от небольших изменений
2
в составе подвижной фазы и времени уравновешивания колонки.
При высоких уровнях загрязнения пищевого продукта афлатоксинами (свыше 10 мкг/кг по афлатоксину B ) рекомендуется
1
использовать также показания УФ-детектора. Калибровку прибора по УФ-детектору проводят также, как в случае флуоресцентного детектора, вводя в петлю инжектора 10, 15 и 20 мкл рабочего
раствора (соответствует 5; 7,5 и 10 нг афлатоксина B ; 2,5; 3,75 и 1
5 нг афлатоксина B ; 2, 3 и 4 нг G , 1; 1,5 и 2 нг G ). Предел
2 1 2
обнаружения по УФ-детектору составляет 1 нг по афлатоксину B . 1
В инжектор хроматографа вводится с помощью микрошприца 20 мкл раствора А. При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с афлатоксином B (B , G , G ) определяют его высоту (h). Расчет 1 2 1 2
концентрации афлатоксина проводят по формуле:
V x V x V x m x h
1 3 5 ст
V x V x V x M x h
2 4 6 ст
где:
C — концентрация афлатоксинов в пищевом продукте в мкг/кг;
V — объем водно-ацетоновой смеси в мл (125 мл); 1
V — объем водно-ацетонового фильтрата, взятый для анализа 2 (50 мл);
V — объем водно-ацетонового фильтрата и раствора ацетата 3 свинца (100 мл);
V — объем фильтрата после очистки ацетатом свинца (80 мл); 4
V — объем очищенного раствора экстракта в хлороформе перед 5 ВЭЖХ (400 мкл);
V — объем раствора экстракта, вводимого в петлю инжектора 6 хроматографа (20 мкл);
m — количество нг афлатоксина в введенном объеме стандарта; ст
h — высота пика стандарта афлатоксина в мм; ст
h — высота пика афлатоксина в введенном объеме экстракта в мм;
М — навеска продукта, взятая в г.
При приведенных в скобках объемах и навесках формула содержания афлатоксинов выражается следующим образом:
h
C = 2,5 x --- x m . h ст
ст
Если пик афлатоксина выходит за пределы шкалы самописца, анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно, уменьшая объем вводимого раствора экстракта (V ) или разбавляя раствор экстракта
6
хлороформом (увеличивая объем V ). При необходимости подтверждения 5 проводят совместный ввод экстракта со стандартом афлатоксинов.
1.5. Подтверждение наличия афлатоксинов с помощью двумерной ТСХ
Для подтверждения наличия афлатоксинов пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев наносят 20 мкл раствора А, в правом
верхнем углу наносят 5 мкл рабочего раствора смеси афлатоксинов. В
левом нижнем углу на расстоянии 1, 2 и 3 см от левого края и 1,5 *см* от нижнего края пластинки наносят 2, 5 и 10 мкл рабочего раствора смеси афлатоксинов. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир-метанол-вода (94:4,5:1,5) и развивают пластинку в 1-ом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 минут, затем развитие пластинки проводят во втором направлении в системе хлороформ-ацетон-вода (90:10:1). После достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии ее извлекают из камеры и сушат на воздухе. Рассматривают пластинку в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и цвету флуоресценции пятнам стандартов афлатоксинов, свидетельствует о возможном присутствии афлатоксинов в пищевом продукте. Для подтверждения наличия
афлатоксинов ТСХ-пластинку опрыскивают раствором азотной кислоты в воде (1:2) и рассматривают ее в длинноволновом УФ-свете. Если цвет
флуоресценции стандартов афлатоксинов изменился с синего (B , B )
1 2
или сине-зеленого (G , G ) на желтый цвет, а цвет флуоресценции
1 2
пятен экстракта на желтый не изменился, то афлатоксины в пробе
отсутствуют. Если же цвет флуоресценции пятен экстракта также
изменился на желтый, то это служит подтверждением возможного
наличия афлатоксинов в пищевом продукте.
2. <a id="p100071"></a>Определение афлатоксинов B , B , G и G в маслах
1 2 1 2
2.1. Экстракция
К 15 г масла добавляют 25 мл гексана, 5 мл 4-процентного раствора хлорида натрия и 100 мл ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 40 — 50 минут. Затем смесь помещают в делительную воронку и отделяют нижний ацетонитрильный слой.
2.2. Очистка экстракта
Ацетонитрильный экстракт обезжиривают в делительной воронке гексаном (3 x 50 мл), высушивают сульфатом натрия и упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 мл хлороформа и проводят очистку с помощью колоночной хроматографии. На колонку с 4 г силикагеля (п. 1.2) наносят хлороформный экстракт, дают хлороформу стечь и промывают 100 мл смеси гексан-бензол-эфир (1:1:2). Афлатоксины элюируют 100 мл смеси хлороформ-ацетон (9:1). Элюат упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 мл хлороформа, фильтруют через бумажный или капроновый фильтр, отдувают растворитель в токе азота, растворяют в 400 мкл хлороформа и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (п. 1.4).
Расчет концентрации афлатоксина проводят по формуле:
V x h x m
1 ст
V x h x M
2 ст
где:
C — концентрация афлатоксина в масле;
V — объем очищенного раствора экстракта в хлороформе перед 1 ВЭЖХ (200 мкл);
V — объем раствора экстракта, вводимого в петлю инжектора 2 хроматографа (20 мкл);
m — количество нг афлатоксина во введенном объеме стандарта; ст
h — высота пика стандарта афлатоксина в мм; ст
h — высота пика афлатоксина во введенном объеме экстракта в мм;
М — навеска продукта, взятая в г.
Подтверждение наличия афлатоксина с помощью двумерной ТСХ проводят аналогично п. 1.5.
3. <a id="p100086"></a>Определение афлатоксина M в молоке
1
3.1. Экстракция
В коническую колбу на 250 мл помещают 50 мл натурального молока или раствор 5 г сухого молока в 50 мл воды, 10 мл водного раствора 2 г хлорида натрия и 0,24 г лимонной кислоты, 120 мл хлороформа (все составные части предварительно подогревают до температуры 35 - 38°. Содержимое колбы встряхивают 2 - 3 минуты, переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют 15 минут при
3000 — 4000 об./мин. Отделяют нижний хлороформный слой, высушивают над 10 г безводного сульфата натрия, отфильтровывают, замеряют объем фильтрата (V ) и упаривают до 5 мл. 2
Очистку проводят с помощью колоночной хроматографии. На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, затем безводный сульфат натрия (толщина слоя 5 мм), заливают суспензию 2 г (2 мл) силикагеля в гексане и сверху насыпают слой безводного сульфата натрия. Дают гексану стечь так, чтобы над слоем сульфата натрия
осталось около 5 мл гексана. Вносят 5 мл анализируемого экстракта,
дают растворителю стечь и затем колонку последовательно промывают 25 мл смеси толуол-уксусная кислота (9,5:0,5), 25 мл гексана и 25 мл смеси эфир-гексан-ацетонитрил (5:3:1). Афлатоксин M элюируют с
1
колонки 60 мл смеси хлороформ-ацетон (4:1). Элюат упаривают досуха, растворяют в 200 мкл хлороформа и анализируют с помощью
высокоэффективной хроматографии.
3.2 Приготовление стандартного раствора
афлатоксина M
1
Навеску кристаллического афлатоксина M в 1 мг помещают в 1
мерную на 100 мл колбу и доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил (9:1). Концентрация афлатоксина M в
1
приготовленном стандартном растворе составляет 10 нг/мкл. Для приготовления стандартного раствора афлатоксина M с концентрацией
1
0,2 нг/мкл в мерную колбу на 50 мл помещают 1 мл стандартного раствора афлатоксина M и доводят до метки смесью
1
бензол-ацетонитрил (9:1).
3.3 Обнаружение и количественное определение
афлатоксина M с помощью ВЭЖХ
1
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза эфир-метанол-вода (90:8:2), остальные параметры как в п. 1.4. Чувствительность детектора устанавливается таким образом, чтобы 0,6 — 0,8 нг афлатоксина M 1
соответствовало отклонение пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы. Для калибровки
флуоресцентного детектора в инжектор вводится 1, 2, 3 мкл рабочего афлатоксина M , что соответствует 0,2; 0,4; 0,6 нг афлатоксина M .
1 1 Для каждого количества афлатоксинов определяют высоту пика. В приведенных выше условиях ВЭЖХ время удерживания афлатоксина M
1
8 — 9 минут.
В инжектор хроматографа вводится с помощью микрошприца 20 мкл раствора очищенного экстракта. При наличии пика, совпадающего по времени выхода с афлатоксином M определяют его высоту (h). Расчет
1
концентрации афлатоксина M проводят по формуле: 1
V x V x h x m
1 3 ст
V x V x h x M
2 4 ст
где:
C — концентрация афлатоксина M в молоке, мкг/кг; 1
V — объем хлороформа, взятого для экстракции (120 мл); 1
V — объем хлороформного экстракта, взятого для анализа; 2
V — объем очищенного экстракта в хлороформе перед ВЭЖХ 3 (200 мкл);
V — объем раствора экстракта, вводимого в петлю инжектора 4 хроматографа (20 мкл);
m — количество нг афлатоксина M в введенном объеме ст стандарта;
h — высота пика стандарта афлатоксина в мм; ст
h — высота пика афлатоксина в введенном объеме экстракта в мм;
М — навеска продукта, взятая в г.
Если пик афлатоксина M в образце выходит за пределы шкалы 1 самописца, анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно, уменьшая объем вводимого раствора экстракта (V ) или разбавляя раствор экстракта 4 хлороформом (увеличивая объем V ). 3
3.4 Подтверждение наличия афлатоксина M
1
с помощью двумерной ТСХ
Очистка и обнаружение афлатоксина M 1
ТСХ-очистку и обнаружение афлатоксина M проводят с помощью 1 двумерной ТСХ на пластинках «Силуфол» аналогично п. 1.5. В
качестве растворителей для развития хроматограмм используют в первом направлении смесь эфир-метанол-вода (90:8:2), во втором
направлении смесь хлороформ-ацетон-изопропиловый спирт (85:10:5).
Тесты, подтверждающие наличие афлатоксина M в продукте 1
Тесты, подтверждающие наличие афлатоксина M в продукте, 1 проводят аналогично п. 1.5.