МУК 4.1.3535-18. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов в продуктах животного происхождения. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 23.03.2018)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["МУК 4.1.3535-18"]:::doc
  click n0 "https://bukva.ai/docs/muk-4-1-3535-18" "МУК 4.1.3535-18. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов в продуктах животного происхождения. Методически"
  n1["МУК 4.1.3679-20"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/muk-4-1-3679-20" "МУК 4.1.3679-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Количественное определение остаточных количеств хлорамфеникола (левомицетина) в пищевой продукции животного происхождения"
  n2["МУК 4.1.3680-20"]:::doc
  click n2 "https://bukva.ai/docs/muk-4-1-3680-20" "МУК 4.1.3680-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Количественное определение остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевой продукции животного происхо"
  n3["МУК 4.1.3681-20"]:::doc
  click n3 "https://bukva.ai/docs/muk-4-1-3681-20" "МУК 4.1.3681-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Количественное определение остаточных количеств бацитрацина в пищевой продукции животного происхождения методом конкурент"
  n0 --> n2
  n0 --> n3
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 23 марта 2018 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АНТИБИОТИКОВ И АНТИМИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3535-18

1. Методические указания разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (В.А. Тутельян, С.А. Хотимченко, С.А. Шевелева, Л.П. Минаева, Н.Р. Ефимочкина, В.В. Бессонов, А.Д. Малинкин, А.И. Алешкина, М.А. Макаренко). ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» Роспотребнадзора (Л.И. Иванова, А.Ю. Полторацкий) при участии А.В. Галкина.

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 23 марта 2018 г.

3. Введены впервые.

I. Области применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения методики для определения остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов в продуктах животного происхождения.

1.2. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, для иных организаций и учреждений, осуществляющих контроль безопасности пищевой продукции, в том числе импортируемой в Российскую Федерацию, а также для аккредитованных на проведение соответствующих исследований организаций.

1.3 Методические указания носят рекомендательный характер.

1.4. Подготовка образцов пищевых продуктов животного происхождения путем приготовления экстрактов и вытяжек для определения в них остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов и алгоритм выбора метода при проведении исследований определяется в соответствии с методическими указаниями по подготовке проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов.

II. Методы исследования

Раздел I. Определение остаточных количеств хлорамфеникола (левомицетина) в пищевой продукции животного происхождения

I.1. Определение остаточных количеств хлорамфеникола (левомицетина) в пищевой продукции животного происхождения методом иммуноферментного анализа

I.1.А. Методика количественного определения остаточных количеств хлорамфеникола (левомицетина) в пищевой продукции животного происхождения

Свидетельство об аттестации № РОСС RU.0001.310430/0042.24.04.18 от 24 апреля 2018 г.

I.1.А.1. Область применения количественного метода определения

В настоящем разделе методических указаний установлен порядок количественного определения остаточных количеств хлорамфеникола (левомицетина) методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией (при 450 нм) (далее ИФА) для пищевых продуктов животного происхождения, в том числе для молока (сухого, цельного), молочных смесей для детского питания (восстановленных, жидких), молочных продуктов (творог, йогурт (без наполнителя/с фруктами), пахты и сыворотки, сливок, кефира, сметаны, сыра), масла сливочного; мяса скота и птицы; рыбы, креветок; яиц (сырых, замороженных); меда.

Определение остаточных количеств хлорамфеникола количественным методом проводят для следующих групп продуктов животного происхождения:

1. Молоко и молочные продукты:

а) молоко, сливки (сырые, питьевые, сухие). Пределы определения хлорамфеникола (левомицетина) по стандартному веществу: молоко — 0,00003 мг/дм3; сливки — 0,00001 мг/дм3 (кг);

б) продукты переработки молока: продукты кисломолочные (йогурт, кефир, сметана, творог), сыр, масло сливочное, пахта и сыворотка. Пределы определения хлорамфеникола (левомицетина) по стандартному веществу: молочные смеси для детского питания (восстановленные, жидкие) — 0,00003 мг/кг; йогурт (без наполнителя/с фруктовыми наполнителями), кефир, пахта и сыворотка — 0,000010 мг/кг; творог, сметана — 0,00003 мг/кг; масло сливочное — 0,00016 мг/кг; сыр — 0,00003 мг/кг.

2. Мясо скота и птицы. Предел определения хлорамфеникола (левомицетина) по стандартному веществу: 0,00007 мг/кг.

3. Рыба и продукция аквакультуры:

а) рыба и креветки. Предел определения хлорамфеникола (левомицетина) по стандартному веществу: 0,00007 мг/кг.

4. Яйца (сырые, замороженные). Предел определения хлорамфеникола (левомицетина) по стандартному веществу: 0,00003 мг/кг.

5. Мед. Предел определения хлорамфеникола (левомицетина) по стандартному веществу — 0,00003 мг/кг.

I.1.А.2. Методика измерений при количественном методе определения

В основе принципа действия тест-системы лежит реакция «антиген — антитело». Лунки микротитровального планшета покрыты антителами к хлорамфениколу, которые связаны иммобилизированными антителами захвата. В лунки вносят растворы стандартов или проб и конъюгат хлорамфеникола. Свободный хлорамфеникол и конъюгированный с ферментом конкурируют за места связывания с антителами (конкурентный иммуноферментный анализ). Все несвязанные молекулы конъюгата затем удаляют на этапе отмывки. Конъюгат преобразует хромоген в окрашенные в синий продукты реакции. Внесение стоп-раствора ведет к изменению окраски от синей к желтой. Измерения выполняют фотометрически при длине волны 450 нм. Оптическая плотность обратно пропорциональна концентрации хлорамфеникола в пробе.

I.1.А.3. Метрологические характеристики количественного метода определения

Метрологические характеристики метода определения остаточных количеств хлорамфеникола в пищевых продуктах животного происхождения, проводимого в соответствии с приведенной процедурой твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией, представлены в табл. 1.1.

Таблица 1.1

Метрологические характеристики количественного определения остаточных количеств хлорамфеникола (левомицетина) в пищевых продуктах методом иммуноферментного анализа

I.1.А.4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы, реактивы и тест-системы для количественного метода определения

I.1.А.4.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками

I.1.А.4.2. Вспомогательные устройства, посуда и материалы

<1> Пересчет относительного центробежного ускорения (в единицах g) (ОЦУ/RFS) в скорость центрифугирования (об./мин) приведен в Приложении для всех разделов.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств, посуды и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

I.1.А.4.3. Реактивы

Примечание. Допускается применение других химических реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

I.1.А.4.4. Тест-система для иммуноферментного анализа

Набор для количественного определения левомицетина (хлорамфеникола) по технологии ИФА на 96 определений с внутренним стандартом ( RIDASCREEN® Chloramphenicol, арт. R1511), включающий следующие компоненты:

1. Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов с 8 отделяемыми лунками каждый), сенсибилизированных антителами «захвата», в упаковке из фольги в комплекте с влагопоглотителем.

2. Комплект стандартных растворов левомицетина со следующими концентрациями: 0, 25, 50, 100, 250, 750 нг/дм3 в воде по 1,3 см3 — 6 шт.

3. Конъюгат левомицетина с пероксидазой, готовый к употреблению, — 7,5 см3.

4. Готовая смесь субстрата с хромогеном, содержащая пероксид карбамида и тетраметилбензидин, — 10 см3.

5. Стоп-реагент, содержащий раствор 1 н серной кислоты, — 14 см3.

6. Моющий буфер в виде сухой соли для приготовления 10 мМ фосфатного буфера, pH 7,4, содержащей 0,05% твина, — 1 пакет.

Набор рассчитан на проведение анализа в 2 повторностях 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).

I.1.А.5. Требования безопасности, квалификация операторов и условия выполнения измерений при количественном методе определения

1. Исследования пищевых продуктов с использованием методики ИФА проводят с соблюдением требований техники безопасности, установленных для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007), а также в инструкции по использованию тест-систем.

2. При выполнении измерений с использованием планшетного иммуноферментного анализатора и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцию по эксплуатации прибора.

3. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области иммуноферментного анализа. К проведению анализа допускается только персонал, ознакомленный с руководством по эксплуатации планшетного анализатора.

5. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• температура окружающего воздуха: от 20 до 30 °C;
• относительная влажность воздуха: от 40 до 80%.

I.1.А.6. Подготовка к исследованию при количественном методе определения

I.1.А.6.1. Подготовка стеклянной посуды

При подготовке к проведению исследований лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

I.1.А.6.2. Подготовка оборудования

Подготовку и проверку фотометра и pH-метра проводят в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

I.1.А.6.3. Хранение и использование тест-систем и реагентов

Тест-системы для ИФА хранят при температуре 2 — 8 °C, не допуская подмораживания компонентов. Использовать набор допускается только в пределах срока годности.

I.1.А.6.4. Приготовление 10 мМ моющего буферного раствора с pH 7,4 (PBS-буфер с твином)

Для приготовления буферного раствора используют входящий в комплект набора пакет с сухой солью для PBS-буфера.

Способ 1. Растворяют содержимое целого пакетика в 1 дм3 дистиллированной воды. Готовый 10 мМ моющий буфер может храниться при температуре 2 — 8 °C в течение 4 — 6 недель.

Способ 2. Растворяют содержимое пакетика в 100 см3 дистиллированной воды, чтобы получить 10-кратный концентрат моющего буфера. Раствор может храниться около 8 — 12 недель при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Для приготовления готового к употреблению 10 мМ моющего буфера растворите одну часть 10-кратного концентрата в 9 частях дистиллированной воды. Готовый 10 мМ моющий буфер может храниться при температуре 2 — 8 °C в течение 4 — 6 недель.

I.1.А.6.5. Приготовление 20 мМ буферного раствора (PBS-буфер)

Навески натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного 1,10 г, натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного 3,22 г и натрия хлористого 8,77 г растворяют в объеме 800 — 900 см3 дистиллированной воды, доводят pH до 7,4 0,5 н раствором гидроокиси натрия, далее доводят объем раствора дистиллированной водой в мерной колбе до метки 1 000 см3, тщательно перемешивают.

I.1.А.6.6. Приготовление осадителей (Каррезы)

Осадитель 1 (Каррез I): навеску 15,21 г калия железистосинеродистого 3-водного разводят в мерной колбе объемом 100 см3 дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

Осадитель 2 (Каррез II): навеску 29,90 г сульфата цинка 7-водного разводят в мерной колбе объемом 100 см3 дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

I.1.А.6.7. Приготовление 0,5 н раствора гидроокиси натрия

Навеску 20 г гидроокиси натрия, разводят в мерной колбе объемом 1 000 см3 дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

I.1.А.6.8. Приготовление 10%-го раствора метанола

Для получения 10%-го раствора метанола отбирают 10 см3 метанола в мерную колбу объемом 100 см3 и разводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

I.1.А.6.9. Приготовление 20%-го растворов метанола

Для получения 20%-го раствора метанола отбирают 20 см3 метанола в мерную колбу объемом 100 см3 и разводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

I.1.А.7. Подготовка проб пищевых продуктов для количественного метода определения

1. Отбор проб осуществляют в соответствии МУК 4.1.3534-18 «Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов».

2. Хранение и транспортирование экстрактов, подготовленных для ИФА.

Готовые экстракты допускается хранить до начала анализа в пределах одной лаборатории при температуре от 2 до 8 °C не более 1 суток. Допускается транспортирование материала при температуре от 2 до 8 °C в течение 1 суток. Доставленные в лабораторию образцы в виде экстрактов хранению не подлежат и сразу направляются на анализ.

I.1.А.7.1. Подготовка проб молока (сырое, питьевое, сухое), молочных смесей для детского питания (сухие, жидкие)

Образцы продуктов в сухом виде предварительно восстанавливают в воде в соответствии с указанием на этикетке (нормативно-технической документации на продукт) при отсутствии информации 1,0 г сухого продукта суспендируют в 9,0 см3 дистиллированной воды. Пробы нейтрализуют с помощью 0,5 н раствора натрия гидроокиси (п. I.1.А.6.7), доводя уровень pH до 7,0 +/- 0,5.

Способ 1. Жидкий или восстановленный продукт центрифугируют в течение 5 мин при 2 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант отбирают в пустую пробирку и используют для дальнейшего анализа.

Непосредственно перед анализом подготовленную пробу перемешивают с помощью вортекса. Далее вносят по 0,05 см3 пробы в лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

Чтобы добиться наилучшей чувствительности, в качестве альтернативы может быть выполнена пробоподготовка (экстракция) согласно способам 2 и 3.

Способ 2 (экстракция). Экстракцию левомицетина (хлорамфеникола) из жидкого исследуемого образца (жидкий молочный продукт, восстановленные и жидкие молочные смеси, в том числе смеси для питания детей) проводят следующим образом.

Вносят 10 см3 образца в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, добавляют 1 см3 осадителя 1 (Карез I) (п. I.1.А.6.6) и тщательно перемешивают на вортексе. Затем добавляют 1 см3 осадителя 2 (Карез II) (п. I.1.А.6.6) и снова тщательно перемешивают на вортексе. Далее смесь центрифугируют 10 мин при 3 000 g и температуре 4 — 12 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением предварительно охладить пробы до (8 +/- 1) °C перед центрифугированием).

Супернатант 7,2 см3 переносят в чистую центрифужную пробирку на 15 см3, добавляют 6 см3 этилацетата и экстрагируют встряхиванием в течение 10 мин. Затем смесь центрифугируют при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 10 минут при 3 000 g.

Этилацетатный супернатант 4 см3 переносят в новую чистую пробирку и испаряют экстракт досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Если после сушки пробы на дне пробирки обнаруживается жирный остаток, то проводят процедуру обезжиривания, как описано в Примечании 1. После чего сухой остаток растворяют как описано ниже.

Если жирного остатка не наблюдается, то растворяют сухой остаток в 0,4 см3 10 мМ моющего буфера (п. I.1.А.6.4) и тщательно перемешивают на вортексе.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см3 экстракта + 3,2 см3 моющего буфера).

Примечание 1. Для обезжиривания сухого остатка к сухому остатку приливают 0,4 см3 н-гексана и перемешивают на вортексе, далее приливают 0,4 см3 моющего буфера и повторно перемешивают на вортексе. Смесь центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). Нижнюю водную фазу отбирают в чистую пробирку и далее используют в соответствии с последующей процедурой. При этом фактор разведения пробы не меняется.

Примечание 2. При проведении пробоподготовки с использованием этилацетата и гексана для исключения ложноположительных результатов необходимо использовать отрицательный контроль. В качестве отрицательного контроля вместо пробы вносят соответствующий объем дистиллированной воды и проводят все процедуры экстракции, как с исследуемым образцом, с последующим внесением в лунку планшета. При расчете конечного результата полученные значения вычитают из значений исследованного образца (для расчета используют тот же фактор разбавления).

Способ 3 (экстракция). Экстракцию левомицетина (хлорамфеникола) непосредственно из сухого молочного продукта, сухой молочной смеси, в том числе смеси для питания детей, проводят следующим образом.

Растворяют 2 г сухого молока в 10 см3 дистиллированной воды в центрифужной пробирке вместимостью 15 см3. Добавляют 0,5 см3 осадителя 1 (Карез I) (п. I.1.А.6.6) и тщательно перемешивают на вортексе. Затем добавляют 0,5 см3 осадителя 2 (Карез II) (п. I.1.А.6.6) и снова интенсивно перемешивают на вортексе. Далее смесь центрифугируют 10 мин при 3 000 g при температуре 4 — 12 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением предварительно охладить пробы до (8 +/- 1) °C перед центрифугированием).

Супернатант 3,6 см3 (соответствует 0,6 г сухого молока/смеси) переносят в чистую центрифужную пробирку на 15 см3, добавляют 6 см3 этилацетата и экстрагируют встряхиванием в течение 10 мин. Затем смесь центрифугируют при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 10 минут при 3 000 g.

Этилацетатный супернатант 4 см3 переносят в новую чистую пробирку и испаряют экстракт досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Если после сушки пробы на дне пробирки обнаруживается жирный остаток, то проводят процедуру обезжиривания, как описано в Примечании 1. После чего сухой остаток растворяют как описано ниже.

Если жирного остатка не наблюдается, то растворяют сухой остаток в 0,4 см3 10 мМ моющего буфера (п. I.1.А.6.4) и тщательно перемешивают на вортексе.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см3 экстракта + 3,2 см3 моющего буфера).

I.1.А.7.2. Подготовка проб молочных продуктов

I.1.А.7.2.1. Йогурт (без наполнителя/с фруктами), кефир, пахта и сыворотка, сливки

Пробы нейтрализуют с помощью 0,5 н раствора натрия гидроокиси (п. I.1.А.6.7), доводя значение pH до 7,0 +/- 0,5. При исследовании продукта с фруктами отбрасывать частицы твердой консистенции, отбирать жидкую фракцию. Экстракцию левомицетина (хлорамфеникола) из исследуемого образца проводят следующим образом.

Навеску 10,0 г пробы вносят в колбу вместимостью 100 см3 с плотно закрывающейся пробкой, приливают 8,0 см3 20 мМ буфера (п. I.1.А.6.5) и перемешивают. Далее добавляют 1 см3 осадителя 1 (Карез I) (п. I.1.А.6.6) и тщательно перемешивают на вортексе. После чего вносят 1 см3 осадителя 2 (Карез II) (п. I.1.А.6.6) и перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Готовую смесь переносят в центрифужные пробирки объемом 15 см3 и центрифугируют 10 мин при 4 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Супернатант 4 см3 переносят в новую пробирку, приливают 8 см3 этилацетата и встряхивают, перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом). После чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Супернатант 4 см3 переносят в новую пробирку и испаряют при 60 °C досуха в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Если после сушки пробы на дне пробирки обнаруживается жирный остаток, то проводят процедуру обезжиривания, как описано в Примечании 1. После чего сухой остаток растворяют как описано ниже.

Если жирного остатка не наблюдается, то растворяют сухой остаток в 1 см3 моющего буфера (п. I.1.А.6.4).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 0,5.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см3 экстракта + 3,2 см3 моющего буфера).

I.1.А.7.2.2. Творог, сметана

Экстракцию левомицетина (хлорамфеникола) из исследуемого образца проводят следующим образом.

Навеску 5,0 г пробы вносят в центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, прибавляют 15 см3 10%-го раствора метанола (п. I.1.А.6.8) и интенсивно перемешивают на вортексе в течение 1 мин. Допускается распределение пробы в двух центрифужных пробирках объемом 15 см3 при сохранении пропорций количества пробы и объема раствора метанола и с последующим объединением экстрактов. Далее смесь центрифугируют 15 мин при 4 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Из пробирок удаляют образовавшийся верхний слой жира с помощью шпателя или стеклянной палочки, из обезжиренной средней части переносят 4 см3 пробы в новую стеклянную пробирку (если проба была распределена на 2 пробирки, то далее используют объединенную пробу по 2 см3 из каждой пробирки).

К супернатанту прибавляют 8 см3 этилацетата, перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом). После чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Супернатант 4 см3 переносят в новую пробирку и испаряют при 60 °C досуха в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Если после сушки пробы на дне пробирки обнаруживается жирный остаток, то проводят процедуру обезжиривания, как описано в Примечании 1. После чего сухой остаток растворяют как описано ниже.

Если жирного остатка не наблюдается, то растворяют сухой остаток в 0,5 см3 моющего буфера (п. I.1.А.6.4).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см3 экстракта + 3,2 см3 моющего буфера).

I.1.А.7.2.3. Масло сливочное

Экстракцию левомицетина (хлорамфеникола) из исследуемого образца проводят следующим образом.

Навеску 2,0 г масла вносят в центрифужную пробирку объемом 15 см3, расплавляют масло на водяной бане при температуре примерно (40 +/- 1) °C. Прибавляют 2 см3 н-гексана и перемешивают интенсивно на вортексе в течение 10 — 15 с. После этого прибавляют 1 см3 20%-го раствора метанола (п. I.1.А.6.9) и повторно интенсивно перемешивают на вортексе в течение 10 — 15 с, затем перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом). Центрифугируют 10 мин при 2 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Нижнюю водную фазу 0,7 см3 переносят в пробирку типа эппендорф на 1,5 — 2 см3 и помещают на лед на 10 мин. После чего центрифугируют 5 мин при 20 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). Отбирают нижнюю водную фазу в пустую пробирку.

Нижнюю водную фазу разбавляют моющим буфером (п. I.1.А.6.4) в соотношении 1 : 4,5 (например: 0,2 см3 нижней фазы + 0,7 см3 моющего буфера).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 5,2.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например 0,1 см3 экстракта + 3,2 см3 моющего буфера).

I.1.А.7.2.4. Сыр

Экстракцию левомицетина (хлорамфеникола) из исследуемого образца проводят следующим образом.

С поверхности образца сыра удаляют плесневый налет (при наличии). Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску сыра 10 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 и добавляют 30 см3 10%-го раствора метанола, тщательно перемешивают и инкубируют на водяной бане при (40 +/- 1) °C в течение 10 мин, встряхивая интенсивно минимум 3 раза во время инкубации. После чего центрифугируют 15 мин при 4 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Нижнюю водную фазу 3,5 см3 переносят в новую центрифужную пробирку, приливают 7 см3 этилацетата и перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом). После чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Супернатант 3,5 см3 переносят в чистую пробирку и испаряют экстракт досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Если после сушки пробы на дне пробирки обнаруживается жирный остаток, то проводят процедуру обезжиривания, как описано в Примечании 1. После чего сухой остаток растворяют как описано ниже.

Если жирного остатка не наблюдается, то растворяют сухой остаток в 0,5 см3 моющего буфера (п. I.1.А.6.4).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см3 экстракта + 3,2 см3 моющего буфера).

I.1.А.7.3. Подготовка проб мяса скота и птицы, рыбы, креветок

Экстракцию левомицетина (хлорамфеникола) из исследуемого образца проводят следующим образом.

Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску гомогенизированной пробы 3 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, прибавляют 3 см3 дистиллированной воды, 6 см3 этилацетата и перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом). После чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Супернатант 4 см3 переносят в чистую пробирку и испаряют экстракт досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Сухой остаток растворяют в 1 см3 н-гексана, прибавляют 0,5 см3 моющего буфера (п. I.1.А.6.4) и тщательно перемешивают на вортексе. Центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). Нижнюю водную фазу отбирают в чистую пробирку.

Нижнюю водную фазу разбавляют моющим буфером (п. I.1.А.6.4) в соотношении 1 : 10 (например: 0,05 см3 нижней фазы + 0,45 см3 моющего буфера).

Для анализа вносят по 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 2,5.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см3 экстракта + 3,2 см3 моющего буфера).

I.1.А.7.4. Подготовка проб яиц (сырые, замороженные)

Экстракцию левомицетина (хлорамфеникола) из исследуемого образца проводят следующим образом. Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску 2 г гомогенизированной пробы вносят в центрифужную пробирку объемом 15 см3, добавляют 8 см3 этилацетата и интенсивно встряхивают в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом), после чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Супернатант 4 см3 (соответствует 1 г пробы) переносят в чистую пробирку и испаряют экстракт досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Сухой остаток растворяют в 1 см3 н-гексана, прибавляют 1 см3 моющего буфера (п. I.1.А.6.4) и тщательно перемешивают на вортексе 1 мин. Центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). Нижнюю водную фазу отбирают в чистую пробирку.

Для анализа используют 0,05 см3 нижней водной фазы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см3 экстракта + 3,2 см3 моющего буфера).

I.1.А.7.5. Подготовка проб меда

Экстракцию левомицетина (хлорамфеникола) из исследуемого образца проводят следующим образом.

Навеску 2 г меда вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, прибавляют 4 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают встряхиванием до полного растворения меда, затем добавляют 4 см3 этилацетата и экстрагируют встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом), после чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Супернатант 1 см3 переносят в пустую пробирку и испаряют досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Сухой остаток растворяют в 0,5 см3 моющего буфера (п. I.1.А.6.4) и тщательно перемешивают на вортексе.

Для анализа используют 0,05 см3 нижней водной фазы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

При необходимости для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 33 раза (например, 0,1 см3 экстракта + 3,2 см3 моющего буфера).

I.1.А.8. Проведение исследований при количественном методе определения

I.1.А.8.1. Общие положения

1. Раствор субстрата/хромогена светочувствителен, поэтому необходимо избегать попадания на него прямого света. При появлении окрашивания раствора субстрата/хромогена в голубоватый цвет реагент к работе непригоден.

2. Не допускается заменять реагенты в составе одного комплекта реагентами из другого комплекта с другим номером партии. Не допускается перекрестное использование реагентов из комплектов с разными номерами партий.

I.1.А.8.2. Подготовка тест-системы к исследованиям

1. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов (8 микролунок скрепленных в одну полоску). Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить в холодильник при температуре 2 — 8 °C.

2. Перед использованием тест-системы доводят температуру всех реагентов до комнатной (20 — 25 °C) в течение 0,5 — 1 ч. Если в концентратах буфера и конъюгата образовались кристаллы, нужно растворить их путем встряхивания при комнатной температуре перед разведением этих реагентов.

3. Перед непосредственным использованием встряхивают каждый флакон с реагентами.

4. После использования реагенты тест-системы сразу убирают в холодильник.

5. На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

6. Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники автоматических дозаторов. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.

7. Каждый исследуемый раствор экстрактов испытуемых проб и градуировочных растворов анализируют в двух повторностях.

I.1.А.8.3. Алгоритм проведения исследования

Анализ проводят поэтапно:

1. В рамку планшета вставляют необходимое количество микролунок, достаточное для всех растворов стандартов и растворов исследуемых проб при анализе в двух повторностях каждый. Записывают положения лунок со стандартами и исследуемыми растворами на бланке планшета.

2. Добавляют в выбранные пары лунок по 0,05 см3 каждой концентрации раствора стандарта, раствора подготовленной пробы продукта.

3. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 см3 конъюгата. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 1 часа в темном месте.

4. По окончании инкубации выливают жидкость из лунок, переворачивая рамку планшета, и тщательно выбивают капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного интенсивного постукивания рамки с лунками по столу (максимально выбивая капли из лунок), накрытому фильтровальной бумагой.

5. Заполняют лунки буфером для промывки (PBS-буфер), приготовленным по п. I.1.А.6.4, внося по 0,25 см3 в каждую лунку, используя восьмиканальный дозатор. После контакта выливают буфер для промывки из лунок и тщательно выбивают капельки жидкости. Процедура отмывки повторяется трижды.

Примечание. Необходимо следовать рекомендованной процедуре промывки и не допускать высыхания микролунок в процессе выполнения анализа.

6. После отмывания добавляют по 0,1 см3 смеси субстрата/хромогена в каждую лунку. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 15 минут в темном месте.

7. По окончании инкубации добавляют в каждую лунку по 0,1 см3 стоп-реагента. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой.

8. Далее измеряют оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм с помощью микропланшетного иммуноферментного анализатора, время от внесения стоп-реагента до измерения не должно превышать 30 минут.

I.1.А.9. Учет и обработка результатов при количественном методе определения

I.1.А.9.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности содержимого лунок на планшетном фотометре (микропланшетном иммуноферментном анализаторе) при длине волны 450 нм. Оптическая плотность каждой лунки сравнивается с нулевым стандартом, значение которого принимается за 100%.

Величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, ниже 0,6 (A450нм < 0,6) является признаком порчи реагентов. Окрашивание красноватого раствора субстрата/хромогена в голубой цвет перед постановкой анализа также является признаком порчи реагентов. Результаты анализа в таком случае не учитываются.

I.1.А.9.2. Для обработки результатов иммуноферментного анализа с помощью тест-систем RIDASCREEN^{®} имеется специальное программное обеспечение, рекомендованное изготовителем тест-системы. Пример стандартной калибровочной кривой дан в сертификате обеспечения качества на тест-систему.

Программное обеспечение выполняет построение градуировочной зависимости относительной оптической плотности B/B0 от натурального логарифма концентрации антибиотика:

B/B0 = a + b·lnX, где (1)

B — оптическая плотность раствора антибиотика;

B0 — оптическая плотность 1-го градуировочного раствора с концентрацией антибиотика 0,00 нг/дм3;

X — концентрация антибиотика в растворе, нг/дм3.

Расчет коэффициентов линейной регрессии a и b проводится с помощью метода наименьших квадратов на основании пар значений B/B0, lnCi, полученных для пяти градуировочных растворов, где (i = 2...6), Ci — концентрация i-го градуировочного раствора, Bi — среднее значение оптической плотности, рассчитанное по двум значениям оптической плотности параллельных измерений i-го градуировочного раствора.

Массовая концентрация антибиотика в пробе рассчитывается на основании результатов измерений оптической плотности раствора подготовленной пробы, коэффициентов линейной регрессии и фактора разбавления по формуле:

X = F \cdot exp(\frac{\frac{B_{x}}{B_{0}} - a}{b}), где (2)

X — концентрация антибиотика в пробе, нг/кг (нг/дм3);

Bx — оптическая плотность, полученная при измерении раствора пробы;

F — фактор разбавления пробы.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции r2 > 0,98.

I.1.А.9.3. Обработку результатов анализа без программного обеспечения проводят следующим образом.

Измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами образцов.

Вычисляют средние значения оптической плотности стандартных и исследуемых растворов, полученных по 2 параллельным микролункам в результате двух параллельных определений.

Относительную оптическую плотность (A) вычисляют по формуле:

A = \frac{B_{i}}{B_{0}} \times 100 , где (3)

A — значение относительной оптической плотности, выраженное в процентах от оптической плотности нулевого стандарта, % поглощения;

Bi — среднее значение оптической плотности стандартных растворов левомицетина (хлорамфеникола) (или исследуемых растворов продуктов);

B0 — среднее значение оптической плотности нулевого стандарта.

I.1.А.9.4. По величинам значений относительной оптической плотности, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим им значениям концентрации левомицетина (хлорамфеникола) в нг/дм3 строят калибровочную кривую (градуировочный график) в полулогарифмической системе координат.

I.1.А.9.5. Концентрацию хлорамфеникола (x) в нг/дм3 считывают по калибровочной кривой соответственно значениям оптической плотности, которые вычислены по формуле (3).

I.1.А.9.6. Массовую концентрацию (содержание) левомицетина (хлорамфеникола) в испытуемой пробе (X) рассчитывают по формуле:

X = \frac{F \cdot x}{\text{К}} , где (4)

X — массовая концентрация хлорамфеникола в испытуемой пробе, мг/кг (мг/дм3 — для жидких продуктов);

x — массовая концентрация хлорамфеникола в экстракте испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, нг/дм3;

F — фактор разбавления испытуемой пробы, приведенный в табл. 1.2;

К — коэффициент пересчета нг/дм3 в мг/кг (мг/дм3 — для жидких проб), равный 1 000 000.

Таблица 1.2

Факторы разбавления для расчета содержания левомицетина (хлорамфеникола) в различных пробах

I.1.А.10. Проверка приемлемости результатов параллельных определений при количественном методе определения

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (табл. 1.1), при этом r = 2,8\sigma_{r} .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

I.1.А.11. Оформление результатов определений при количественном методе определения

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \delta \frac{X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание левомицетина (хлорамфеникола) в молоке < 0,00003 мг/кг».

I.1.А.12. Контроль точности результатов измерения при количественном методе определения

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости) и воспроизводимости, проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6.

I.1.Б. Методика полуколичественного определения остаточных количеств хлорамфеникола (левомицетина) в пищевой продукции животного происхождения

I.1.Б.1. Область применения полуколичественного метода определения

В настоящем разделе методических указаний установлен порядок полуколичественного определения остаточных количеств хлорамфеникола (левомицетина) методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией результатов (при 450 нм) (далее — ИФА) для следующих групп пищевых продуктов животного происхождения:

1. Молоко и молочные продукты

а) молоко, сливки (сгущенные, концентрированные), а также молокосодержащие. Пределы определения хлорамфеникола (левомицетина) (по стандартному веществу), мг/кг: молоко сгущенное, концентрированное — 0,00003, сливки сгущенные — 0,00001;

б) продукты переработки молока: продукты кисломолочные и сквашенные (с фруктовыми наполнителями/без наполнителей) жидкие, молочные напитки, а также молокосодержащие, в том числе для детского питания, молочные смеси (сухие, жидкие). Пределы определения хлорамфеникола (левомицетина) (по стандартному веществу) мг/кг (мг/дм3 — для жидких продуктов): молочные смеси (жидкие) — 0,00003; сухие молочные смеси (восстановление), сухие молочные смеси (экстракция) — 0,00003; продукты кисломолочные и сквашенные (с фруктовыми наполнителями/без наполнителей) жидкие — 0,00001; продукты творожные (с фруктовыми наполнителями/без наполнителей) на основе творога, в том числе молокосодержащие — 0,00003; молочные напитки на основе сыворотки — 0,00001; молокосодержащие продукты сырные, сметанные продукты, продукты молокосодержащие сметанные — 0,00003;

в) молокосодержащие продукты (спреды сливочно-растительные). Предел определения хлорамфеникола (левомицетина) (по стандартному веществу) — 0,00016 мг/кг.

2. Мясо и мясопродукты, в том числе птичьи

а) субпродукты скота и птицы. Предел определения хлорамфеникола (левомицетина) (по стандартному веществу) — примерно 0,00007 мг/кг;

б) продукты из мяса и субпродуктов, в том числе птичьих, с содержанием мясных ингредиентов более 50% (колбасные изделия, консервы мясные, в том числе для детского питания). Пределы определения хлорамфеникола (левомицетина) (по стандартному веществу): колбасные изделия, консервы мясные — 0,00007 мг/кг.

3. Рыба и рыбная продукция, продукция аквакультуры

Переработанная продукция из рыбы и аквакультуры (консервы натуральные и с добавлением масла, молочных и яичных компонентов, в том числе для детского питания (с содержанием рыбных ингредиентов более 50%). Предел определения хлорамфеникола (левомицетина) (по стандартному веществу) — 0,00015 мг/кг.

4. Яйцепродукты

Яичные продукты сухие (яичный порошок, меланж, сухой яичный белок). Предел определения хлорамфеникола (левомицетина) (по стандартному веществу) — 0,00030 мг/кг (в сухом продукте).

5. Масложировая продукция (спреды растительно-сливочные). Предел определения хлорамфеникола (левомицетина) (по стандартному веществу) — 0,00016 мг/кг.

6. Маточное молочко пчел. Предел обнаружения хлорамфеникола (левомицетина) (по стандартному веществу) — 0,00002 мг/кг.

7. Биологически активные добавки к пище на основе переработки животного сырья, не включающие в рецептуру веществ и соединений с антимикробными свойствами (солей йода, лизоцим и т.п.) (с содержанием ингредиентов животного происхождения более 90%). Пределы определения хлорамфеникола (левомицетина) (по стандартному веществу), мг/кг:

а) БАД к пище на молочной основе (сухие) — 0,00027 (в пересчете на сухой продукт);

б) БАД к пище на основе мясного, рыбного сырья и аквакультуры — 0,00035 (в пересчете на сухой продукт).

I.1.Б.2. Методика измерений при полуколичественном методе определения

Тот же, что и для количественного метода определения (п. I.1.А.2).

I.1.Б.3. Пределы полуколичественного метода определения

Таблица 1.3

Пределы определения остаточных количеств хлорамфеникола (левомицетина) в пищевых продуктах полуколичественным методом иммуноферментного анализа

I.1.Б.4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы, реактивы и тест-системы для полуколичественного метода определения

II.1.Б.4.1. Средства измерений

Те же, что и для количественного метода определения по п. I.1.А.4.1.

II.1.Б.4.2. Вспомогательные устройства, посуда, материалы

Те же, что и для количественного метода определения по п. I.1.А.4.2.

II.1.Б.4.3. Реактивы

Те же, что и для количественного метода определения по п. I.1.А.4.3.

I.1.Б.4.4. Тест-система для иммуноферментного анализа

Тест-система для непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА), укомплектованная в соответствии с Приложением I (рекомендуемое).

Примечание. Допускается использование других тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

I.1.Б.5. Требования безопасности, квалификация операторов и условия выполнения измерений при полуколичественном методе определения

Те же, что и для количественного метода определения (п. I.1.А.5).

I.1.Б.6. Подготовка к исследованию полуколичественным методом определения

Та же, что и для количественного метода определения (п. I.1.А.6).

I.1.Б.7. Подготовка проб пищевых продуктов для полуколичественного метода определения

1. Отбор проб осуществляют в соответствии МУК 4.1.3534-18 «Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов».

2. Хранение и транспортирование экстрактов, подготовленных для ИФА.

Готовые экстракты допускается хранить до начала анализа в пределах одной лаборатории при температуре от 2 до 8 °C не более 1 суток. Допускается транспортирование материала при температуре от 2 до 8 °C в течение 1 суток. Доставленные в лабораторию образцы в виде экстрактов хранению не подлежат и сразу направляются на анализ.

I.1.Б.7.1. Подготовка проб молока (сгущенного, концентрированного), молочных смесей (сухих, жидких, восстановленных)

I.1.Б.7.1.1. Подготовка проб молока (сгущенного, концентрированного)

Образцы продуктов в концентрированном виде предварительно восстанавливают в воде: 1 г сухого продукта суспендируют в 9 см3 дистиллированной воды. Пробы нейтрализуют с помощью 0,5 н раствора натрия гидроокиси (п. I.1.А.6.7), доводя уровень pH до 7,0 +/- 0,5.

Далее пробоподготовка по п. I.1.А.7.1, как для жидкого продукта (способ 1 и 2).

При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления: 1 — для жидких и восстановленных продуктов (содержание хлорамфеникола в восстановленном продукте), 10 — для сгущенных, концентрированных и сухих продуктов (содержание хлорамфеникола в исходном продукте).

I.1.Б.7.1.2. Подготовка проб молочных смесей (сухих, жидких, восстановленных)

Образцы продуктов в сухом виде предварительно восстанавливают в воде: 1 г сухого продукта суспендируют в 9 см3 дистиллированной воды или восстанавливают в соответствии с инструкцией изготовителя.

Пробы нейтрализуют с помощью 0,5 н раствора натрия гидроокиси (п. I.1.А.6.7), доводя уровень pH до 7,0 +/- 0,5.

Далее пробоподготовка по п. I.1.А.7.1 для жидких и восстановленных продуктов (Способ 2) или для сухих продуктов (Способ 3).

При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления: 1 — для жидких и восстановленных продуктов (содержание хлорамфеникола в восстановленном продукте), 10 — для сухих продуктов (содержание хлорамфеникола в исходном сухом продукте), при восстановлении в соответствии с инструкцией учитывают фактор восстановления (Кв).

I.1.Б.7.2. Подготовка проб молочных продуктов

I.1.Б.7.2.1. Продукты кисломолочные и сквашенные (с фруктовыми наполнителями/без наполнителей) жидкие, молочные напитки на основе сыворотки, сливки (сгущенные, концентрированные)

Пробоподготовку неконцентрированных продуктов проводят по п. I.1.А.7.2.1.

При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 0,5.

Образцы продуктов в концентрированном виде предварительно восстанавливают в воде: 1 г сухого продукта суспендируют в 9 см3 дистиллированной воды. Далее пробоподготовку проводят по п. I.1.А.7.2.1.

При расчете конечного результата для сгущенных и концентрированных продуктов учитывают фактор разбавления — 5.

I.1.Б.7.2.2. Продукты творожные (с фруктовыми наполнителями/без наполнителей) на основе творога и молокосодержащие; сметанные продукты и продукты сметанные молокосодержащие

Пробоподготовку проводят по п. I.1.А.7.2.2.

При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

I.1.Б.7.2.3. Спреды молочно-сливочные

Пробоподготовку проводят по п. I.1.А.7.2.3.

При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 5,2.

I.1.Б.7.2.4. Молокосодержащие продукты сырные

Пробоподготовку проводят по п. I.1.А.7.2.4.

При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

I.1.Б.7.3. Подготовка проб субпродуктов скота и птицы, продуктов из мяса и субпродуктов: колбасные изделия, консервы мясные (с содержанием мясных ингредиентов более 50%), переработанной продукции из рыбы и аквакультуры (консервы натуральные и с добавлением масла, молочных и яичных компонентов, в том числе для детского питания (с содержанием рыбных ингредиентов более 50%)

Пробоподготовку проводят по п. I.1.А.7.3.

При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 2,5.

I.1.Б.7.4. Подготовка проб яичных продуктов сухих (яичный порошок, меланж, сухой яичный белок)

Исследуемые образцы сухих яичных продуктов предварительно гомогенизируют в дистиллированной воде в соотношении 1 : 10 (1,0 г образца и 9,0 см3 дистиллированной воды). Далее пробоподготовку проводят по п. I.1.А.7.4.

При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10 (содержание хлорамфеникола в сухом продукте).

I.1.Б.7.5. Подготовка проб маточного молочка

Экстракцию левомицетина (хлорамфеникола) из исследуемого образца проводят следующим образом.

Навеску 2 г маточного молочка вносят в центрифужную пробирку, прибавляют 3 см3 0,5 н раствора натрия гидроокиси (п. I.1.А.6.7), встряхивают до полного растворения маточного молочка, после чего приливают 8 см3 этилацетата и интенсивно перемешивают на вортексе в течение 1 мин и продолжают экстракцию встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом). После чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Супернатант 2 см3 переносят в чистую пробирку и испаряют досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Сухой остаток растворяют в 0,5 см3 моющего буфера (п. I.1.А.6.4) и тщательно перемешивают на вортексе.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

Примечание. В случае необходимости при анализе содержания левомицетина (хлорамфеникола) в пределах 0,01 мг/кг для получения результатов содержания антибиотика в границах диапазона определяемого содержания вводят дополнительное разведение подготовленного экстракта пробы в 30 раз.

I.1.Б.7.6. Подготовка проб биологически активных добавок к пище на основе переработки мясо-молочного сырья, рыбного сырья и аквакультуры (с содержанием ингредиентов животного происхождения более 90%)

Методика описывает пробоподготовку для БАД к пище на основе животного сырья, не включающих в рецептуру веществ и соединений с антимикробными свойствами (солей йода, лизоцим и т.п.).

Экстракцию левомицетина (хлорамфеникола) из исследуемых образцов БАД проводят следующим образом.

Все количество представительной пробы БАД в форме таблеток, капсул, порошка, сухих форм (например, чипсы) полностью измельчают в гомогенизаторе или в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. БАД в виде сухого порошка тщательного перемешивают в блендере.

Далее готовят 10%-ю суспензию гомогенизированной пробы. Для этого 1 г навески сухого продукта разводят в 9 см3 дистиллированной воды, вновь тщательно перемешивают, встряхивают до полного растворения/суспендирования на вортексе в течение 1 мин и потом перемешивают в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Далее экстракцию подготовленной таким образом пробы, проводят:

• для БАД на основе переработки молочного сырья — по п. I.1.А.7.1, способ 1 (дополнительно учитывают коэффициент разведения 10);
• для БАД на основе переработки мясного, рыбного сырья и аквакультуры (кроме рыбьего жира), следующим образом: 6 г приготовленной суспензии вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, прибавляют 6 см3 этилацетата и перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

После чего суспензию центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). Отбирают 4 см3 супернатанта в чистую пробирку и испаряют экстракт досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Сухой остаток растворяют в 1 см3 н-гексана, прибавляют 0,5 см3 моющего буфера (п. I.1.А.6.4) и тщательно перемешивают на вортексе. Центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). В чистую пробирку отбирают нижнюю водную фазу.

Нижнюю водную фазу разбавляют моющим буфером (п. I.1.А.6.4) в соотношении 1 : 9 (например: 0,05 см3 нижней фазы + 0,45 см3 моющего буфера).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 12,5.

I.1.Б.8. Проведение исследований при полуколичественном методе определения

То же, что и для количественного метода определения (п. I.1.А.8).

I.1.Б.9. Учет и обработка результатов при полуколичественном методе определения

Тот же, что и для количественного метода определения (п. I.1.А.9).

Факторы разбавления для расчета содержания левомицетина (хлорамфеникола) в различных пробах при полуколичественном методе определения в соответствии с табл. 1.4.

Таблица 1.4

Факторы разбавления для расчета содержания левомицетина (хлорамфеникола) в различных пробах при полуколичественном методе определения

I.1.Б.10. Расчет результатов параллельных определений при полуколичественном методе определения

За результат полуколичественного анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений:

\overline{X} = \frac{X_{1} + X_{2}}{2} , где

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг.

I.1.Б.11. Оформление результатов определений при полуколичественном методе определения

Если содержание компонента выше предела определения для соответствующего вида продукта (табл. 1.3), то результат анализа представляют в виде:

«хлорамфеникол (левомицетин) в молоке обнаружен».

Если содержание компонента ниже предела определения для соответствующего вида продукта (табл. 1.3), то результат анализа представляют в виде:

«хлорамфеникол (левомицетин) в молоке не обнаружен».

I.1.Б.12. Подтверждение результата полуколичественного определения

При исследовании полуколичественным методом необходимо подтверждение полученного результата в случае обнаружения хлорамфеникола (левомицетина) на уровне и выше МДУ с использованием любого аттестованного метода (например, ВЭЖХ-МС).

Приложение I (рекомендуемое)

КОМПЛЕКТАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРАМФЕНИКОЛА

(на примере RIDASCREEN® Chloramphenicol, арт. R1511) <2>

<2> Допускается использование других тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Тест-система для количественного определения хлорамфеникола (левомицетина) по технологии ИФА на 96 определений с внутренним стандартом, включает следующие компоненты:

1. Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов с 8 отделяемыми лунками каждый), сенсибилизированных антителами «захвата», в упаковке из фольги в комплекте с влагопоглотителем.

2. Комплект стандартных растворов хлорамфеникола со следующими концентрациями: 0, 25, 50, 100, 250, 750 нг/дм3 в воде по 1,3 см3 — 6 шт.

3. Конъюгат левомицетина с пероксидазой, готовый к употреблению — 7,5 см3.

4. Готовая смесь субстрата с хромогеном, содержащая пероксид карбамида и тетраметилбензидин — 10 см3.

5. Стоп-реагент, содержащий раствор 1 н серной кислоты — 14 см3.

6. Моющий буфер в виде сухой соли для приготовления 10 мМ фосфатного буфера, pH 7,4, содержащей 0,05% твина — 1 пакет.

Набор рассчитан на проведение анализа в 2 повторностях 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).

Специфичность методики определения хлорамфеникола, установленная по перекрестной чувствительности к исследованным антибиотикам в буферной системе (на примере RIDASCREEN® Chloramphenicol, арт. R1511), представлена ниже.

Специфичность к антибиотикам для других тест-систем может отличаться от указанной выше, данная информация должна содержаться в прилагаемом описании тест-систем.

I.2. Определение хлорамфеникола (левомицетина) методами подтверждающего анализа (на основе ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС)

I.2.1. Назначение и область применения

Определение остаточного содержания хлорамфеникола проводится в молоке и молочных продуктах, яйцах и яичных продуктах, мясе, мясных продуктах и продуктах из мяса птицы, меде, рыбе и морепродуктах и в продовольственном сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием по ГОСТ Р 54904-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором».

Диапазон определяемых содержаний — 0,2 — 1 000 мкг/кг.

I.2.2. Особенности и условия применения метода ВЭЖХ-МС

Особенностью применения метода ВЭЖХ-МС в данном случае является то, что метод может обеспечить надежное определение антибиотика на уровнях, близких к уровням МДУ. Это связано с тем, что в отличие от пищевого сырья, представляющего потенциальную опасность по содержанию антибиотиков, конечная продукция содержит в большинстве случаев продукцию животноводства, рыболовства, пчеловодства, птицеводства в разбавленном виде. Практически единственным исключением является ряд молочных продуктов. В ситуации разбавления пищевого сырья — потенциального источника антибиотиков, метод определения, представленный в ГОСТ Р 54904-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» является качественным, подтверждающим присутствие антибиотика, обнаруженного методом ИФА, в пробе.

Условия применения метода по ГОСТ Р 54904-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» в качестве подтверждающего:

1. Обнаружение содержания антибиотика в пробе пищевого продукта на уровне МДУ, выше уровня МДУ и ниже уровня МДУ. При этом в расчет берется ошибка метода определения ИФА. В случае присутствия антибиотика в пробе продукта в количествах ниже МДУ, но если определенное количество в интервале ошибки метода определения равно или выше МДУ — необходимо проведение подтверждения присутствия антибиотика методом ВЭЖХ-МС.

2. Идентификация присутствия антибиотика проводится без использования внутреннего стандарта (ввиду отсутствия необходимости проведения количественного анализа).

3. Идентификация присутствия антибиотика проводится как по совпадению времени удерживания (совпадающего со временем удерживания стандарта при одинаковых условиях хроматографирования), так и по совпадению молекулярного и дочерних ионов, полученных масс-спектрометрией элюата.

4. Возможно дополнительное подтверждение присутствия антибиотика в продукте «методом добавки». Метод заключается в предварительном дополнительном внесении в пробу, в которой присутствует антибиотик, определенный методом ИФА, дополнительного количества антибиотика. При этом при хроматографировании пробы должны наблюдаться совпадения времени удерживания пиков антибиотика пробы и антибиотика добавленного, что выражается в следующем: отсутствие дополнительных вершин пиков (расщепление), отсутствие каких-либо изменений формы пиков.

Отмечаем, что проведение подтверждения «методом добавки» является дополняющим, т.е. пункт 4 только дополняет пункты 2 - 3 и проводится после выполнения идентификации по пунктам 2 - 3.

Метод по ГОСТ Р 54904-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» может быть использован для подтверждения присутствия или отсутствия левомицетина в случае внутреннего контроля содержания антибиотиков на предприятии (при входном контроле продуктов переработки животноводства, рыболовства, пчеловодства, птицеводства). При этом объектом контроля служат продукты переработки, не являющиеся продукцией, предназначенной для реализации населению.

I.2.3. Критерии оценки результатов

Критерии оценки:

1. Присутствие антибиотика в исследованной пробе считается подтвержденным, если выполнены следующие критерии:

а) обнаруженное вещество в составе образца совпадает как по времени удерживания, так и по молекулярным и дочерним ионам со сравнительными величинами, полученными при хроматографическом разделении и масс-спектрометрии стандарта антибиотика;

б) соотношение сигнал/шум полученного пика определяемого антибиотика в хроматограмме составляет 3 и более.

2. Отсутствие антибиотика в исследуемой пробе считается подтвержденным в случае невыполнения критериев а), б).

Возможна дополнительная идентификация «методом добавки».

I.2.4. Сведения о метрологической аттестации используемого метода

Данные о метрологической аттестации метода по ГОСТ Р 54904-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором»:

• Номер в реестре сведений об аттестованных методиках (методах) измерений ФР.1.31.2011.09610.
• Свидетельство № 01.00225/205-8-11 от 10.02.2011.

Раздел II. Определение остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевой продукции животного происхождения

II.1. Определение остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевой продукции животного происхождения методом иммуноферментного анализа

II.1.А. Методика количественного определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевой продукции животного происхождения

Свидетельство об аттестации № РОСС RU.0001.310430/0040.24.04.18 от 24 апреля 2018 г.

II.1.А.1. Область применения количественного метода определения

В настоящем разделе методических указаний установлен порядок количественного определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией (при 450 нм) (далее — ИФА) для пищевых продуктов животного происхождения, в том числе для молока и сливок (сырых, питьевых, сухих), молочных смесей для детского питания (сухих, восстановленных, жидких), кисломолочных продуктов (сметана, творог, йогурт (без наполнителя/с фруктовыми наполнителями, кефир), сыра, масла сливочного; мяса скота и птицы; мясо- и птицепродуктов (колбасные изделия, консервы мясные для детского питания); рыбы, креветок; яиц (сырых, замороженных); меда.

Определение остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы количественным методом проводят для следующих групп продуктов животного происхождения:

1. Молоко и молочные продукты

а) молоко, сливки (сырые, питьевые, сухие). Пределы определения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу): молоко и сливки — 0,001 мг/кг;

б) продукты переработки молока: кисломолочные продукты (сметана, творог, йогурт (без наполнителя/с фруктовыми наполнителями, кефир, сметана) сыр, масло сливочное. Пределы определения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу): кисломолочные продукты (творог, йогурт (без наполнителя/с фруктовыми наполнителями), кефир, сметана — 0,001 мг/кг; масло сливочное — 0,003 мг/кг; сыр — 0,002 мг/кг; молочные смеси для детского питания (сухие, восстановленные, жидкие) — 0,005 мг/кг.

2. Мясо скота и птицы, мясо- и птицепродукты, в том числе птицы

а) мясо скота и птицы. Пределы определения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу) — 0,002 мг/кг;

б) мясо- и птицепродукты (колбасные изделия, консервы мясные для детского питания). Пределы определения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу) (колбасные изделия, консервы мясные для детского питания) — 0,005 мг/кг.

3. Рыба, продукция аквакультуры

а) рыба, креветки. Пределы определения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу): рыба сырая — 0,002 мг/кг, креветки — 0,001 мг/кг.

4. Яйца и яйцепродукты

а) яйца (сырые, замороженные). Пределы определения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу) — 0,004 мг/кг.

5. Мед

Пределы определения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу) — 0,004 мг/кг.

II.1.А.2. Методика измерений при количественном методе определения

В основе принципа действия тест-системы лежит реакция «антиген — антитело». Лунки микротитровального планшета покрыты конъюгатом тетрациклина с белком. Вносят стандартные растворы тетрациклина или растворы проб, а потом добавляют антитела к тетрациклину. Свободный тетрациклин и иммобилизированный на поверхности тетрациклин конкурируют за места связывания антител (конкурентный иммуноферментный анализ). Все несвязанные антитела удаляются на этапе отмывки, затем добавляются вторичные, меченые ферментом антитела, специфичные к антителам против тетрациклина. После удаления несвязанных, меченых ферментом антител на этапе отмывки вносят в лунки субстрат/хромоген и проводят выдержку. Связанные молекулы конъюгата превращают хромоген в окрашенные в синий продукты реакции. Внесение стоп-раствора изменяет окраску от синей к желтой. Измерения выполняют фотометрически при длине волны 450 нм. Оптическая плотность обратно пропорциональна концентрации тетрациклина в пробе.

II.1.А.3. Метрологические характеристики количественного метода определения

Метрологические характеристики метода определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевых продуктах, проводимого в полном соответствии с приведенной процедурой твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа, представлены в табл. 2.1.

Таблица 2.1

Метрологические характеристики количественного определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевых продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа

II.1.А.4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы, реактивы и тест-системы для количественного метода определения

II.1.А.4.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

II.1.А.4.2. Вспомогательные устройства, посуда и материалы

<3> Пересчет относительного центробежного ускорения (в единицах g) (ОЦУ/RFS) в скорость центрифугирования (об./мин) приведен в Приложении для всех разделов.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств, посуды и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

II.1.А.4.3. Реактивы

Примечание. Допускается применение других химических реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

II.1.А.4.4. Тест-система для иммуноферментного анализа

Набор для количественного определения антибиотиков тетрациклиновой группы по технологии ИФА на 96 определений с внутренним стандартом ( RIDASCREEN® Tetracyclin, арт. R3505), включающий следующие компоненты:

1. Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов с 8 отделяемыми лунками каждый), сенсибилизированных антителами «захвата», в упаковке из фольги в комплекте с влагопоглотителем.

2. Комплект стандартных концентрированных растворов тетрациклина со следующими концентрациями: 0; 0,5; 1,5; 3,0; 6,0; 18,0 мкг/дм3 в воде по 1,3 см3 — 6 шт.

3. Конъюгат — 10 см3.

4. Антитела — 6 см3.

5. Готовая смесь субстрата с хромогеном, содержит пероксид карбамида и тетраметилбензидин — 10 см3.

6. Стоп-реагент, содержит 1 н серную кислоту — 14 см3.

7. Буфер 1 для проб для разбавления стандартных растворов и образцов, используется при анализе образцов масла, меда, мяса, колбасных изделий, рыбы, креветок и яйца — 60 см3.

8. Буфер 2 для проб для разбавления стандартных растворов и образцов, используется при анализе образцов молока, в том числе сухого, сыра, молочных продуктов — 60 см3.

9. PBS-буфер в виде сухой соли для приготовления 10 мМ фосфатного буфера, pH 7,4, содержащей 0,05% твина — 1 пакет.

Набор рассчитан на проведение анализа в 2 повторностях 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).

II.1.А.5. Требования безопасности, квалификация операторов и условия выполнения измерений при количественном методе определения

1. Исследования пищевых продуктов с использованием методики ИФА проводят с соблюдением требований техники безопасности, установленных для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007), а также в инструкции по использованию тест-наборов.

2. При выполнении измерений с использованием планшетного иммуноферментного анализатора и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцию по эксплуатации прибора.

3. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области иммуноферментного анализа. К проведению анализа допускается только персонал, ознакомленный с руководством по эксплуатации планшетного иммуноферментного анализатора и освоивший данную методику.

5. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• температура окружающего воздуха: от 20 до 30 °C;
• относительная влажность воздуха: от 40 до 80%.

II.1.А.6. Подготовка к исследованию при количественном методе определения

II.1.А.6.1. Подготовка стеклянной посуды

При подготовке к проведению исследований лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

II.1.А.6.2. Подготовка оборудования

Подготовку и проверку фотометра и pH-метра проводят в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

II.1.А.6.3. Хранение и использование наборов и реагентов

Тест-системы для ИФА хранят при температуре 2 — 8 °C, не допуская подмораживания компонентов. Использовать набор допускается только в пределах срока годности.

II.1.А.6.4. Приготовление 10 мМ моющего буферного раствора с pH 7,4 (PBS-буфер)

Способ 1. Используют пакет с солью для приготовления моющего буфера, входящий в комплект набора. Растворяют содержимое целого пакетика в 1 дм3 дистиллированной воды. Готовый 10 мМ моющий буфер может храниться при температуре 2 — 8 °C в течение 4 — 6 недель.

Способ 2. Растворяют содержимое пакетика в 100 см3 дистиллированной воды, чтобы получить 10-кратный концентрат моющего буфера. Раствор может храниться около 8 — 12 недель при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Для приготовления готового к употреблению 10 мМ моющего буфера растворяют одну часть 10-кратного концентрата в 9 частях дистиллированной воды.

II.1.А.6.5. Приготовление 1 н раствора гидроокиси натрия

Для приготовления 1 н раствора гидроокиси натрия навеску 40 г гидроокиси натрия разводят в мерной колбе объемом 1 000 см3 дистиллированной водой до метки.

II.1.А.6.6. Приготовление 0,5 н раствора гидроокиси натрия

Навеску 20 г гидроокиси натрия разводят в мерной колбе объемом 1 000 см3 дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

II.1.А.6.7. Приготовление 10%-го раствора метанола

Для получения 10%-го раствора метанола отбирают 10 см3 метанола в мерную колбу объемом 100 см3 и разводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

II.1.А.6.8. Приготовление 20%-го раствора метанола

Для получения 20%-го раствора метанола отбирают 20 см3 метанола в мерную колбу объемом 100 см3 и разводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

II.1.А.6.9. Приготовление 50 мМ буферного раствора янтарной кислоты

Навеску 5,9 г янтарной кислоты растворяют в 500 см3 дистиллированной воды, устанавливают pH до 4,0 с помощью 1 н NaOH, доводят до 1 000 см3 дистиллированной водой.

II.1.А.6.10. Приготовление 20 мМ буферного раствора (PBS-буфер)

Навески натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного 1,10 г, натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного 3,22 г и натрия хлористого 8,77 г растворяют в объеме 800 — 900 см3 дистиллированной воды, доводят pH до 7,4 0,5 н раствором гидроокиси натрия, далее доводят объем раствора дистиллированной водой в мерной колбе до метки 1 000 см3, тщательно перемешивают.

II.1.А.7. Подготовка проб пищевых продуктов для количественного метода определения

1. Отбор проб осуществляют в соответствии МУК 4.1.3534-18 «Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов».

2. Хранение и транспортирование экстрактов, подготовленных для ИФА.

Готовые экстракты допускается хранить до начала анализа в пределах одной лаборатории при температуре от 2 до 8 °C не более 1 суток. Допускается транспортирование материала при температуре от 2 до 8 °C в течение 1 суток. Доставленные в лабораторию образцы в виде экстрактов хранению не подлежат и сразу направляются на анализ.

II.1.А.7.1. Подготовка проб молока (сырое, питьевое, сухое), молочных смесей для детского питания (сухие, восстановленные, жидкие)

Образцы продуктов в сухом виде предварительно восстанавливают в воде в соответствии с указанием на этикетке (нормативно-технической документации на продукт), при отсутствии информации 1 г сухого продукта суспендируют в 9 см3 дистиллированной воды. Пробы нейтрализуют с помощью 0,5 н раствора натрия гидроокиси (п. II.1.А.6.6), доводя уровень pH до 7,0 +/- 0,5.

II.1.А.7.1.1. Молоко и молочные смеси с содержанием жира <= 1,5% (жидкие, восстановленные)

Молоко и молочные продукты с содержанием жира <= 1,5% разбавляют готовым буфером 2 для проб в соотношении 1 : 10 (1 + 9) в чистой стеклянной пробирке (например, 0,05 см3 молока + 0,45 см3 буфера 2 для проб).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10, для сухих продуктов дополнительно учитывают коэффициент восстановления.

II.1.А.7.1.2. Молоко и молочные смеси с содержанием жира > 1,5% (жидкие, восстановленные)

Образец молока или молочного продукта с содержанием жира > 1,5% отбирают по 5 — 10 см3 в центрифужную пробирку объемом 15 см3, центрифугируют 10 мин при 3 000 g и температуре 4 — 8 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры 4 — 8 °C). Удаляют образовавшийся верхний слой жира с помощью шпателя или стеклянной палочки, из средней части отбирают обезжиренный продукт в пустую пробирку.

Обезжиренный продукт разбавляют готовым буфером 2 для проб в соотношении 1 : 10 (1 + 9) в чистой стеклянной пробирке (например, 0,05 см3 молока + 0,45 см3 буфера 2 для проб).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10, для сухих продуктов дополнительно учитывают коэффициент восстановления.

II.1.А.7.1.3. Молоко и молочные смеси для детского питания (сухие)

Навеску 10 г исследуемого сухого продукта разводят в 90 см3 дистиллированной воды, предварительно прогретой примерно до 60 °C, и доводят объем суспензии до 100 см3. Тщательно перемешивают встряхиванием и переворачиванием не менее 10 минут до полного растворения сухого молока. Если сухое молоко плохо растворяется, то дополнительно в течение 3 мин выдерживают суспензию в ультразвуковой бане.

Далее центрифугируют 10 мин при 3 000 g и температуре 4 — 8 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры 4 — 8 °C). Удаляют образовавшийся верхний слой жира с помощью шпателя или стеклянной палочки, из средней части отбирают обезжиренный продукт в пустую пробирку.

Обезжиренный продукт разбавляют готовым буфером 2 для проб в соотношении 1 : 10 (1 + 9) в чистой стеклянной пробирке (например, 0,05 см3 молока + 0,45 см3 буфера 2 для проб).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10, для сухих продуктов дополнительно учитывают коэффициент восстановления.

II.1.А.7.2. Подготовка проб молочных продуктов

II.1.А.7.2.1. Кисломолочные продукты (творог, йогурт (без наполнителя/с фруктовыми наполнителями), кефир, сливки, сметана

Навеску 5 г исследуемого продукта вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, инкубируют 15 минут при температуре 50 °C, например, на водяной бане, перемешивают на вортексе, пока проба не гомогенизируется полностью.

Далее центрифугируют 10 мин при 3 000 g и температуре 4 — 8 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры 4 — 8 °C). Удаляют образовавшийся верхний слой жира с помощью шпателя или стеклянной палочки, из средней части отбирают обезжиренный продукт в пустую пробирку.

Обезжиренный продукт разбавляют готовым буфером 2 для проб в соотношении 1 : 10 (1 + 9) в чистой стеклянной пробирке (например, 0,05 см3 молока + 0,45 см3 буфера 2 для проб).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10, для сухих продуктов дополнительно учитывают коэффициент восстановления.

II.1.А.7.2.2. Сливочное масло

Навеску 1 г исследуемого продукта вносят в центрифужную пробирку объемом 15 см3, расплавляют на водяной бане при температуре около 40 °C.

В пробирку с расплавленной пробой вносят 1 см3 н-гексана и интенсивно перемешивают 1 мин на вортексе, после чего добавляют 1 см3 20%-го раствора метанола (п. II.1.А.6.8), интенсивно перемешивают на вортексе не менее 10 с, а затем — встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Центрифугируют 10 мин при 2 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Из пробирки осторожно удаляют верхний гексановый слой с помощью автоматической пипетки или пипетки Пастера, приливают 1 см3 н-гексана и интенсивно перемешивают 1 мин на вортексе.

Далее центрифугируют 10 мин при 2 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Нижнюю водную фазу в количестве 1 см3 переносят в пробирку на 1,5 — 2 см3 и помещают на лед на 10 минут. После чего центрифугируют 10 мин при 20 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C) и затем нижнюю водную фазу отбирают в пустую пробирку.

Для исследования отобранную нижнюю водную фазу разбавляют в соотношении 1 : 17 (1 + 16) буфером 1 для проб (например, 0,05 см3 пробы + 0,8 см3 буфера 1 для проб) в чистой стеклянной пробирке.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 20.

Примечание. При проведении пробоподготовки с использованием н-гексана для исключения ложноположительных результатов необходимо использовать отрицательный контроль. При подготовке отрицательного контроля вместо пробы вносят соответствующий объем дистиллированной воды и проводят все процедуры экстракции как с исследуемым образцом с последующим внесением в лунку планшета. При расчете конечного результата полученные значения вычитают из значений исследованного образца (для расчета используют тот же фактор разбавления).

II.1.А.7.2.3. Сыр

С поверхности образца сыра удаляют плесневый налет (при наличии). Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску сыра 5 г вносят в емкость для гомогенизации, добавляют 20 см3 метанола 10%-го (п. II.1.А.6.8) и гомогенизируют в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Гомогенизированную пробу переносят в центрифужную пробирку на 50 см3 и встряхивают в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Далее гомогенизированную пробу центрифугируют 15 мин при 3 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C). Водную (среднюю) фазу в количестве 1 см3 переносят в пробирку на 1,5 — 2 см3.

Далее пробу центрифугируют 5 мин при 20 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C), после чего отбирают супернатант в пустую пробирку.

Для исследования полученный супернатант разбавляют в соотношении 1 : 5 (1 + 4) буфером 2 для разбавления проб (например, 0,1 см3 супернатанта + 0,4 см3 буфера 2 для разбавления проб) в чистой стеклянной пробирке.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

II.1.А.7.3. Подготовка проб мяса скота и птицы

II.1.А.7.3.1. Мясо скота и птицы

Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску гомогенизированной пробы 1 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, добавляют 9 см3 20 мМ PBS-буфера с pH 7,4 (п. II.1.А.6.10), интенсивно перемешивают 1 мин на вортексе пробу с буфером, а затем перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Гомогенизированную пробу центрифугируют 10 мин при 4 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C), отбирают 1 см3 супернатанта и переносят его в чистую пробирку.

К 1 см3 супернатанта добавляют 2 см3 н-гексана и перемешивают на вортексе не менее 10 с. Далее центрифугируют 10 мин при 4 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). Нижнюю водную фазу отбирают в пустую пробирку.

Для анализа используют 0,05 см3 нижней водной фазы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10.

II.1.А.7.3.2. Продукты из мяса (колбасные изделия; консервы мясные, в том числе для питания детей)

Навеску гомогенизированной пробы 3 г вносят в емкость для гомогенизации, добавляют 30 см3 20 мМ PBS-буфера с pH 7,4 (п. II.1.А.6.10) и гомогенизируют в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Гомогенизированную пробу равномерно распределяют в центрифужных пробирках объемом 15 см3 и центрифугируют 10 мин при 4 000 g и температуре 4 — 8 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры 4 — 8 °C). Обезжиренную среднюю фракцию отбирают в пустые пробирки.

Полученный фугат разбавляют в соотношении 1 : 2 (1 + 1) буфером 1 для проб (например, 0,5 см3 супернатанта + 0,5 см3 буфера 1 для проб) в чистой стеклянной пробирке.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 20.

II.1.А.7.4. Подготовка проб рыбы, креветок

Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску гомогенизированной пробы в количестве 1 г переносят в центрифужную пробирку объемом 15 см3 с винтовой крышкой и приливают 9 см3 20 мМ PBS-буфера с pH 7,4 (п. II.1.А.6.10), интенсивно перемешивают на вортексе, а затем экстракцию проводят встряхиванием в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g и комнатной температуре (20 — 25 °C), супернатант отбирают в пустую пробирку.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10.

Для образцов с повышенным содержанием жира (более 5%) добавляют стадию обезжиривания.

К 1 см3 супернатанта добавляют 2 см3 н-гексана и перемешивают на вортексе не менее 10 с. Далее центрифугируют 10 мин при 4 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). Нижнюю водную фазу отбирают в пустую пробирку.

Для анализа используют 0,05 см3 нижней водной фазы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10.

II.1.А.7.5. Подготовка проб яиц (сырые, замороженные)

Тщательно гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке, для анализа яйца желток и белок гомогенизировать совместно.

Навеску гомогенизированной пробы в количестве 4 г переносят в центрифужную пробирку объемом 50 см3 и приливают 20 см3 50 мМ буферного раствора янтарной кислоты (п. II.1.А.6.9). Для экстракции перемешивают пробу встряхиванием 15 мин при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Центрифугируют 15 мин при 4 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C), супернатант отбирают в пустую пробирку.

Супернатант разбавляют в соотношении 1 : 10 (1 + 9) 20 мМ PBS-буфером с pH 7,4 (п. II.1.А.6.10) (например, 0,1 см3 супернатанта + 0,9 см3 20 мМ PBS-буфера) в чистой стеклянной пробирке.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 60.

II.1.А.7.6. Подготовка проб меда

Навеску меда 1 г отбирают в стеклянный флакон с винтовой крышкой (вместимостью не менее 80 см3), разбавляют в соотношении 1 : 50 (1 + 49) 20 мМ PBS-буфером, pH 7,4 (п. II.1.А.6.10) (например, 1 г меда + 50 см3 20 мМ PBS-буфера).

Пробы меда, которые трудно растворяются, дополнительно инкубируют 5 мин в ультразвуковой бане.

Разбавленную пробу интенсивно перемешивают на вортексе не менее 2 мин.

Непосредственно перед анализом пробирки с пробами необходимо встряхнуть несколько раз вверх-вниз.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 50.

II.1.А.8. Проведение исследований при количественном методе определения

II.1.А.8.1. Общие положения

1. Раствор субстрата/хромогена светочувствителен, поэтому необходимо избегать попадания на него прямого света. При появлении окрашивания раствора субстрата/хромогена в голубоватый цвет реагент к работе непригоден.

2. Не допускается заменять реагенты в составе одного комплекта реагентами из другого комплекта с другим номером партии. Не допускается перекрестное использование реагентов из комплектов с разными номерами партий.

II.1.А.8.2. Подготовка тест-системы к исследованиям

1. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов (8 микролунок скрепленных в одну полоску). Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить в холодильник при температуре 2 — 8 °C.

2. Перед использованием тест-системы доводят температуру всех реагентов до комнатной (20 — 25 °C) в течение 0,5 — 1 ч. Если в концентратах буфера и конъюгата образовались кристаллы, нужно растворить их путем встряхивания при комнатной температуре перед разведением этих реагентов.

3. Перед непосредственным использованием встряхивают каждый флакон с реагентами.

4. После использования реагенты тест-системы сразу убирают в холодильник.

5. На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

6. Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники автоматических дозаторов. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.

7. Каждый исследуемый раствор экстрактов испытуемых проб и градуировочных растворов анализируют в двух повторностях.

II.1.А.8.3. Алгоритм проведения исследования

II.1.А.8.3.1. Стандартные растворы поставляются в виде концентратов. Чтобы получить готовые к использованию стандартные растворы, необходимо разбавить в 10 раз стандартные концентрированные растворы соответствующим буфером для проб (например, 0,05 см3 концентрированного стандарта + 0,45 см3 буфера) и тщательно перемешать. Использовать стеклянные пробирки.

Для масла, меда, мяса, колбасных изделий, рыбы, креветок и яиц использовать буфер 1 для проб при разбавлении концентратов.

Для молока и сухого молока, сыра, молочных продуктов использовать при разбавлении концентратов буфер 2 для проб.

II.1.А.8.3.2. Анализ проводят поэтапно:

1. В рамку планшета вставляют необходимое количество микролунок, достаточное для всех растворов стандартов и растворов исследуемых проб при анализе в двух повторностях каждый. Записывают положения лунок со стандартами и исследуемыми растворами на бланке планшета.

2. Добавляют в выбранные пары лунок по 0,05 см3 каждой концентрации раствора стандарта, раствора подготовленной пробы продукта.

3. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 см3 раствора антител к тетрациклину. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 1 часа в темном месте.

4. По окончании инкубации выливают жидкость из лунок, переворачивая рамку планшета, и тщательно выбивают капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного интенсивного постукивания рамки с лунками по столу (максимально выбивая капли из лунок), накрытому фильтровальной бумагой.

5. Заполняют лунки буфером для промывки (PBS-буфер по п. II.1.А.6.10), внося по 0,25 см3 в каждую лунку, используя восьмиканальный дозатор. После контакта выливают буфер для промывки из лунок и тщательно выбивают капельки жидкости. Процедура отмывки повторяется трижды.

Примечание. Необходимо следовать рекомендованной процедуре промывки и не допускать высыхания микролунок в процессе выполнения анализа.

6. После отмывания добавляют по 0,1 см3 смеси ферментного конъюгата в каждую лунку. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 15 мин в темном месте.

7. По окончании инкубации выливают жидкость из лунок, переворачивая рамку планшета, и тщательно выбивают капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного интенсивного постукивания рамки с лунками по столу (максимально выбивая капли из лунок), накрытому фильтровальной бумагой.

8. Повторяют процедуру отмывки — заполняют лунки буфером для промывки (PBS-буфер по п. II.1.А.6.10), внося по 0,25 см3 в каждую лунку, используя восьмиканальный дозатор. После контакта выливают буфер для промывки из лунок и тщательно выбивают капельки жидкости. Процедура отмывки повторяется трижды.

9. После отмывания добавляют по 0,1 см3 смеси субстрата/хромогена в каждую лунку. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 15 мин в темном месте.

10. Далее измеряют оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм с помощью фотометра планшетного (микропланшетного иммуноферментного анализатора), время от внесения стоп-реагента до измерения не должно превышать 30 мин.

II.1.А.9. Учет и обработка результатов при количественном методе определения

II.1.А.9.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности на фотометре планшетном (микропланшетном иммуноферментном анализаторе) при длине волны 450 нм против нулевого стандарта, значение которого принимается за 100%.

Величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, ниже 0,8 (A450нм < 0,8) является признаком порчи реагентов. Окрашивание красноватого раствора субстрата/хромогена в голубой цвет перед постановкой анализа, также является признаком порчи реагентов. Результаты анализа в таком случае не учитываются.

II.1.А.9.2. Для обработки результатов иммуноферментного анализа используется специальное программное обеспечение, рекомендованное изготовителем тест-системы. Пример стандартной калибровочной кривой дан в сертификате обеспечения качества на тест-систему.

Программное обеспечение выполняет построение градуировочной зависимости относительной оптической плотности B/B0 от натурального логарифма концентрации антибиотика:

B/B0 = a + b·lnC, где (1)

B — оптическая плотность раствора антибиотика;

B0 — оптическая плотность 1-го градуировочного раствора с концентрацией антибиотика 0,00 мкг/дм3;

C — концентрация антибиотика в растворе, мкг/дм3.

Расчет коэффициентов линейной регрессии a и b проводится с помощью метода наименьших квадратов на основании пар значений B/B0, lnCi, полученных для пяти градуировочных растворов, где (i = 2...6), Ci — концентрация i-го градуировочного раствора, Bi — среднее значение оптической плотности, рассчитанное по двум значениям оптической плотности параллельных измерений i-го градуировочного раствора.

Массовая концентрация антибиотика в пробе рассчитывается на основании результатов измерений оптической плотности раствора подготовленной пробы, коэффициентов линейной регрессии и фактора разбавления по формуле:

X = F \cdot exp(\frac{\frac{B_{x}}{B_{0}} - a}{b}), где (2)

X — концентрация антибиотика в пробе, мкг/кг (мкг/дм3);

Bx — оптическая плотность, полученная при измерении раствора пробы;

F — фактор разбавления пробы.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции r2 > 0,98.

II.1.А.9.3. Обработку результатов анализа без программного обеспечения проводят следующим образом. Измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами образцов.

Вычисляют средние значения оптической плотности стандартных и исследуемых растворов, полученные по 2 параллельным микролункам в результате двух параллельных определений.

Относительную оптическую плотность (A) вычисляют по формуле:

A = \frac{B_{i}}{B_{0}} \times 100 , где (3)

A — значение относительной оптической плотности, выраженное в процентах от оптической плотности нулевого стандарта, % поглощения;

Bi — среднее значение оптической плотности стандартных растворов тетрациклинов (или исследуемых растворов продуктов);

B0 — среднее значение оптической плотности нулевого стандарта.

II.1.А.9.4. По величинам значений относительной оптической плотности, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим им значениям концентрации антибиотика, строят калибровочную кривую (градуировочный график) в полулогарифмической системе координат.

II.1.А.9.5. Концентрацию тетрациклина (x) в мкг/дм3 считывают по калибровочной кривой соответственно значениям оптической плотности, которые вычислены по формуле (3).

II.1.А.9.6. Массовую концентрацию (содержание) тетрациклина в испытуемой пробе (X) рассчитывают по формуле:

X = \frac{F \cdot x}{\text{К}} , где (4)

X — массовая концентрация тетрациклина в испытуемой пробе, мг/кг (мг/дм3 — для жидких продуктов);

x — массовая концентрация тетрациклина в экстракте испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, мкг/дм3;

F — фактор разбавления испытуемой пробы, приведенный в табл. 2.2;

К — коэффициент пересчета мкг/дм3 в мг/кг (мг/дм3 — для жидких проб), равный 1 000.

Таблица 2.2

Факторы разбавления для расчета содержания антибиотиков тетрациклиновой группы в различных пробах

II.1.А.10. Проверка приемлемости результатов параллельных определений при количественном методе определения

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где

X1, X2 — результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (табл. 2.1), при этом r = 2,8\sigma_{r} .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

II.1.А.11. Оформление результатов при количественном методе определения

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \delta \frac{X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 2.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание антибиотиков тетрациклиновой группы в молоке < 0,0009 мг/дм3».

II.1.А.12. Контроль точности результатов измерения при количественном методе определения

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости) и воспроизводимости, проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6.

II.1.Б. Методика полуколичественного определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы в пищевой продукции животного происхождения

II.1.Б.1. Область применения полуколичественного метода определения

В настоящем разделе методических указаний установлен порядок полуколичественного определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией результатов (при 450 нм) (далее — ИФА) для следующих групп пищевых продуктов животного происхождения:

1. Молоко и молочные продукты

а) молоко, сливки (сгущенные, концентрированные), а также молокосодержащие. Пределы определения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу), мг/кг: молоко (сгущенное, концентрированное) — 0,0045, сливки (сгущенные, концентрированные) — 0,0045;

б) продукты переработки молока: продукты кисломолочные и сквашенные (с фруктовыми наполнителями/без наполнителей) жидкие, молочные напитки, а также молокосодержащие, в том числе для детского питания, молочные смеси (сухие, жидкие). Пределы определения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу) мг/кг (мг/дм3 — для жидких продуктов): молочные напитки на основе сыворотки — 0,001; молочные смеси (жидкие, восстановленные) — 0,005; сухие молочные смеси (в пересчете на сухой продукт) — 0,005; продукты кисломолочные и сквашенные (с фруктовыми наполнителям и/без наполнителей) жидкие — 0,001; продукты творожные (с фруктовыми наполнителями/без наполнителей) на основе творога, в том числе молокосодержащие — 0,001; молочные напитки на основе сыворотки — 0,001; молокосодержащие продукты сырные, сметанные продукты — 0,001; продукты молокосодержащие сметанные — 0,002;

в) молокосодержащие продукты (спреды сливочно-растительные). Предел определения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу) — 0,003 мг/кг.

2. Мясопродукты, в том числе из птицы

а) субпродукты скота и птицы. Предел обнаружения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу) — примерно 0,0015 мг/кг;

б) продукты из субпродуктов, в том числе птичьих с содержанием мясных ингредиентов более 50% (колбасные изделия, консервы, в том числе для детского питания). Предел обнаружения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу) (колбасные изделия, консервы) — примерно 0,005 мг/кг.

3. Рыбная продукция, продукция аквакультуры

Переработанная продукция из рыбы и аквакультуры (консервы натуральные и с добавлением масла, молочных и яичных компонентов, в том числе для детского питания (с содержанием рыбных ингредиентов более 50%)). Предел обнаружения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу): консервы рыбные — 0,0015 мг/кг.

4. Яйцепродукты

Яичные продукты (яичный порошок, меланж, сухой яичный белок). Предел обнаружения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу): яичный порошок, меланж, сухой яичный белок (в пересчете на сухой продукт) — 0,040 мг/кг.

5. Масло-жировая продукция (спреды растительно-сливочные)

Предел обнаружения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу) — примерно 0,003 мг/кг.

6. Биологически активные добавки к пище на основе переработки животного сырья, не включающие в рецептуру веществ и соединений с антимикробными свойствами (соли йода, лизоцим и т.п.) (с содержанием ингредиентов животного происхождения более 90%). Пределы определения антибиотиков тетрациклиновой группы (по стандартному веществу), мг/кг:

а) БАД к пище на молочной основе (сухие) — 0,005 (в пересчете на сухой продукт);

б) БАД к пище на основе мясного, рыбного сырья и аквакультуры — 0,0025 (в пересчете на сухой продукт).

II.1.Б.2. Методика измерений при полуколичественном методе определения

Та же, что и для количественного метода определения (п. II.1.А.2).

II.1.Б.3. Пределы полуколичественного метода определения

Таблица 2.3

Пределы полуколичественного определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы методом иммуноферментного анализа

II.1.Б.4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы, реактивы и тест-системы для полуколичественного метода определения

II.1.Б.4.1. Средства измерений

Те же, что и для количественного метода определения по п. II.1.А.4.1.

II.1.Б.4.2. Вспомогательные устройства, посуда, материалы

Те же, что и для количественного метода определения по п. II.1.А.4.2.

II.1.Б.4.3. Реактивы

Те же, что и для количественного метода определения по п. II.1.А.4.3.

II.1.Б.4.4. Тест-система для иммуноферментного анализа

Тест-система для непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА), укомплектованная в соответствии с Приложением II (рекомендуемое).

Примечание. Допускается использование тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

II.1.Б.5. Требования безопасности, квалификация операторов и условия выполнения измерений при полуколичественном методе определения

Те же, что и при количественном методе определения (п. II.1.А.5).

II.1.Б.6. Подготовка к исследованию при полуколичественном методе определения

Та же, что и при количественном методе определения (п. II.1.А.6).

II.1.Б.7. Подготовка проб пищевых продуктов для полуколичественного метода определения

1. Отбор проб осуществляют в соответствии МУК 4.1.3534-18 «Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов».

2. Хранение и транспортирование экстрактов, подготовленных для ИФА.

Готовые экстракты допускается хранить до начала анализа в пределах одной лаборатории при температуре от 2 до 8 °C не более 1 суток. Допускается транспортирование материала при температуре от 2 до 8 °C в течение 1 суток. Доставленные в лабораторию образцы в виде экстрактов хранению не подлежат и сразу направляются на анализ.

II.1.Б.7.1. Подготовка проб молока (сгущенного, концентрированного), молочных смесей (сухие, восстановленные, жидкие)

Образцы продуктов в концентрированном виде предварительно разводят: 1 г сухого продукта суспендируют в 4 см3 дистиллированной воды. Пробы нейтрализуют с помощью 0,5 н раствора натрия гидроокиси (п. II.1.А.6.6), доводя уровень pH до 7,0 +/- 0,5.

Далее пробоподготовку проводят по п. II.1.А.7.1.

При расчете конечного результата для концентрированных продуктов учитывают фактор разбавления — 50.

Пробоподготовку жидких продуктов проводят по п. II.1.А.7.1.1 и II.1.А.7.1.2.

Образцы сухих продуктов гомогенизируют в дистиллированной воде: 1 г сухого продукта суспендируют в 4 см3 дистиллированной воды. Далее пробоподготовку проводят в по п. II.1.А.7.1.3.

При расчете конечного результата для концентрированных продуктов учитывают фактор разбавления — 50.

II.1.Б.7.2. Подготовка проб молочных продуктов

II.1.Б.7.2.1. Продукты кисломолочные и сквашенные (с фруктовыми наполнителями/без наполнителей) жидкие, продукты творожные (с фруктовыми наполнителями/без наполнителей) на основе творога и молокосодержащие, сметанные продукты и продукты сметанные молокосодержащие, молочные напитки на основе сыворотки, сливки (сгущенные, концентрированные)

Пробоподготовку для неконцентрированных продуктов проводят по п. II.1.А.7.2.1.

Образцы продуктов в концентрированном виде предварительно разводят: 1 г сухого продукта суспендируют в 4 см3 дистиллированной воды. Пробы нейтрализуют с помощью 0,5 н раствора натрия гидроокиси (п. II.1.А.6.6), доводя уровень pH до 7,0 +/- 0,5.

Далее пробоподготовку проводят по п. II.1.А.7.2.1. При расчете конечного результата для концентрированных продуктов учитывают фактор разбавления — 50.

II.1.Б.7.2.2. Спреды сливочно-растительные

Пробоподготовку проводят по п. II.1.А.7.2.2.

II.1.Б.7.2.3. Молокосодержащие продукты сырные

Пробоподготовку проводят по п. II.1.А.7.2.3.

II.1.Б.7.3. Подготовка проб продуктов из мяса и субпродуктов: колбасные изделия, консервы мясные (с содержанием мясных ингредиентов более 50%)

Пробоподготовку продуктов с содержанием жира менее 5% проводят по п. II.1.А.7.3.2, с содержанием жира более 5% — по п. II.1.А.7.3.1.

II.1.Б.7.4. Подготовка проб переработанной продукции из рыбы и аквакультуры (консервы натуральные и с добавлением масла, молочных и яичных компонентов, в том числе для детского питания (с содержанием рыбных ингредиентов более 50%)

Пробоподготовку проводят по п. II.1.А.7.4.

II.1.Б.7.5. Подготовка проб яичных продуктов сухих (яичный порошок, меланж, сухой яичный белок)

Образцы сухих продуктов гомогенизируют в дистиллированной воде: 1 г сухого продукта суспендируют в 9 см3 дистиллированной воды. Далее пробоподготовку проводят по п. II.1.А.7.5.

При расчете конечного результата для концентрированных продуктов учитывают фактор разбавления — 600 (в пересчете на сухой продукт).

II.1.Б.7.6. Спреды растительно-жировые

Пробоподготовку проводят по п. II.1.А.7.2.2.

II.1.Б.7.7. Биологически активные добавки к пище на основе переработки мясо-молочного сырья, рыбного сырья и аквакультуры (с содержанием ингредиентов животного происхождения более 90%)

Методика описывает пробоподготовку для БАД к пище на основе животного сырья, не включающих в рецептуру веществ и соединений с антимикробными свойствами (солей йода, лизоцим и т.п.).

Экстракцию антибиотиков тетрациклиновой группы из исследуемых образцов БАД проводят следующим образом.

Все количество представительной пробы БАД в форме таблеток, капсул, порошка, сухих форм (например, чипсы) полностью измельчают в гомогенизаторе или в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. БАД в виде сухого порошка тщательно перемешивают в блендере.

Далее готовят 20%-ю суспензию гомогенизированной пробы. Для этого 1 г навески сухого продукта разводят в 4 см3 дистиллированной воды, вновь тщательно перемешивают, встряхивают до полного растворения/суспендирования на вортексе в течение 1 мин и потом перемешивают в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Далее экстракцию подготовленной таким образом пробы проводят:

• для БАД на основе переработки молочного сырья — по п. I.1.А.7.1, как для жидкого продукта.

При расчете конечного результата на сухой продукт учитывают фактор разбавления — 50;

• для БАД на основе переработки мясного сырья — берут 1 г подготовленной 20%-й суспензии и проводят экстракцию по п. II.1.А.7.3.1 как с гомогенизированной пробой.

При расчете конечного результата на сухой продукт учитывают фактор разбавления — 50;

• для БАД на основе переработки рыбного сырья и аквакультуры (кроме рыбьего жира) — берут 1 г подготовленной 20%-й суспензии и проводят экстракцию по п. II.1.А.7.4 как с гомогенизированной пробой.

При расчете конечного результата на сухой продукт учитывают фактор разбавления — 50.

II.1.Б.8. Проведение исследований при полуколичественном методе определения

По п. II.1.А.8.

II.1.Б.9. Учет и обработка результатов при полуколичественном методе определения

По п. II.1.А.9.

Факторы разбавления для расчета содержания антибиотиков тетрациклиновой группы в различных пробах при полуколичественном методе определения в соответствии с табл. 2.4.

Таблица 2.4

Факторы разбавления для расчета содержания антибиотиков тетрациклиновой группы в различных пробах

II.1.Б.10. Расчет результатов параллельных определений при полуколичественном методе определения

За результат полуколичественного анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений:

\overline{X} = \frac{X_{1} + X_{2}}{2} , где

X1, X2 — результаты параллельных определений, мг/кг;

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг.

II.1.Б.11. Оформление результатов определений при полуколичественном методе определения

Если выявлено содержание антибиотика выше предела определения (минимальной границы диапазона) для соответствующего вида продукта (табл. 2.3), то результат анализа представляют в виде:

«антибиотики тетрациклиновой группы в молоке обнаружены».

Если выявлено содержание антибиотика ниже предела определения (минимальной границы диапазона) для соответствующего вида продукта (табл. 2.3), то результат анализа представляют в виде:

«антибиотики тетрациклиновой группы в молоке не обнаружены».

II.1.Б.12. Подтверждение результата полуколичественного определения

При исследовании полуколичественным методом необходимо подтверждение полученного результата на уровне и выше МДУ для тетрациклина с использованием любого аттестованного метода (например, ВЭЖХ-МС).

Приложение II (рекомендуемое)

КОМПЛЕКТАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ ТЕТРАЦИКЛИНОВОЙ ГРУППЫ

(на примере RIDASCREEN® Tetracyclin арт. R3505) <4>

<4> Допускается использование тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Тест-система для количественного определения антибиотиков тетрациклиновой группы по технологии ИФА на 96 определений с внутренним стандартом включает следующие компоненты:

1. Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов с 8 отделяемыми лунками каждый), сенсибилизированных антителами «захвата», в упаковке из фольги в комплекте с влагопоглотителем.

2. Комплект стандартных концентрированных растворов тетрациклина со следующими концентрациями: 0; 0,5; 1,5; 3,0; 6,0; 18,0 мкг/дм3 в воде по 1,3 см3 — 6 шт.

3. Конъюгат — 10 см3.

4. Антитела — 6 см3.

5. Готовая смесь субстрата с хромогеном, содержащая пероксид карбамида и тетраметилбензидин, — 10 см3.

6. Стоп-реагент, содержит 1 н серную кислоту — 14 см3.

7. Буфер 1 для проб для разбавления стандартных растворов и образцов, используется при анализе образцов масла, меда, мяса, колбасных изделий, рыбы, креветок и цельного яйца — 60 см3.

8. Буфер 2 для проб для разбавления стандартных растворов и образцов, используется при анализе образцов молока, в том числе сухого, сыра, молочных продуктов — 60 см3.

9. PBS-буфер в виде сухой соли для приготовления 10 мМ фосфатного буфера, pH 7,4, содержащей 0,05% твина, — 1 пакет.

Наборы рассчитаны на проведение анализа в 2 повторностях 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).

Специфичность методики определения антибиотиков тетрациклиновой группы, установленная по перекрестной чувствительности к соответствующим антибиотикам в буферной системе (на примере RIDASCREEN® Tetracyclin, арт. R3505), представлена ниже.

Специфичность к антибиотикам других тест-систем может отличаться от указанной выше, данная информация должна содержаться в прилагаемом описании тест-систем.

Схема заполнения лунок планшета

II.2. Определение антибиотиков тетрациклиновой группы методами подтверждающего анализа на основе ВЭЖХ-МС

II.2.1. Назначение и область применения

Определение остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы проводится в молоке и молочных продуктах, яйцах и яичном порошке, органах и тканях животных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) по ГОСТ 31694-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором».

Диапазон определяемых содержаний — 1,0 — 1 000,0 мкг/кг.

II.2.2. Особенности и условия применения метода ВЭЖХ-МС

Особенностью применения метода ВЭЖХ-МС в данном случае является то, что метод может обеспечить надежное определение антибиотиков на уровнях, близких к уровням МДУ. Это связано с тем, что в отличие от пищевого сырья, представляющего потенциальную опасность по содержанию антибиотиков, конечная продукция содержит в большинстве случаев продукцию животноводства, рыболовства, пчеловодства, птицеводства в разбавленном виде. Практически единственным исключением является ряд молочных продуктов. В ситуации разбавления пищевого сырья — потенциального источника антибиотиков, метод определения, представленный в ГОСТ 31694-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» является качественным, подтверждающим присутствие антибиотиков, обнаруженных методом ИФА, в пробе.

Условия применения метода по ГОСТ 31694-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» в качестве подтверждающего:

1. Обнаружение содержания антибиотиков в пробе пищевого продукта на уровне МДУ, выше уровня МДУ и ниже уровня МДУ. При этом в расчет берется ошибка метода определения ИФА. В случае присутствия антибиотиков в пробе продукта в количествах ниже МДУ, но если определенное количество в интервале ошибки метода определения равно или выше МДУ — необходимо проведение подтверждения присутствия антибиотика методом ВЭЖХ-МС.

2. Идентификация присутствия антибиотиков проводится без использования внутреннего стандарта (ввиду отсутствия необходимости проведения количественного анализа).

3. Идентификация присутствия антибиотиков проводится как по совпадению времени удерживания (совпадающего со временем удерживания стандарта при одинаковых условиях хроматографирования), так и по совпадению молекулярного и дочерних ионов, полученных масс-спектрометрией элюата.

4. Возможно дополнительное подтверждение присутствия антибиотиков в продукте «методом добавки». Метод заключается в предварительном дополнительном внесении в пробу, в которой присутствуют антибиотики, определенные методом ИФА, дополнительного количества антибиотиков. При этом при хроматографировании пробы должны наблюдаться совпадения времен удерживания пиков антибиотиков пробы и антибиотиков добавки, что выражается в следующем: отсутствие дополнительных вершин пиков (расщепление), отсутствие каких-либо изменений формы пиков.

Отмечаем, что проведение подтверждения «методом добавки» является дополняющим, т.е. пункт 4 только дополняет пункты 2 - 3 и проводится после выполнения идентификации по пунктам 2 - 3.

Метод по ГОСТ 31694-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» может быть использован для подтверждения присутствия или отсутствия антибиотиков тетрациклиновой группы в случае внутреннего контроля содержания антибиотиков на предприятии (при входном контроле продуктов переработки животноводства, рыболовства, пчеловодства, птицеводства). При этом объектом контроля служат продукты переработки, не являющиеся продукцией, предназначенной для реализации населению.

II.2.3. Критерии оценки результатов

Критерии оценки:

1. Присутствие антибиотиков в исследованной пробе считается подтвержденным, если выполнены следующие критерии:

а) обнаруженные вещества в составе образца совпадают как по времени удерживания, так и по молекулярным и дочерним ионам со сравнительными величинами, полученными при хроматографическом разделении и масс-спектрометрии стандартов антибиотиков;

б) соотношение сигнал/шум полученных пиков определяемых антибиотиков в хроматограмме составляет 3 и более.

2. Отсутствие антибиотиков в исследуемой пробе считается подтвержденным в случае невыполнения критериев а), б).

Возможна дополнительная идентификация «методом добавки».

II.2.4. Сведения о метрологической аттестации используемого метода

Данные о метрологической аттестации метода по ГОСТ 31694-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором»:

а) по рыбе

• Номер в реестре сведений об аттестованных методиках (методах) измерений ФР.1.31.2016.24846.
• Свидетельство № 310354-0023/2015 от 23.12.2015;

б) по продукции животноводства

• Номер в реестре сведений об аттестованных методиках (методах) измерений ФР.1.31.2009.06265.
• Свидетельство № 32-09 от 19.06.2009.

Раздел III. Определение остаточных количеств бацитрацина в пищевой продукции животного происхождения

III.1. Определение остаточных количеств бацитрацина в пищевой продукции животного происхождения методом иммуноферментного анализа

III.1.А. Методика количественного определения остаточных количеств бацитрацина в пищевой продукции животного происхождения

Свидетельство об аттестации № РОСС RU.0001.310430/0041.24.04.18 от 24 апреля 2018 г.

III.1.А.1. Область применения количественного метода определения

В настоящем разделе методических указаний установлен порядок количественного определения остаточных количеств бацитрацина путем конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией (при 450 нм) (далее — ИФА) для пищевых продуктов животного происхождения, в том числе для молока (сырого, питьевого, сухого); мяса скота и птицы; яиц (сырого, замороженного); рыбы и рыбных консервов, в том числе для детского питания.

Определение остаточных количеств бацитрацина количественным методом (А) проводят для следующих групп продуктов животного происхождения:

1. Молоко (сырое, питьевое, сухое). Предел определения в молоке и молочных продуктах — 0,011 мг/кг.

2. Мясо скота и птицы. Предел определения бацитрацина (по стандартному веществу) — 0,009 мг/кг.

3. Яйца (сырые, замороженные). Предел определения бацитрацина (по стандартному веществу) — 0,011 мг/кг.

4. Рыба и рыбные консервы, в том числе для детского питания. Предел определения бацитрацина (по стандартному веществу) — 0,009 мг/кг.

III.1.А.2. Методика измерений при количественном методе определения

Количественное определение бацитрацина в пищевых продуктах основано на технологии твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа, в основе которого лежит взаимодействие «антиген — антитело»: лунки микротитровального планшета покрыты антителами к бацитрацину и после внесения в лунки смеси, содержащей антиген (стандартные растворы бацитрацина, конъюгат бацитрацина с ферментом или подготовленная проба продукта), свободный бацитрацин и конъюгат бацитрацина конкурируют за центры связывания антител к бацитрацину. Несвязавшийся конъюгат удаляется в процессе промывки. После добавления в лунки раствора субстрата/хромогена фермент в составе связавшегося с антителами к бацитрацину конъюгата взаимодействует с субстратом, превращая хромоген в вещество голубого цвета. Добавление стоп-реагента приводит к изменению цвета с голубого на желтый. Оптическую плотность прореагировавшей смеси измеряют фотометрически при 450 нм, по результатам измерения судят о количестве бацитрацина в исследуемой пробе (величина оптической плотности раствора обратно пропорциональна концентрации бацитрацина в исследуемой пробе продукта). Расчет содержания бацитрацина проводят по стандартной кривой или с помощью специального программного обеспечения.

III.1.А.3. Метрологические характеристики количественного метода определения

III.1.А.3.1. Метрологические характеристики количественного метода определения остаточных количеств бацитрацина в продуктах питания животного происхождения, проводимого в полном соответствии с приведенной процедурой твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа, представлены в табл. 3.1.

Таблица 3.1

Метрологические характеристики количественного определения остаточных количеств бацитрацина в пищевых продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа

III.1.А.4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы, реактивы и тест-системы для количественного метода определения

III.1.А.4.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками

III.1.А.4.2. Вспомогательные устройства, посуда и материалы

<5> Пересчет относительного центробежного ускорения (в единицах g) (ОЦУ/RFS) в скорость центрифугирования (об./мин) приведен в Приложении для всех разделов.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств, посуды и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

III.1.А.4.3. Реактивы

Примечание. Допускается применение других химических реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

III.1.А.4.4. Тест-система для иммуноферментного анализа

Тест-система для количественного определения бацитрацина по технологии ИФА на 96 определений с внутренним стандартом, включающая следующие компоненты ( RIDASCREEN^{®} Bacitracin арт. R2901):

1. Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов с 8 отделяемыми лунками каждый), покрытый антителами к бацитрацину, в упаковке из фольги в комплекте с влагопоглотителем.

2. Комплект стандартных растворов бацитрацина в воде (по 1 см3 каждый, нулевой стандарт — 2 см3) с концентрациями: 0 (нулевой стандарт); 0,625; 1,25; 2,5; 5,0; 10,0; 20,0 мкг/дм3 бацитрацина в воде).

3. Конъюгат бацитрацина с пероксидазой, концентрат (x100) — 0,1 см3.

4. Готовая смесь субстрата с хромогеном — 12 см3.

5. Стоп-реагент (1 н серная кислота) — 15 см3.

6. Буфер для разбавления проб, готовый к употреблению — 40 см3.

7. Буфер для разбавления конъюгата, готовый к употреблению — 15 см3.

8. Буфер для промывки, концентрат (x20) — 30 см3.

Набор рассчитан на проведение анализа в 2 повторностях 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).

III.1.А.5. Требования безопасности, квалификация операторов и условия выполнения измерений при количественном методе определения

1. Исследования пищевых продуктов с использованием методики ИФА бацитрацина проводят с соблюдением требований техники безопасности, установленных для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007), а также в инструкции по использованию тест-наборов.

2. При выполнении измерений с использованием планшетного иммуноферментного анализатора и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцию по эксплуатации прибора.

3. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области иммуноферментного анализа. К проведению анализа допускается только персонал, ознакомленный с руководством по эксплуатации планшетного иммуноферментного анализатора и освоивший данную методику.

5. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• температура окружающего воздуха: от 20 до 30 °C;
• относительная влажность воздуха: от 40 до 80%.

III.1.А.6. Подготовка к исследованию для количественного метода определения

III.1.А.6.1. Подготовка стеклянной посуды

При подготовке к проведению исследований лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

III.1.А.6.2. Подготовка оборудования

Подготовку и проверку фотометра и pH-метра проводят в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

III.1.А.6.3. Хранение и использование наборов и реагентов

Тест-системы для ИФА хранят при температуре 2 — 8 °C, не допуская подмораживания компонентов. Использовать набор допускается только в пределах срока годности.

III.1.А.6.4. Приготовление 80%-го раствор метанола

Для приготовления 80%-го раствора метанола в буфере для разбавления проб (входит в комплект набора) в количестве, необходимом для экстракции, смешивают метанол и буфер в соотношении 4 + 1 (например, к 8 см3 метанола прибавляют 2 см3 буфера для разбавления проб, данный объем достаточен для экстракции 5 проб). Раствор тщательно перемешивают.

III.1.А.6.5. Приготовление моющего буферного раствора

Для приготовления буфера для промывки разбавляют исходный концентрированный раствор буфера в 20 раз деминерализованной водой в соотношении 1 + 19 (например, к 2 см3 концентрата прибавляют 38 см3 деминерализованной воды). Раствор тщательно перемешивают.

Поскольку разбавленный буфер для промывки хранению не подлежит, его готовят непосредственно перед использованием, рассчитывая необходимое его количество для проведения анализа. Например, 40 см3 разведенного раствора буфера для промывки достаточно для 4 микротитровальных стрипов по 8 лунок в каждом.

III.1.А.6.6. Приготовление 0,5 н раствора гидроокиси натрия (для нейтрализации образцов)

Навеску 4,0 г гидроокиси натрия, разводят в мерной колбе объемом 250 см3 дистиллированной водой до метки. Раствор тщательно перемешивают.

III.1.А.6.7. Приготовление раствора конъюгата

Готовится непосредственно перед анализом.

Для приготовления раствора конъюгата бацитрацина с пероксидазой необходимо отцентрифугировать флакон (виалу) с концентратом в течение 1 мин при 1 000 g при комнатной температуре (20 — 25) °C.

Поскольку разбавленный раствор конъюгата имеет ограниченную стабильность, следует готовить раствор по потребности. Для приготовления готового раствора концентрат разбавляют в 100 раз в соотношении 1 + 99 буфером для разбавления конъюгата (например, 0,02 см3 концентрата конъюгата смешивают с 1,980 см3 буфера, данный объем достаточен для 4 стрипов).

III.1.А.7. Подготовка проб пищевых продуктов для количественного метода определения

1. Отбор проб осуществляют в соответствии МУК 4.1.3534-18 «Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов».

2. Хранение и транспортирование экстрактов, подготовленных для ИФА.

Готовые экстракты допускается хранить до начала анализа в пределах одной лаборатории при температуре от 2 до 8 °C не более 1 суток. Допускается транспортирование материала при температуре от 2 до 8 °C в течение 1 суток. Доставленные в лабораторию образцы в виде экстрактов хранению не подлежат и сразу направляются на анализ.

III.1.А.7.1. Подготовка проб молока (сырое, питьевое, сухое)

Образцы продуктов в сухом виде предварительно восстанавливают в воде в соответствии с указанием на этикетке (нормативно-технической документации на продукт) при отсутствии информации 1 г сухого продукта суспендируют в 9 см3 дистиллированной воды.

Пробы нейтрализуют с помощью 0,5 н раствора натрия гидроокиси (п. III.1.А.6.6), доводя уровень pH до 7,0 +/- 0,5, после чего центрифугируют в течение 5 мин при 2 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C в течение 20 — 30 мин).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант разбавляют в 10 раз (соотношение 1 + 9) буфером для разбавления проб (в комплекте набора) (например, к 0,02 см3 обезжиренного супернатанта добавляют 0,18 см3 буфера для разбавления проб), перемешивают на вортексе.

Для дальнейшего анализа используют по 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10, для сухих продуктов дополнительно учитывают коэффициент восстановления.

III.1.А.7.2. Подготовка проб мяса скота и птицы, яиц, рыбы, рыбных консервов, в том числе для детского питания

Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску 1 г гомогенизированной пробы вносят в центрифужную пробирку объемом 15 см3, добавляют 2 см3 80%-го раствора метанола в буфере (п. III.1.А.6.4) для проб, перемешивают встряхиванием в течение 15 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом), центрифугируют при 2 000 g в течение 10 мин при комнатной температуре (20 — 25 °C), супернатант отбирают в пустую пробирку.

Супернатант разбавляют в 5 раз (соотношение 1 + 4) буфером для разбавления проб (в комплекте набора) (например, к 0,04 см3 супернатанта добавляют 0,16 см3 буфера для разбавления проб), перемешивают на вортексе.

Для анализа вносят по 0,05 см3 подготовленного экстракта в лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 15.

III.1.А.8. Проведение исследований при количественном методе определения

III.1.А.8.1. Общие положения

1. Раствор субстрата/хромогена светочувствителен, поэтому необходимо избегать попадания на него прямого света. При появлении окрашивания раствора субстрата/хромогена в голубоватый цвет реагент к работе непригоден.

2. Не допускается заменять реагенты в составе одного комплекта реагентами из другого комплекта с другим номером партии. Не допускается перекрестное использование реагентов из комплектов с разными номерами партий.

III.1.А.8.2. Подготовка тест-системы к исследованиям

1. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов (8 микролунок скрепленных в одну полоску). Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить в холодильник при температуре 2 — 8 °C.

2. Перед использованием тест-набора доводят температуру всех реагентов до комнатной температуры (20 — 25 °C) в течение 0,5 — 1 ч. Если в концентратах буфера и конъюгата образовались кристаллы, нужно растворить их путем встряхивания при комнатной температуре перед разведением этих реагентов.

3. Перед непосредственным использованием встряхивают каждый флакон с реагентами.

4. После использования реагенты тест-системы сразу убирают в холодильник.

5. На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

6. Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники автоматических дозаторов. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.

7. Каждый исследуемый раствор экстрактов испытуемых проб и градуировочных растворов анализируют в двух повторностях.

III.1.А.8.3. Алгоритм проведения исследования

Анализ проводят поэтапно.

1. В рамку планшета вставляют необходимое количество микролунок, достаточное для всех растворов стандартов и растворов исследуемых проб при анализе в двух повторностях каждый. Записывают положения лунок со стандартами и исследуемыми растворами на бланке планшета.

2. Добавляют в выбранные пары лунок по 0,05 см3 каждой концентрации раствора стандарта или раствора подготовленной пробы продукта, после чего в каждую лунку добавляют по 0,05 см3 разбавленного конъюгата (п. III.1.А.6.7). Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 1 часа в темном месте.

3. По окончании инкубации выливают жидкость из лунок, переворачивая рамку планшета, и тщательно выбивают капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Заполняют лунки буфером для промывки, подготовленным по п. III.1.А.6.5, внося по 0,3 см3 в каждую лунку, используя восьмиканальный дозатор. После контакта выливают буфер для промывки из лунок и тщательно выбивают капельки жидкости. Процедура отмывки повторяется трижды.

Примечание. Необходимо следовать рекомендованной процедуре промывки и не допускать высыхания микролунок в процессе выполнения анализа.

4. После отмывания добавляют по 0,1 см3 смеси субстрата/хромогена в каждую лунку. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 30 минут в темном месте.

5. По окончании инкубации добавляют в каждую лунку по 0,1 см3 стоп-реагента. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и сразу после этого измеряют оптическую плотность в каждой лунке, время от внесения стоп-реагента до измерения не должно превышать 30 мин.

III.1.А.9. Учет и обработка результатов при количественном методе определения

III.1.А.9.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности на микропланшетном иммуноферментном анализаторе (планшетный фотометр, ридер) при длине волны 450 нм против нулевого стандарта, значение которого принимается за 100%.

Величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, ниже 0,6 (A450нм < 0,6) является признаком порчи реагентов. Результаты анализа в таком случае не учитываются.

Измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами образцов.

III.1.А.9.2. Для обработки результатов иммуноферментного анализа используется специальное программное обеспечение, рекомендованное изготовителем тест-системы. Пример стандартной калибровочной кривой дан в сертификате обеспечения качества на тест-систему.

Программное обеспечение выполняет построение градуировочной зависимости относительной оптической плотности B/B0 от натурального логарифма концентрации антибиотика

B/B0 = a + b·lnX, где (1)

B — оптическая плотность раствора антибиотика;

B0 — оптическая плотность 1-го градуировочного раствора с концентрацией антибиотика 0,00 мкг/дм3;

X — концентрация антибиотика в растворе, мкг/дм3.

Расчет коэффициентов линейной регрессии a и b проводится с помощью метода наименьших квадратов на основании пар значений B/B0, lnCi, полученных для пяти градуировочных растворов, где (i = 2...6), Ci — концентрация i-го градуировочного раствора, Bi — среднее значение оптической плотности, рассчитанное по двум значениям оптической плотности параллельных измерений i-го градуировочного раствора.

Массовая концентрация антибиотика в пробе рассчитывается на основании результатов измерений оптической плотности раствора подготовленной пробы, коэффициентов линейной регрессии и фактора разбавления по формуле:

X = F \cdot exp(\frac{\frac{B_{x}}{B_{0}} - a}{b}), где (2)

X — концентрация антибиотика в пробе, мкг/кг (мкг/дм3);

Bx — оптическая плотность, полученная при измерении раствора пробы;

F — фактор разбавления пробы.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции r2 > 0,98.

III.1.А.9.3. Обработку результатов анализа без программного обеспечения проводят следующим образом.

Измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами образцов.

Вычисляют средние значения оптической плотности стандартных и исследуемых растворов, полученные по 2 параллельным микролункам в результате двух параллельных определений.

Относительную оптическую плотность (A) вычисляют по формуле:

A = \frac{B_{i}}{B_{0}} \times 100 , где (3)

A — значение относительной оптической плотности, выраженное в процентах от оптической плотности нулевого стандарта, % поглощения;

Bi — среднее значение оптической плотности стандартных растворов антибиотика (или исследуемых растворов продуктов);

B0 — среднее значение оптической плотности нулевого стандарта.

III.1.А.9.4. По величинам значений относительной оптической плотности, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим им значениям концентрации антибиотика в мкг/кг строят калибровочную кривую (градуировочный график) в полулогарифмической системе координат.

III.1.А.9.5. Концентрацию антибиотика (x) в мкг/дм3 считывают по калибровочной кривой соответственно значениям оптической плотности, которые вычислены по формуле (3).

III.1.А.9.6. Массовую концентрацию (содержание) бацитрацина в испытуемой пробе (X) рассчитывают по формуле:

X = \frac{F \cdot x}{\text{К}} , где (4)

X — массовая концентрация бацитрацина в испытуемой пробе, мг/кг (мг/дм3 — для жидких продуктов);

x — массовая концентрация бацитрацина в экстракте испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, мкг/дм3 (мкг/кг);

F — фактор разбавления испытуемой пробы, приведенный в табл. 3.2;

К — коэффициент пересчета мкг/дм3 в мг/кг (мг/дм3 — для жидких проб), равный 1 000.

Таблица 3.2

Факторы разбавления для расчета содержания бацитрацина в различных пробах

III.1.А.10. Проверка приемлемости результатов параллельных определений при количественном методе определения

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где

X1, X2 — результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом r = 2,8\sigma_{r} .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

III.1.А.11. Оформление результатов при количественном методе определения

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \delta \frac{X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание бацитрацина в яйце < 0,0110 мг/кг».

III.1.А.12. Контроль точности результатов измерения при количественном методе определения

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости) и воспроизводимости, проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6.

III.1.Б. Методика полуколичественного определения остаточных количеств бацитрацина в пищевой продукции животного происхождения

III.1.Б.1. Область применения полуколичественного метода определения

В настоящем разделе методических указаний установлен порядок полуколичественного определения остаточных количеств бацитрацина методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией результатов (при 450 нм) (далее — ИФА) для следующих групп пищевых продуктов животного происхождения:

1. Молочные смеси, в том числе для детского питания (сухие, жидкие, восстановленные). Предел обнаружения в молоке и молочных продуктах — 0,011 мг/кг (мг/дм3).

2. Мясо- и птицепродукты

а) субпродукты скота и птицы, жир-сырец. Предел обнаружения бацитрацина (по стандартному веществу) — 0,009 мг/кг;

б) продукты из мяса и субпродуктов, в том числе птичьих, с содержанием мясных ингредиентов более 50% (колбасные изделия, консервы мясные, в том числе для детского питания). Предел обнаружения бацитрацина (по стандартному веществу) — 0,009 мг/кг.

3. Рыбная продукция, продукция аквакультуры

а) рыбная продукция и продукция аквакультуры (рыба, креветки) сырая, варено-мороженая. Пределы обнаружения бацитрацина (по стандартному веществу) — 0,009 мг/кг;

б) переработанная продукция из рыбы и аквакультуры с содержанием рыбных ингредиентов более 50% (консервы натуральные с добавлением масла), кулинарные продукты из рыбы с яичным компонентом для детского питания. Пределы обнаружения бацитрацина (по стандартному веществу) — 0,009 мг/кг.

4. Яйца и яйцепродукты

Яичные продукты сухие (яичный порошок, меланж, сухой яичный белок). Предел обнаружения бацитрацина (по стандартному веществу) — примерно 0,11 мг/кг (в сухом продукте).

5. Биологически активные добавки к пище на основе мясного, рыбного сырья и аквакультуры (кроме рыбьего жира), не включающие в рецептуру веществ и соединений с антимикробными свойствами (соли йода, лизоцим и т.п.) (с содержанием ингредиентов животного происхождения более 90%). Пределы определения бацитрацина (по стандартному веществу) — 0,043 мг/кг (в пересчете на сухой продукт).

III.1.Б.2. Методика измерений при полуколичественном методе определения

Та же, что и для количественного метода определения (п. III.1.А.2).

III.1.Б.3. Пределы полуколичественного метода определения

Таблица 3.3

Пределы полуколичественного определения остаточных количеств бацитрацина в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа

посуда, материалы, реактивы и тест-системы для полуколичественного метода определения

III.1.Б.4.1. Средства измерений

Те же, что и для количественного метода определения (п. III.1.А.4.1).

III.1.Б.4.2. Вспомогательные устройства, посуда, материалы

Те же, что и для количественного метода определения (п. III.1.А.4.2).

III.1.Б.4.3. Реактивы

Те же, что и для количественного метода определения (п. III.1.А.4.3).

III.1.Б.4.4. Тест-система для иммуноферментного анализа

Тест-система для непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА), укомплектованная в соответствии с Приложением III (рекомендуемое).

Примечание. Допускается использование тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

III.1.Б.5. Требования безопасности, квалификация операторов и условия выполнения измерений при количественном методе определения

Те же, что и для количественного метода определения (п. III.1.А.5).

III.1.Б.6. Подготовка к исследованию для полуколичественного метода определения

Та же, что и для количественного метода определения (п. III.1.А.6).

III.1.Б.7. Подготовка проб для полуколичественного метода определения

III.1.Б.7.1. Подготовка проб молочных продуктов

Молочные смеси, в том числе для детского питания (жидкие, восстановленные) — пробоподготовка по п. III.1.А.7.1.

III.1.Б.7.2. Подготовка проб мяса скота и птицы, яиц, рыбной продукции (рыбных консервов), продукции аквакультуры

III.1.Б.7.2.1. Субпродукты скота и птицы, продукты из мяса и субпродуктов, в том числе птичьих, с содержанием мясных ингредиентов более 50% (колбасные изделия, консервы мясные, в том числе для детского питания), рыбная продукция и продукция аквакультуры (рыба, креветки) сырая, варено-мороженая, рыбные консервы (с содержанием рыбных ингредиентов более 50%), кулинарные продукты из рыбы с яичным компонентом для детского питания.

Пробоподготовка по п. III.1.А.7.2.

III.1.Б.7.2.2. Яичные продукты сухие (яичный порошок, меланж, сухой яичный белок) масла)

Образцы продуктов в сухом виде предварительно восстанавливают в воде в соответствии с указанием на этикетке (нормативно-технической документации на продукт). При отсутствии информации 1 г сухого продукта суспендируют в 9 см3 дистиллированной воды. Далее проводят пробоподготовку как для яиц (сырых) по п. III.1.А.7.2.

При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 150 (на сухой продукт).

III.1.Б.7.2.3. Биологически активные добавки к пище на основе переработки мясного, рыбного сырья и аквакультуры (кроме рыбьего жира) (с содержанием ингредиентов животного происхождения более 90%)

Методика описывает пробоподготовку для БАД к пище на основе животного сырья, не включающих в рецептуру веществ и соединений с антимикробными свойствами (соли йода, лизоцим и т.п.).

Экстракцию бацитрацина из исследуемых образцов БАД на основе переработки мясного, рыбного сырья и аквакультуры (кроме рыбьего жира) проводят следующим образом.

Все количество представительной пробы БАД в форме таблеток, капсул, порошка, сухих форм (например, чипсы) полностью измельчают в гомогенизаторе или в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. БАД в виде сухого порошка тщательного перемешивают в блендере.

Далее готовят 20%-ю суспензию гомогенизированной пробы, для этого 1 г навески сухого продукта разводят в 4 см3 дистиллированной воды, вновь тщательно перемешивают, встряхивают до полного растворения/суспендирования на вортексе в течение 1 мин и потом перемешивают в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

После чего берут 1 г подготовленной 20%-й суспензии и проводят экстракцию по п. III.1.А.7.2, как с гомогенизированной пробой (при пересчете на сухой продукт дополнительно учитывают коэффициент разведения — 5).

При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 75.

III.1.Б.8. Проведение исследований при полуколичественном методе определения

Так же, как и при количественном методе определения (п. III.1.А.8).

III.1.Б.9. Учет и обработка результатов при полуколичественном методе определения

Так же, как и при количественном методе определения (п. III.1.А.9).

Факторы разбавления для расчета содержания бацитрацина в различных пробах при полуколичественном методе определения в соответствии с табл. 3.4.

Таблица 3.4

Факторы разбавления для расчета содержания бацитрацина в различных пробах

III.1.Б.10. Расчет результатов параллельных определений при полуколичественном методе определения

Так же, как и при количественном методе определения (п. III.1.А.10).

III.1.Б.11. Оформление результатов определений при полуколичественном методе определения

Если содержание бацитрацина выше предела определения для соответствующего вида продукта (табл. 3.3), то результат анализа представляют в виде:

«бацитрацин в яйце обнаружен».

Если содержание бацитрацина ниже предела определения для соответствующего вида продукта (табл. 3.3), то результат анализа представляют в виде:

«бацитрацин в яйце не обнаружен».

III.1.Б.12. Подтверждение результата полуколичественного определения

При исследовании полуколичественным методом необходимо подтверждение полученного результата на уровне и выше МДУ для бацитрацина с использованием любого аттестованного метода (например, ВЭЖХ-МС).

Приложение III (рекомендуемое)

КОМПЛЕКТАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАЦИТРАЦИНА

(на примере RIDASCREEN® Bacitracin арт. R2901) <6>

<6> Допускается использование тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Набор для количественного определения антибиотиков тетрациклиновой группы по технологии ИФА на 96 определений с внутренним стандартом включает следующие компоненты:

1. Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов с 8 отделяемыми лунками каждый), покрытый антителами к бацитрацину, в упаковке из фольги в комплекте с влагопоглотителем.

2. Комплект стандартных растворов бацитрацина в воде (по 1 см3 каждый, нулевой стандарт — 2 см3) с концентрациями: 0 (нулевой стандарт); 0,625; 1,25; 2,5; 5,0; 10,0; 20,0 мкг/дм3 бацитрацина в воде).

3. Конъюгат бацитрацина с пероксидазой, концентрат (x100) — 0,1 см3.

4. Готовая смесь субстрата с хромогеном — 12 см3.

5. Стоп-реагент (1 н серная кислота) — 15 см3.

6. Буфер для разбавления проб, готовый к употреблению — 40 см3.

7. Буфер для разбавления конъюгата, готовый к употреблению — 15 см3.

8. Буфер для промывки, концентрат (x20) — 30 см3.

Набор рассчитан на проведение анализа в 2 повторностях 41 исследуемого образца и 7 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).

Специфичность методики определения бацитрацина установленная по перекрестной чувствительности к исследованным антибиотикам в буферной системе (на примере тест-системы RIDASCREEN^{®} Bacitracin арт. R2901), представлена ниже.

Специфичность к антибиотикам других тест-систем может отличаться от указанной выше, данная информация должна содержаться в прилагаемом описании тест-систем.

III.2. Определение бацитрацина методами подтверждающего анализа на основе ВЭЖХ-МС

III.2.1. Назначение и область применения

Определение массовой доли цинкбацитрацина проводится в мясе, включая мясо птицы, субпродуктах, мясных и мясосодержащих продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием по ГОСТ 33934-16 «Мясо и мясные продукты. Определение цинкбацитрацина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором».

Диапазон определяемых содержаний — 0,02 — 100 мг/кг.

III.2.2. Особенности и условия применения метода ВЭЖХ-МС

Особенностью применения метода ВЭЖХ-МС в данном случае является то, что метод может обеспечить надежное определение антибиотика на уровнях, близких к уровням МДУ. Это связано с тем, что в отличие от пищевого сырья, представляющего потенциальную опасность по содержанию антибиотиков, конечная продукция содержит в большинстве случаев продукцию животноводства, рыболовства, пчеловодства, птицеводства в разбавленном виде. Практически единственным исключением является ряд молочных продуктов. В ситуации разбавления пищевого сырья — потенциального источника антибиотиков, метод определения, представленный в ГОСТ 33934-16 «Мясо и мясные продукты. Определение цинкбацитрацина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» является качественным, подтверждающим присутствие антибиотика, обнаруженного методом ИФА, в пробе.

Условия применения метода по ГОСТ 33934-16 «Мясо и мясные продукты. Определение цинкбацитрацина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» в качестве подтверждающего:

1. Обнаружение содержания антибиотика в пробе пищевого продукта на уровне МДУ, выше уровня МДУ и ниже уровня МДУ. При этом в расчет берется ошибка метода определения ИФА. В случае присутствия антибиотика в пробе продукта в количествах ниже МДУ, но если определенное количество в интервале ошибки метода определения равно или выше МДУ — необходимо проведение подтверждения присутствия антибиотика методом ВЭЖХ-МС.

2. Идентификация присутствия антибиотика проводится без использования внутреннего стандарта (ввиду отсутствия необходимости проведения количественного анализа).

3. Идентификация присутствия антибиотика проводится как по совпадению времени удерживания (совпадающего со временем удерживания стандарта при одинаковых условиях хроматографирования), так и по совпадению молекулярного и дочерних ионов, полученных масс-спектрометрией элюата.

4. Возможно дополнительное подтверждение присутствия антибиотика в продукте «методом добавки». Метод заключается в предварительном дополнительном внесении в пробу, в которой присутствует антибиотик, определенный методом ИФА, дополнительного количества антибиотика. При этом при хроматографировании пробы должны наблюдаться совпадения времени удерживания пиков антибиотика пробы и антибиотика добавленного, что выражается в следующем: отсутствие дополнительных вершин пиков (расщепление), отсутствие каких-либо изменений формы пиков.

Отмечаем, что проведение подтверждения «методом добавки» является дополняющим, т.е. пункт 4 только дополняет пункты 2 - 3 и проводится после выполнения идентификации по пунктам 2 - 3.

Метод по ГОСТ 33934-16 «Мясо и мясные продукты. Определение цинкбацитрацина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» может быть использован для подтверждения присутствия или отсутствия цинкбацитрацина в случае внутреннего контроля содержания антибиотиков на предприятии (при входном контроле продуктов переработки животноводства, птицеводства). При этом объектом контроля служат продукты переработки, не являющиеся продукцией, предназначенной для реализации населению.

III.2.3. Критерии оценки результатов

Критерии оценки:

1. Присутствие антибиотика в исследованной пробе считается подтвержденным, если выполнены следующие критерии:

а) обнаруженное вещество в составе образца совпадает как по времени удерживания, так и по молекулярным и дочерним ионам со сравнительными величинами, полученными при хроматографическом разделении и масс-спектрометрии стандарта антибиотика;

б) соотношение сигнал/шум полученного пика определяемого антибиотика в хроматограмме составляет 3 и более.

2. Отсутствие антибиотика в исследуемой пробе считается подтвержденным в случае невыполнения критериев а), б).

Возможна дополнительная идентификация «методом добавки».

III.2.4. Сведения о метрологической аттестации используемого метода

Данные о метрологической аттестации метода по ГОСТ 33934-16 «Мясо и мясные продукты. Определение цинкбацитрацина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором»:

• Номер в реестре сведений об аттестованных методиках (методах) измерений ФР.1.31.2017.25618.
• Свидетельство № 253.0138/01.00258/2016 от 11.07.2016.

Раздел IV. Определение остаточных количеств аминогликозидов (стрептомицин) в пищевой продукции животного происхождения

IV.1. Методика полуколичественного определения остаточных количеств аминогликозидов (стрептомицин) в пищевой продукции животного происхождения методом иммуноферментного анализа

IV.1.1. Область применения полуколичественного метода определения

В настоящем разделе методических указаний установлен порядок полуколичественного определения остаточных количеств стрептомицина методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией результатов (при 450 нм) (далее — ИФА) для следующих групп пищевых продуктов животного происхождения:

1. Молоко и молочные продукты

а) молоко, сливки (сырые, питьевые, сухие, концентрированные). Пределы обнаружения стрептомицина (по стандартному веществу): молоко, сливки — 0,005 мг/дм3; сухое молоко (в восстановленном) — 0,003 мг/кг;

б) продукты переработки молока продукты: творог, сыр, масло из коровьего молока, спреды сливочно-растительные, молочные смеси, в том числе для детского питания. Пределы обнаружения стрептомицина (по стандартному веществу): творог, сыр — 0,022 мг/кг, масло, спреды сливочно-растительные — 0,026 мг/кг, молочные смеси (восстановленные) — 0,003 мг/кг.

2. Мясо и субпродукты скота и птицы

Мясо (говядина, свинина, птица), печень, почки (свиные и говяжьи). Пределы обнаружения стрептомицина (по стандартному веществу): мясо скота — 0,022 мг/кг, птица — 0,028 мг/кг; печень — 0,023 мг/кг; почки — 0,018 мг/кг.

3. Рыба, продукция аквакультуры, кулинарные продукты из рыбы с молочным компонентом для детского питания

а) рыба, креветки. Пределы обнаружения стрептомицина (по стандартному веществу) примерно: рыба — 0,028 мг/кг, креветки — 0,020 мг/кг.

4. Масло-жировая продукция (спреды растительно-сливочные)

Предел обнаружения стрептомицина (по стандартному веществу) — 0,026 мг/кг.

5. Мед

Предел обнаружения стрептомицина (по стандартному веществу) — 0,002 мг/кг.

6. Биологически активные добавки к пище на основе переработки молочного сырья, не включающие в рецептуру веществ и соединений с антимикробными свойствами (соли йода, лизоцим и т.п.) (с содержанием молочных ингредиентов более 90%). Пределы определения стрептомицина (по стандартному веществу), мг/кг: 0,05 (в пересчете на сухой продукт).

IV.1.2. Методика измерений при полуколичественном методе определения

В основе принципа действия тест-системы лежит реакция «антиген — антитело». Лунки микротитровального планшета покрыты антителами захвата к антителам к стрептомицину. На микротитровальный планшет уже нанесены антитела к стрептомицину, связанные иммобилизированными антителами захвата. В лунки дозируют растворы стандартов или проб и конъюгат стрептомицина. Свободный стрептомицин и стрептомицин из конъюгата конкурируют за места связывания с антителами (конкурентный иммуноферментный анализ). Все несвязанные молекулы конъюгата затем удаляются на этапе отмывки.

Связанные молекулы конъюгата превращают хромоген в окрашенные в синий продукты реакции. Внесение стоп-раствора изменяет окраску от синей к желтой. Измерения выполняют фотометрически при длине волны 450 нм. Оптическая плотность обратно пропорциональна концентрации стрептомицина в пробе.

IV.1.3. Пределы полуколичественного метода определения

Пределы полуколичественного определения остаточных количеств стрептомицина в пищевых продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа представлены в табл. 4.1.

Таблица 4.1

Пределы полуколичественного определения остаточных количеств стрептомицина в пищевых продуктах методом ИФА

IV.1.4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы, реактивы и тест-системы для полуколичественного метода определения

IV.1.4.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

IV.1.4.2. Вспомогательные устройства, посуда и материалы

<7> Пересчет относительного центробежного ускорения (в единицах g) (ОЦУ/RFS) в скорость центрифугирования (об./мин) приведен в Приложении для всех разделов.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств, посуды и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

IV.1.4.3. Реактивы

Примечание. Допускается применение других химических реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

IV.1.₄.4. Тест-система для иммуноферментного анализа

Тест-система для непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА), укомплектованная в соответствии с Приложением IV (рекомендуемое).

Примечание. Допускается использование тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

IV.1.5. Требования безопасности, квалификация операторов и условия выполнения измерений при полуколичественном методе определения

и условия выполнения измерений при полуколичественном методе определения

1. Исследования пищевых продуктов с использованием методики ИФА проводят с соблюдением требований техники безопасности, установленных для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007), а также в инструкции по использованию тест-наборов.

2. При выполнении измерений с использованием планшетного иммуноферментного анализатора и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцию по эксплуатации прибора.

3. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области иммуноферментного анализа. К проведению анализа допускается только персонал, ознакомленный с руководством по эксплуатации планшетного иммуноферментного анализатора и освоивший данную методику.

5. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• температура окружающего воздуха: от 20 до 30 °C;
• относительная влажность воздуха: от 40 до 80%.

IV.1.6. Подготовка к исследованию при полуколичественном методе определения

IV.1.6.1. Подготовка стеклянной посуды

При подготовке к проведению исследований лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

IV.1.6.2. Подготовка оборудования

Подготовку и проверку фотометра и pH-метра проводят в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

IV.1.6.3. Хранение и использование наборов и реагентов

Тест-системы для ИФА хранят при температуре 2 — 8 °C, не допуская подмораживания компонентов. Использовать набор допускается только в пределах срока годности.

IV.1.6.4. Приготовление 10 мМ моющего буферного раствора с pH 7,4 (PBS-буфер с твином)

Способ 1. Используют пакет с солью для приготовления моющего буфера, входящий в комплект набора. Растворяют содержимое целого пакетика в 1 дм3 дистиллированной воды. Готовый 10 мМ моющий буфер может храниться при температуре 2 — 8 °C в течение 4 — 6 недель.

Способ 2. Растворяют содержимое пакетика в 100 см3 дистиллированной воды, чтобы получить 10-кратный концентрат моющего буфера. Раствор может храниться около 8 — 12 недель при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Для приготовления готового к употреблению 10 мМ моющего буфера растворяют одну часть 10-кратного концентрата в 9 частях дистиллированной воды.

IV.1.6.5. Приготовление буферного раствора PBS для разбавления проб (PBS-буфер)

Навески: 0,63 г натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного; 5,7 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного и 9 г NaCl; довести до 1 000 см3 дистиллированной водой в мерной колбе, тщательно перемешать.

IV.1.6.6. Приготовление 0,5 н раствор гидроокиси натрия

Для приготовления 0,5 н раствора гидроокиси натрия навеску гидроокиси натрия массой 4,0 г развести в мерной колбе объемом 250 см3 дистиллированной водой до метки.

IV.1.6.7. Приготовление 3,4%-го (по объему) раствора ортофосфорной кислоты

Отобрать 4 см3 ортофосфорной кислоты 85%-й в мерную колбу на 100 см3 и довести до метки дистиллированной водой.

IV.1.6.8. Приготовление экстракционного буфера (раствор 50 мМ натриевая соли гептансульфоновой кислоты с 25 мМ трисодиумфосфат с pH 2,0)

Навески 2,0 г натриевой соли гептан-сульфоновой кислоты и 1,9 г тринатрийфосфата 12-водного растворить в 170 — 190 см3 дистиллированной воды, установить pH ортофосфорной кислотой до 2,0 +/- 0,1, довести до конечного объема — до 200 см3.

IV.1.7. Подготовка проб пищевых продуктов для полуколичественного метода определения

1. Отбор проб осуществляют в соответствии МУК 4.1.3534-18 «Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов».

2. Хранение и транспортирование экстрактов, подготовленных для ИФА.

Готовые экстракты допускается хранить до начала анализа в пределах одной лаборатории при температуре от 2 до 8 °C не более 1 суток. Допускается транспортирование материала при температуре от 2 до 8 °C в течение 1 суток. Доставленные в лабораторию образцы в виде экстрактов хранению не подлежат и сразу направляются на анализ.

IV.1.7.1. Подготовка проб молока (сырого, свежего, пастеризованного, обезжиренного, цельного), сливок, сухого молока, молочных смесей, в том числе для детского питания (жидких, сухих)

Образцы продуктов в сухом виде при необходимости предварительно восстанавливают в воде в соответствии с указанием на этикетке (в нормативно-технической документации на продукт). Пробы нейтрализуют с помощью 0,5 М раствора NaOH, доводя уровень pH до 7,0 +/- 0,5, после чего центрифугируют в течение 5 мин при 2 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике в течение 20 — 30 минут).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант используют для дальнейшего анализа.

IV.1.7.1.1. Молоко (сырое, свежее, пастеризованное, цельное, обезжиренное), молоко восстановленное, сливки, молочные смеси, в том числе для детского питания (жидкие)

Обезжиренную пробу исследуемого продукта перемешивают на вортексе в течение 3 с, разбавляют в соотношении 1 : 10 (1 + 9) буфером для разбавления проб (п. IV.1.6.5) (например, 0,05 см3 молока + 0,45 см3 буфера для разбавления проб), перемешивают на вортексе в течение 3 с.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10, для сухих продуктов дополнительно учитывают коэффициент восстановления.

IV.1.7.1.2. Сухие молоко и молочные смеси, в том числе для детского питания

Навеску исследуемого сухого продукта массой 1 г разводят в деминерализованной воде до объема 10 см3 и перемешивают на вортексе до полного растворения.

Пробу исследуемого продукта центрифугируют в течение 5 мин при 2 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант отбирают в пустую пробирку.

Обезжиренный супернатант разбавляют в соотношении 1 : 10 (1 + 9) буфером для разбавления проб (IV.1.6.5) (например, 0,05 см3 молока + 0,45 см3 буфера для разбавления проб), перемешивают на вортексе в течение 3 с.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата (в пересчете на сухой продукт) учитывают фактор разбавления — 100.

IV.1.7.1.3. Сыр, творог, сливочное масло, спреды сливочно-растительные, растительно-сливочные

С поверхности образца сыра удаляют плесневый налет (при наличии). Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску исследуемого продукта массой 1 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, добавляют 4 см3 готового моющего буфера PBS-буфера с твином (IV.1.6.4). Пробирки термостатируют на водяной бане при температуре 50 — 55 °C до полного расплавления пробы, не менее 2 мин, после чего интенсивно перемешивают на вортексе в течение 10 — 15 с.

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Из пробирок удаляют образовавшийся верхний слой жира с помощью шпателя или стеклянной палочки, из обезжиренной средней части переносят 1 см3 пробы в пустую пробирку. Полученный экстракт разбавляют моющим буфером PBS-буфером с твином (п. IV.1.6.4) в соотношении 1 : 2 (например: 0,1 см3 нижней фазы + 0,1 см3 моющего буфера).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата (в пересчете на сухой продукт) учитывают фактор разбавления — 10.

IV.1.7.2. Подготовка проб мяса и субпродуктов скота и птицы

Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску исследуемого продукта массой 5 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, добавляют 20 см3 моющего буфера и перемешивают на вортексе в течение 10 с, затем перемешивают встряхиванием в течение 30 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Из пробирок удаляют образовавшийся верхний слой жира с помощью шпателя или стеклянной палочки, из обезжиренной надосадочной фазы переносят 1 см3 пробы в пустую пробирку. Полученный экстракт разбавляют моющим буфером PBS-буфером с твином (п. IV.1.6.4) в соотношении 1 : 10 (например: 0,05 см3 надосадочной фазы + 0,45 см3 моющего буфера).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата (в пересчете на сухой продукт) учитывают фактор разбавления — 50.

IV.1.7.3. Подготовка проб рыбы, продукции аквакультуры (рыба, креветки), кулинарных продуктов из рыбы с молочным компонентом для детского питания

Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску исследуемого продукта массой 5 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, добавляют 20 см3 моющего буфера и перемешивают на вортексе в течение 10 с, затем перемешивают встряхиванием в течение 30 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Из пробирок удаляют образовавшийся верхний слой жира с помощью шпателя или стеклянной палочки, из обезжиренной надосадочной фазы переносят 1 см3 пробы в пустую пробирку. Полученный экстракт разбавляют моющим буфером PBS-буфером с твином (п. IV.1.6.4) в соотношении 1 : 10 (например: 0,05 см3 надосадочной фазы + 0,45 см3 моющего буфера).

Полученный экстракт разбавляют моющим буфером PBS-буфером (п. IV.1.6.4) в соотношении 1 : 10 (например: 0,05 см3 нижней фазы + 0,45 см3 моющего буфера).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата (в пересчете на сухой продукт) учитывают фактор разбавления — 50.

IV.1.7.4. Подготовка проб меда

Навеску меда массой 1 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, добавляют 9 см3 экстракционного буфера (п. IV.1.6.8). Встряхивают до полного растворения меда.

Центрифугируют 10 мин при 3 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C), полученный прозрачный супернатант отбирают в пустую пробирку. Далее проводят очистку методом твердофазной экстракции с помощью колонок RIDA^{®} C18 в соответствии со следующей процедурой.

Очистка раствора меда методом твердофазной экстракции

При использовании колонок RIDA^{®} C18 кондиционирование их проводят следующим образом: колонку промывают со скоростью потока 1 кап./с сначала пропуская 2 см3 100%-го метанола, а затем 2 см3 дистиллированной воды, используя устройства для твердофазной экстракции (вакуумный манифолд) и руководствуясь инструкцией по его эксплуатации.

Примечание. При отсутствии устройства для твердофазной экстракции для создания давления воздуха на входе в колонку допускается использование пластикового шприца на 20 см3 с резиновой пробкой, соединенного с колонкой через стеклянный буферный цилиндр и пластиковый переходник.

После кондиционирования на подготовленную колонку наносят 5 см3 супернатанта и медленно продавливают через колонку со скоростью примерно 15 кап./мин.

После этого колонку промывают 3 см3 дистиллированной воды со скоростью потока 1 кап./с, удаляют остатки жидкости, продувая колонку потоком воздуха или азота в течение 2 мин.

Адсорбированные на колонке вещества осторожно, со скоростью 15 кап./мин, элюируют 1 см3 100%-го метанола в чистую пробирку. Элюирование пробы проводят медленно — со скоростью примерно 15 кап./мин.

Полученный элюат испаряют досуха при 60 °C в токе азота или воздуха, используя устройство для испарения.

Сухой остаток растворяют в 2 см3 PBS-буфера (п. IV.1.6.5) и тщательно перемешивают на вортексе, и затем разбавляют тем же буфером в соотношении 1 : 10 (например, 0,05 см3 нижней фазы + 0,45 см3 буфера).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 40.

В случае использования колонок C18 других производителей рекомендуется придерживаться следующей процедуры. Осуществляют предварительное кондиционирование колонки путем последовательного промывания: метанолом, водно-метанольными смесями и водой со скоростью потока 1 кап./с по следующей схеме:

1. промывают колонку 2 см3 метанола (100%);

2. промывают колонку 0,5 см3 смеси метанол/дистиллированная вода (75/25, об./об.);

3. промывают колонку 0,5 см3 смеси метанол/дистиллированная вода (50/50, об./об.);

4. промывают колонку 0,5 см3 смеси метанол/дистиллированная вода (25/75, об./об.);

5. промывают колонку 2 см3 дистиллированной воды.

Водные растворы метанола различной концентрации для кондиционирования колонок C18 должны быть приготовлены за 1 ч до использования. Для удаления воздушных пузырьков непосредственно перед использованием растворы перемешивают на вортексе.

Колонки, подготовленные таким образом, далее могут быть использованы аналогично колонкам RIDA^{®} C18 (арт. R2002).

IV.1.7.5. Подготовка проб биологически активных добавок к пище на основе переработки молочного сырья (с содержанием молочных ингредиентов более 90%)

Методика описывает пробоподготовку для БАД к пище на основе молочного сырья, не включающих в рецептуру веществ и соединений с антимикробными свойствами (соли йода, лизоцим и т.п.).

Экстракцию стрептомицина из исследуемых образцов БАД на основе переработки молочного сырья проводят следующим образом.

Все количество представительной пробы БАД в форме таблеток, капсул, порошка полностью измельчают в гомогенизаторе или в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. БАД в виде сухого порошка тщательного перемешивают в блендере.

Далее готовят 10%-ю суспензию гомогенизированной пробы, для этого 1 г навески сухого продукта разводят в 9 см3 дистиллированной воды, вновь тщательно перемешивают, встряхивают до полного растворения/суспендирования на вортексе в течение 1 мин и потом перемешивают в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

После чего берут 1 см3 (г) подготовленной 10%-й суспензии и проводят экстракцию по п. IV.1.7.1.2, как с гомогенизированной пробой (при пересчете на сухой продукт дополнительно учитывают коэффициент разбавления — 10).

При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 100.

IV.1.8. Проведение исследований при полуколичественном методе определения

IV.1.8.1. Общие положения

1. Раствор субстрата/хромогена светочувствителен, поэтому необходимо избегать попадания на него прямого света. При появлении окрашивания раствора субстрата/хромогена в голубоватый цвет реагент к работе непригоден.

2. Не допускается заменять реагенты в составе одного комплекта реагентами из другого комплекта с другим номером партии. Не допускается перекрестное использование реагентов из комплектов с разными номерами партий.

IV.1.8.2. Подготовка тест-системы к исследованиям

Подготовку тест-системы к исследованиям проводят следующим образом:

1. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов (8 микролунок скрепленных в одну полоску). Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить в холодильник при температуре 2 — 8 °C.

2. Перед использованием тест-системы доводят температуру всех реагентов до комнатной (20 — 25 °C) в течение 0,5 — 1 ч. Если в концентратах буфера и конъюгата образовались кристаллы, нужно растворить их путем встряхивания при комнатной температуре перед разведением этих реагентов.

3. Перед непосредственным использованием встряхивают каждый флакон с реагентами.

4. После использования реагенты тест-системы сразу убирают в холодильник.

5. На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

6. Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники автоматических дозаторов. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.

7. Каждый исследуемый раствор экстрактов испытуемых проб и градуировочных растворов анализируют в двух повторностях.

IV.1.8.3. Алгоритм проведения исследования

Анализ проводят поэтапно:

1. В рамку планшета вставляют необходимое количество микролунок, достаточное для всех растворов стандартов и растворов исследуемых проб при анализе в двух повторностях каждый. Записывают положения лунок со стандартами и исследуемыми растворами на бланке планшета.

2. Добавляют в выбранные пары лунок по 0,05 см3 каждой концентрации раствора стандарта, раствора подготовленной пробы продукта.

3. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 см3 конъюгата. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 30 мин в темном месте.

4. По окончании инкубации выливают жидкость из лунок, переворачивая рамку планшета, и тщательно выбивают капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного интенсивного постукивания рамки с лунками по столу (максимально выбивая капли из лунок), накрытому фильтровальной бумагой.

5. Заполняют лунки буфером для промывки (PBS-буфер с твином по п. IV.1.6.4), внося по 0,25 см3 в каждую лунку, используя восьмиканальный дозатор. После контакта выливают буфер для промывки из лунок и тщательно выбивают капельки жидкости. Процедура отмывки повторяется трижды.

Примечание. Необходимо следовать рекомендованной процедуре промывки и не допускать высыхания микролунок в процессе выполнения анализа.

6. После отмывания добавляют по 0,1 см3 смеси субстрата/хромогена в каждую лунку. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 15 мин в темном месте.

7. По окончании инкубации добавляют в каждую лунку по 0,1 см3 стоп-реагента. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и сразу после этого измеряют оптическую плотность в каждой лунке. Время от внесения стоп-реагента до измерения не должно превышать 15 мин.

IV.1.9. Учет и обработка результатов при полуколичественном методе определения

IV.1.9.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности содержимого лунок на планшетном фотометре (микропланшетном иммуноферментном анализаторе) при длине волны 450 нм. Оптическая плотность каждой лунки сравнивается с нулевым стандартом, значение которого принимается за 100%.

Величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, ниже 0,6 (A450нм < 0,6) является признаком порчи реагентов. Окрашивание красноватого раствора субстрата/хромогена в голубой цвет перед постановкой анализа также является признаком порчи реагентов. Результаты анализа в таком случае не учитываются.

IV.1.9.2. Для обработки результатов иммуноферментного анализа с помощью тест-систем имеется специальное программное обеспечение, рекомендованное изготовителем тест-системы. Пример стандартной калибровочной кривой дан в сертификате обеспечения качества на тест-систему.

Программное обеспечение выполняет построение градуировочной зависимости относительной оптической плотности B/B0 от натурального логарифма концентрации антибиотика:

B/B0 = a + b·lnX, где (1)

B — оптическая плотность раствора антибиотика;

B₀ - оптическая плотность 1-го градуировочного раствора с концентрацией антибиотика 0,00 нг/дм3;

X — концентрация антибиотика в растворе, нг/дм3.

Расчет коэффициентов линейной регрессии a и b проводится с помощью метода наименьших квадратов на основании пар значений B/B0, lnCi, полученных для пяти градуировочных растворов, где (i = 2...6), Ci — концентрация i-го градуировочного раствора, Bi — среднее значение оптической плотности, рассчитанное по двум значениям оптической плотности параллельных измерений i-го градуировочного раствора.

Массовая концентрация антибиотика в пробе рассчитывается на основании результатов измерений оптической плотности раствора подготовленной пробы, коэффициентов линейной регрессии и фактора разбавления по формуле:

X = F \cdot exp(\frac{\frac{B_{x}}{B_{0}} - a}{b}), где (2)

X — концентрация антибиотика в пробе, мкг/кг (мкг/дм3);

Bx — оптическая плотность, полученная при измерении раствора пробы;

F — фактор разведения пробы.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции r2 > 0,98.

IV.1.₉.3. Обработку результатов анализа без программного обеспечения проводят следующим образом.

Измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами образцов.

Вычисляют средние значения оптической плотности стандартных и исследуемых растворов, полученные по 2 параллельным микролункам в результате двух параллельных определений.

Относительную оптическую плотность (A) вычисляют по формуле:

A = \frac{B_{i}}{B_{0}} \times 100 , где (3)

A — значение относительной оптической плотности, выраженное в процентах от оптической плотности нулевого стандарта, % поглощения;

Bi — среднее значение оптической плотности стандартных растворов стрептомицина (или исследуемых растворов продуктов);

B₀ - среднее значение оптической плотности нулевого стандарта.

IV.1.₉.4. По величинам значений относительной оптической плотности, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим им значениям концентрации стрептомицина в мкг/дм3 строят калибровочную кривую (градуировочный график) в полулогарифмической системе координат.

IV.1.9.5. Концентрацию стрептомицина (x) в мкг/дм3 считывают по калибровочной кривой соответственно значениям оптической плотности, которые вычислены по формуле (3).

IV.1.9.6. Массовую концентрацию (содержание) антибиотика в мкг/кг в испытуемой пробе (X) рассчитывают по формуле:

X = \frac{F \cdot x}{\text{К}} , где (4)

X — массовая концентрация стрептомицина в испытуемой пробе, мг/кг (мг/дм3 для жидких продуктов);

x — массовая концентрация стрептомицина в экстракте испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, мкг/дм3;

F — фактор разбавления испытуемой пробы, приведенный в табл. 4.2;

К — коэффициент пересчета мкг/дм3 в мг/кг (мг/дм3 — для жидких проб), равный 1 000.

При выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой фактор разбавления принимает следующие значения (табл. 4.2).

Таблица 4.2

Факторы разбавления для расчета содержания стрептомицина в пробах различных продуктов

IV.1.10. Расчет результатов параллельных определений при полуколичественном методе определения

За результат полуколичественного анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений:

\overline{X} = \frac{X_{1} + X_{2}}{2} , где

X₁, X2 — результаты параллельных определений, мг/кг;

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг.

IV.1.11. Оформление результатов определений при полуколичественном методе определения

Если содержание компонента выше предела определения для соответствующего вида продукта (табл. 4.1), то результат анализа представляют в виде:

«стрептомицин в молоке обнаружен».

Если содержание компонента ниже предела определения для соответствующего вида продукта (табл. 4.1), то результат анализа представляют в виде:

«стрептомицин в молоке не обнаружен».

IV.1.12. Подтверждение результатов полуколичественного определения

При обнаружении стрептомицина в исследуемых продуктах при исследовании полуколичественным методом на уровне МДУ и выше необходимо подтверждение полученного результата с использованием любого аттестованного метода (например, ВЭЖХ-МС).

Приложение IV (рекомендуемое)

КОМПЛЕКТАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРЕПТОМИЦИНА

(на примере RIDASCREEN® Streptomycin арт. R3104) <8>

<8> Допускается использование других тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Тест-система для определения стрептомицина по технологии ИФА на 96 определений с внутренним стандартом, включающая следующие компоненты:

1. Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов с 8 отделяемыми лунками каждый), сенсибилизированных антителами «захвата», в упаковке из фольги в комплекте с влагопоглотителем.

2. Комплект стандартных концентрированных растворов стрептомицина готовые к использованию со следующими концентрациями: 0; 0,5; 1,5; 4,5; 13,5; 40,5 мкг/дм3 в воде по 1,3 см3 — 6 шт.

3. Конъюгат, готовый к использованию — 6 см3.

4. Смесь субстрата с хромогеном содержит пероксид карбамида и тетраметилбензидин, готовая к использованию — 10 см3.

5. Стоп-реагент, содержит 1 н серную кислоту — 14 см3.

6. Моющий буфер в виде сухой соли для приготовления 10 мМ фосфатного буфера, pH 7,4, содержащей 0,05% твина (PBS-буфер с твином) — 1 пакет.

Наборы рассчитаны на проведение анализа в 2 повторностях 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).

Специфичность методики определения стрептомицина, установленная по перекрестной чувствительности к исследованным антибиотикам в буферной системе, (на примере RIDASCREEN® Streptomycin арт. R3104), представлена ниже.

Специфичность к антибиотикам других тест-систем может отличаться от указанной выше, данная информация должна содержаться в прилагаемом описании тест-систем.

IV.2. Определение аминогликозидов (стрептомицин) методами подтверждающего анализа на основе ВЭЖХ-МС

IV.2.1. Назначение и область применения

Определение остаточного содержания стрептомицина проводится в молоке и молочных продуктах, яйцах, яичном порошке, яичном меланже, мясе, мясных продуктах и продуктах из мяса птицы, меде, рыбе и в продовольственном сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием по ГОСТ 32798-14 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания аминогликозидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором».

IV.2.2. Особенности и условия применения метода ВЭЖХ-МС

Особенностью применения метода ВЭЖХ-МС в данном случае является то, что метод может обеспечить надежное определение антибиотика на уровнях близких к уровням МДУ. Это связано с тем, что в отличие от пищевого сырья, представляющего потенциальную опасность по содержанию антибиотиков, конечная продукция содержит в большинстве случаев продукцию животноводства, рыболовства, пчеловодства, птицеводства в разбавленном виде. Практически единственным исключением является ряд молочных продуктов. В ситуации разбавления пищевого сырья — потенциального источника антибиотиков, метод определения, представленный в ГОСТ 32798-14 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания аминогликозидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» является качественным, подтверждающим присутствие антибиотика, обнаруженного методом ИФА, в пробе.

Условия применения метода по ГОСТ 32798-14 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания аминогликозидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» в качестве подтверждающего:

1. Обнаружение содержания антибиотика в пробе пищевого продукта на уровне МДУ, выше уровня МДУ и ниже уровня МДУ. При этом в расчет берется ошибка метода определения ИФА. В случае присутствия антибиотика в пробе продукта в количествах ниже МДУ, но если определенное количество в интервале ошибки метода определения равно или выше МДУ, необходимо проведение подтверждения присутствия антибиотика методом ВЭЖХ-МС.

2. Идентификация присутствия антибиотика проводится без использования внутреннего стандарта (ввиду отсутствия необходимости проведения количественного анализа).

3. Идентификация присутствия антибиотика проводится как по совпадению времени удерживания (совпадающего со временем удерживания стандарта при одинаковых условиях хроматографирования), так и по совпадению молекулярного и дочерних ионов, полученных масс-спектрометрией элюата.

4. Возможно дополнительное подтверждение присутствия антибиотика в продукте «методом добавки». Метод заключается в предварительном дополнительном внесении в пробу, в которой присутствует антибиотик, определенный методом ИФА, дополнительного количества антибиотика. При этом при хроматографировании пробы должны наблюдаться совпадения времени удерживания пиков антибиотика пробы и антибиотика добавленного, что выражается в следующем: отсутствие дополнительных вершин пиков (расщепление), отсутствие каких-либо изменений формы пиков.

Проведение подтверждения «методом добавки» является дополняющим, т.е. пункт 4 только дополняет пункты 2 - 3 и проводится после выполнения идентификации по пунктам 2 - 3.

Метод по ГОСТ 32798-14 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания аминогликозидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» может быть использован для подтверждения присутствия или отсутствия аминогликозидов в случае внутреннего контроля содержания антибиотиков на предприятии (при входном контроле продуктов переработки животноводства, рыболовства, пчеловодства, птицеводства). При этом объектом контроля служат продукты переработки, не являющиеся продукцией, предназначенной для реализации населению.

IV.2.3. Критерии оценки результатов

Критерии оценки:

1. Присутствие антибиотика в исследованной пробе считается подтвержденным, если выполнены следующие критерии:

а) обнаруженное вещество в составе образца совпадает как по времени удерживания, так и по молекулярным и дочерним ионам со сравнительными величинами, полученными при хроматографическом разделении и масс-спектрометрии стандарта антибиотика;

б) соотношение сигнал/шум полученного пика определяемого антибиотика в хроматограмме составляет 3 и более.

2. Отсутствие антибиотика в исследуемой пробе считается подтвержденным в случае невыполнения критериев а), б).

Возможна дополнительная идентификация «методом добавки».

IV.2.4. Сведения о метрологической аттестации используемого метода

Данные о метрологической аттестации метода по ГОСТ 32798-14 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания аминогликозидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором»:

• Номер в реестре сведений об аттестованных методиках (методах) измерений ФР.1.31.2016.23061.
• Свидетельство № 01.00225/205-09-16 от 17.03.2016.

Раздел V. Определение остаточных количеств пенициллинов в пищевой продукции животного происхождения

V.1. Методика полуколичественного определения остаточных количеств пенициллинов в пищевой продукции животного происхождения методом иммуноферментного анализа

V.1.1. Область применения полуколичественного метода определения

В настоящем разделе методических указаний установлен порядок полуколичественного определения остаточных количеств стрептомицина методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией результатов (при 450 нм) (далее — ИФА) для следующих групп пищевых продуктов животного происхождения:

1. Молоко и молочные продукты

а) молоко, сливки (сырые, питьевые, сухие, концентрированные). Пределы обнаружения пенициллинов (по стандартному веществу): молоко — 0,0003 мг/дм3; сливки — 0,001 мг/дм3;

б) продукты переработки молока (молочные смеси, в том числе для детского питания, сгущенное и концентрированное молоко, масло из коровьего молока, спреды сливочно-растительные, сыр, продукты кисломолочные: напитки на основе сыворотки (без добавок/с фруктами), сметана, творог, йогурт, кефир). Пределы обнаружения пенициллинов (по стандартному веществу): детское питание (восстановленное) — 0,0003 мг/кг; масло из коровьего молока, спреды сливочно-растительные и сыр — 0,002 мг/кг; сгущенное и концентрированное молоко, напитки на основе сыворотки — 0,001 мг/дм3; напитки на основе сыворотки фруктовые — 0,001 мг/дм3; творог и сметана — 0,0025 мг/кг; йогурт (без добавок/фруктовый) и кефир — 0,003 мг/кг.

2. Мясо и мясопродукты, в том числе птицы

Мясо и субпродукты скота и птицы. Пределы обнаружения пенициллинов (по стандартному веществу) примерно: 0,0025 мг/кг.

3. Рыба и рыбная продукция, продукция аквакультуры

а) рыба и рыбная продукция, продукция аквакультуры (рыба, креветки) сырая. Пределы обнаружения пенициллинов (по стандартному веществу) примерно: рыба — 0,0025 мг/кг, креветки — 0,003 мг/кг;

б) кулинарные продукты из рыбы с молочным компонентом для детского питания. Пределы обнаружения пенициллинов (по стандартному веществу) примерно: 0,0025 мг/кг.

4. Масло-жировая продукция (спреды растительно-сливочные)

Пределы обнаружения пенициллинов (по стандартному веществу) примерно: 0,002 мг/кг.

5. Биологически активные добавки к пище на основе переработки молочного сырья, не включающие в рецептуру веществ и соединений с антимикробными свойствами (соли йода, лизоцим и т.п.) (с содержанием молочных ингредиентов более 90%). Пределы определения пенициллинов (по стандартному веществу), мг/кг: 0,003 (в пересчете на сухой продукт).

V.1.2. Методика измерений при полуколичественном методе определения

В основе принципа действия тест-системы лежит реакция «антиген — антитело». Лунки микротитровального планшета покрыты антителами захвата к антителам на ампициллин. В лунки дозируют растворы стандартов или проб, антитела к ампициллину и конъюгат ампициллина. Свободный ампициллин и ампициллин из ферментного конъюгата конкурируют за места связывания антител (конкурентный иммуноферментный анализ). Антитела к ампициллину связываются иммобилизированными антителами захвата. Все несвязанные молекулы конъюгата удаляются на этапе отмывки. В лунки вносят раствор субстрат/хромогена и инкубируют. Связанные молекулы конъюгата преобразуют хромоген в окрашенные в синий продукты реакции. Внесение стоп-раствора ведет к изменению окраски от синего к желтому. Измерение выполняют фотометрически при 450 нм. Оптическая плотность обратно пропорциональна концентрации ампициллина в пробе.

V.1.3. Пределы полуколичественного метода определения

Пределы полуколичественного определения остаточных количеств стрептомицина в пищевых продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа представлены в табл. 5.1.

Таблица 5.1

Пределы полуколичественного метода определения остаточных количеств пенициллинов в пищевых продуктах методом ИФА

V.1.4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы, реактивы и тест-системы при полуколичественном методе определения

V.1.4.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

V.1.4.2. Вспомогательные устройства, посуда и материалы

<9> Пересчет относительного центробежного ускорения (в единицах g) (ОЦУ/RFS) в скорость центрифугирования (об./мин) приведен в Приложении для всех разделов.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств, посуды и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

V.1.4.3. Реактивы

Примечание. Допускается применение других химических реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

V.1.4.4. Тест-система для иммуноферментного анализа

Тест-система для непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА), укомплектованная в соответствии с Приложением V (рекомендуемое).

Примечание. Допускается использование других тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

V.1.5. Требования безопасности, квалификация операторов и условия выполнения измерений при полуколичественном методе определения

1. Исследования пищевых продуктов с использованием методики ИФА проводят с соблюдением требований техники безопасности, установленных для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007), а также в инструкции по использованию тест-наборов.

2. При выполнении измерений с использованием планшетного иммуноферментного анализатора и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцию по эксплуатации прибора.

3. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области иммуноферментного анализа. К проведению анализа допускается только персонал, ознакомленный с руководством по эксплуатации планшетного иммуноферментного анализатора и освоивший данную методику.

5. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• температура окружающего воздуха: от 20 до 30 °C;
• относительная влажность воздуха: от 40 до 80%.

V.1.6. Подготовка к исследованию при полуколичественном методе определения

V.1.6.1. Подготовка стеклянной посуды

При подготовке к проведению исследований лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

V.1.6.2. Подготовка оборудования

Подготовку и проверку фотометра и pH-метра проводят в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

V.1.6.3. Хранение и использование наборов и реагентов

Тест-системы для ИФА хранят при температуре 2 — 8 °C, не допуская подмораживания компонентов. Использовать набор допускается только в пределах срока годности.

V.1.6.4. Приготовление буфера для разбавления

Разбавить концентрат буфера для разбавления стандартных растворов, конъюгата, антител, проб, имеющийся в комплекте, в соотношении 1 : 4 (1 + 3) деминерализованной водой (например, 10 см3 концентрата + 30 см3 деминерализованной воды). Разбавленный буфер для разбавления стандартов, проб, антител и конъюгата может храниться при 2 — 8 °C до истечения срока годности, указанного на концентрате.

V.1.6.5. Приготовление моющего буфера

Разбавить концентрат моющего буфера в соотношении 1 : 20 (1 + 19) деминерализованной водой (например, 2 см3 концентрата + 38 см3 деминерализованной воды, достаточно для 4 микротитровальных стрипов, т.е. 32 лунок). Разбавленный буфер может храниться при 2 — 8 °C до конца срока годности, указанного на концентрате.

V.1.6.6. Приготовление 0,5 н раствора гидроокиси натрия

Навеску гидроокиси натрия массой 5 г разводят в мерной колбе объемом 250 см3 дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

V.1.6.7. Приготовление раствора для экстракции пенициллинов

В колбу вместимостью 25 см3 приливают 9,4 см3 метанола, 9,4 см3 ацетонитрила и 6,2 см3 буферного раствора для разбавления проб (п. V.1.6.4). Раствор тщательно перемешивают.

V.1.7. Подготовка проб пищевых продуктов для полуколичественного метода определения

1. Отбор проб осуществляют в соответствии МУК 4.1.3534-18 «Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов».

2. Хранение и транспортирование экстрактов, подготовленных для ИФА.

Готовые экстракты допускается хранить до начала анализа в пределах одной лаборатории при температуре от 2 до 8 °C не более 1 суток. Допускается транспортирование материала при температуре от 2 до 8 °C в течение 1 суток. Доставленные в лабораторию образцы в виде экстрактов хранению не подлежат и сразу направляются на анализ.

V.1.7.1. Подготовка проб молока (сырое, питьевое, сухое, обезжиренное, цельное), сухого молока, молочных смесей, в том числе для детского питания

Образцы продуктов в сухом виде предварительно восстанавливают в воде в соответствии с указанием на этикетке (в нормативно-технической документации на продукт). Пробы нейтрализуют с помощью 0,5 М раствора гидроокиси натрия (п. V.1.6.6), доводя уровень pH до 7,0 +/- 0,5.

V.1.7.1.1. Молоко и молочные продукты с содержанием жира <= 1,5%

Пробу исследуемого продукта перемешивают на вортексе в течение 3 с, разбавляют в соотношении 1 : 2 (1 + 1) буфером для разбавления проб (п. V.1.6.4) (например, 1 см3 молока + 1 см3 буфера для разбавления проб), перемешивают на вортексе в течение 3 с.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 2, для сухих продуктов дополнительно учитывают коэффициент восстановления.

V.1.7.1.2. Молоко и молочные продукты с содержанием жира > 1,5%

Пробу исследуемого продукта центрифугируют в течение 5 мин при 2 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант отбирают в пустую пробирку.

Обезжиренный супернатант разбавляют в соотношении 1 : 2 (1 + 1) буфером для разбавления проб (п. V.1.6.4) (например, 1 см3 молока + 1 см3 буфера для разбавления проб), перемешивают на вортексе в течение 3 с.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 2, для сухих продуктов дополнительно учитывают коэффициент восстановления.

V.1.7.1.3. Сухое молоко, молочные смеси, в том числе для детского питания

Навеску исследуемого сухого продукта массой 1 г разводят в деминерализованной воде до объема 10 см3 и перемешивают на вортексе до полного растворения.

Пробу исследуемого продукта центрифугируют в течение 5 мин при 2 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант отбирают в пустую пробирку.

Обезжиренный супернатант разбавляют в соотношении 1 : 2 (1 + 1) буфером для разбавления проб (п. V.1.6.4) (например, 1 см3 восстановленного детского питания + 1 см3 буфера для разбавления проб), перемешивают на вортексе в течение 3 с.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата (в пересчете на сухой продукт) учитывают фактор разбавления — 20.

V.1.7.2. Подготовка проб молочных продуктов

V.1.7.2.1. Сгущенное и концентрированное молоко, напитки на основе сыворотки (без добавок/с фруктами)

Пробу исследуемого продукта разбавляют в соотношении 1 : 10 (1 + 9) буфером для разбавления проб (п. V.1.6.4) (например, 0,2 см3 пробы + ,8 см3 буфера для разбавления проб), перемешивают на вортексе в течение 3 с.

Далее используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10.

V.1.7.2.2. Сливки, кисломолочные продукты: творог, сметана, йогурт (без наполнителя/фруктовый), кефир

К пробе исследуемого продукта массой 5 г добавляют 20 см3 деминерализованной воды, гомогенизируют на вортексе и центрифугируют 10 мин при 4 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант отбирают в пустую пробирку.

Обезжиренный супернатант разбавляют 1 : 4 (1 + 3) буфером для разбавления проб (п. V.1.6.4) (например, 0,5 см3 нижней водной фазы + 1,5 см3 буфера для разбавления проб).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 20.

V.1.7.2.3. Сливочное масло, спреды сливочно-растительные

Навеску исследуемого продукта массой 5,0 г вносят в центрифужную пробирку объемом 50 см3, приливают 20 см3 деминерализованной воды и инкубируют при 40 °C на водяной бане до полного расплавления, после чего гомогенизируют с помощью вортекса.

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, нижнюю фазу отбирают в пустую пробирку.

Нижнюю фазу разбавляют в соотношении 1 : 4 (1 + 3) буфером для разбавления проб (п. V.1.6.4) (например, 0,5 см3 нижней водной фазы + 1,5 см3 буфера для разбавления проб).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 20.

V.1.7.2.4. Твердые и мягкие сыры

С поверхности образца сыра удаляют плесневый налет (при наличии).

Навеску исследуемого продукта массой 5 г вносят в центрифужную пробирку объемом 50 см3, приливают 20 см3 деминерализованной воды и тщательно гомогенизируют в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, надосадочную фазу отбирают в пустую пробирку.

Надосадочную фазу разбавляют в соотношении 1 : 4 (1 + 3) буфером для разбавления проб (п. V.1.6.4) (например, 0,5 см3 нижней водной фазы + 1,5 см3 буфера для разбавления проб).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 20.

V.1.7.3. Подготовка проб мяса и субпродуктов скота и птицы

Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Навеску гомогенизированной пробы массой 1 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, прибавляют 4 см3 деминерализованной воды, тщательно перемешивают на вортексе, а затем перемешивают встряхиванием в течение 15 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Центрифугируют 10 мин при 2 000 g при температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, надосадочную фазу отбирают в пустую пробирку.

Надосадочную фазу разбавляют в соотношении 1 : 4 (1 + 3) буфером для разбавления проб (п. V.1.6.4) (например, 0,05 см3 пробы + 0,15 см3 буфера для разбавления проб).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 20.

Примечание. При проведении пробоподготовки с использованием гексана для исключения ложноположительных результатов необходимо использовать отрицательный контроль. При подготовке отрицательного контроля вместо пробы вносят соответствующий объем дистиллированной воды и проводят все процедуры экстракции, как с исследуемым образцом, с последующим внесением в лунку планшета. При расчете конечного результата полученные значения вычитают из значений исследованного образца (для расчета используют тот же фактор разбавления).

V.1.7.4. Подготовка проб рыбы и рыбной продукции, продукции аквакультуры (рыба, креветки) (сырой, охлажденной, мороженной, варено-мороженной), кулинарных продуктов из рыбы с молочным компонентом для детского питания

Полностью гомогенизируют все количество представительной пробы в гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке.

Экстракцию проводят по п. V.1.7.3.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 40.

V.1.7.5. Подготовка проб спредов растительно-сливочных

Пробоподготовку (экстракцию) проводят по п. V.1.7.2.3 (Сливочное масло, спреды сливочно-растительные).

V.1.7.6. Подготовка проб биологически активных добавок к пище на основе переработки молочного сырья (с содержанием молочных ингредиентов более 90%)

Методика описывает пробоподготовку для БАД к пище на основе молочного сырья, не включающих в рецептуру веществ и соединений с антимикробными свойствами (соли йода, лизоцим и т.п.).

Экстракцию пенициллинов из исследуемых образцов БАД на основе переработки молочного сырья проводят следующим образом.

Все количество представительной пробы БАД в форме таблеток, капсул, порошка полностью измельчают в гомогенизаторе или в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. БАД в виде сухого порошка тщательного перемешивают в блендере.

Далее готовят 10%-ю суспензию гомогенизированной пробы, для этого 1 г навески сухого продукта разводят в 9 см3 дистиллированной воды, вновь тщательно перемешивают, встряхивают до полного растворения/суспендирования на вортексе в течение 1 мин и потом перемешивают в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

После чего берут 1 г (см3) подготовленной 10%-й суспензии и проводят экстракцию по п. V.1.7.1, как с гомогенизированной пробой (при пересчете на сухой продукт дополнительно учитывают коэффициент разведения — 10).

При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 20.

V.1.8. Проведение исследований при полуколичественном методе определения

V.1.8.1. Общие положения

1. Раствор субстрата/хромогена светочувствителен, поэтому необходимо избегать попадания на него прямого света. При появлении окрашивания раствора субстрата/хромогена в голубоватый цвет реагент к работе непригоден.

2. Не допускается заменять реагенты в составе одного комплекта реагентами из другого комплекта с другим номером партии. Не допускается перекрестное использование реагентов из комплектов с разными номерами партий.

V.1.8.2. Подготовка тест-системы к исследованиям

Подготовку тест-системы к исследованиям проводят следующим образом:

1. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов (8 микролунок скрепленных в одну полоску). Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить в холодильник при температуре 2 — 8 °C.

2. Перед использованием тест-системы доводят температуру всех реагентов до комнатной (20 — 25 °C) в течение 0,5 — 1 ч. Если в концентратах буфера и конъюгата образовались кристаллы, нужно растворить их путем встряхивания при комнатной температуре перед разведением этих реагентов.

3. Перед непосредственным использованием встряхивают каждый флакон с реагентами.

4. После использования реагенты тест-системы сразу убирают в холодильник.

5. На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

6. Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники автоматических дозаторов. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.

7. Каждый исследуемый раствор экстрактов испытуемых проб и градуировочных растворов анализируют в двух повторностях.

V.1.8.3. Подготовка реагентов к исследованиям

V.1.8.3.1. Антитела к ампициллину поставляются в концентрированном виде. Так как разбавленный раствор антител обладает ограниченной стабильностью, перед исследованием необходимо восстанавливать строго то количество антител, которое необходимо для анализа.

Пробирку с антителами центрифугируют в течение краткого периода времени — 1 мин при 1 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). Для восстановления разбавляют концентрат в соотношении 1 : 100 (1 + 99) буфером для разбавления антител (п. V.1.6.4) (например, 0,010 см3 концентрата антител + 0,99 см3 буфера для разбавления антител, такого количества достаточно для 4 стрипов, т.е. 32 лунок).

V.1.8.3.2. Ферментный конъюгат ампициллина поставляется в концентрированном виде. Так как разбавленный раствор конъюгата обладает ограниченной стабильностью, то перед исследованием необходимо восстанавливать строго то количество антител, которое необходимо для анализа.

Пробирку с конъюгатом центрифугируют в течение краткого периода времени — 1 мин при 1 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). Для восстановления разбавить концентрат в соотношении 1 : 100 (1 + 99) буфером для разбавления антител (п. V.1.6.4) (например, 0,010 см3 концентрата антител + 0,99 см3 буфера для разбавления конъюгата, достаточно на 4 стрипа, т.е. 32 лунок).

V.1.8.3.3. Стандарт ампициллина поставляется в виде лиофилизата. Для восстановления лиофилизата необходимо в 1 флакон со стандартом добавить 2 см3 готового буфера для разбавления стандартов (п. V.1.6.4), при этом получится стандарт 7 с концентрацией пенициллина 4 нг/см3 (или 0,004 мкг/см3). Далее готовят стандарты 2 — 6, выполнив серию разбавлений по приведенной схеме:

Буфер для разбавления стандартов (п. V.1.6.4) используется как стандарт 1 = 0 нг/см3.

Для экономичного расходования приготовленных стандартов допускается разделить стандарты на аликвоты и заморозить их при -20 °C, в таком виде их можно хранить до 1 недели. Не допускается повторное замораживание — оттаивание стандартов.

V.1.8.4. Алгоритм проведения исследования

Анализ проводят поэтапно.

1. В рамку планшета вставляют необходимое количество микролунок, достаточное для всех растворов стандартов и растворов исследуемых проб при анализе в двух повторностях каждый. Записывают положения лунок со стандартами и исследуемыми растворами на бланке планшета.

2. Добавляют в выбранные пары лунок по 0,05 см3 каждой концентрации раствора стандарта и раствора подготовленной пробы продукта.

3. Затем в каждую лунку добавляют по 0,025 см3 разбавленного ферментного конъюгата (п. V.1.8.3.2).

4. Далее в каждую лунку добавляют по 0,025 см3 разбавленного раствора антител (п. V.1.8.3.1). Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при температуре (4 +/- 2) °C (в холодильнике) в течение 1 часа в темном месте.

5. По окончании инкубации выливают жидкость из лунок, переворачивая рамку планшета, и тщательно выбивают капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного интенсивного постукивания рамки с лунками по столу (максимально выбивая капли из лунок), накрытому фильтровальной бумагой.

6. Заполняют лунки моющим буфером (п. V.1.6.5), внося по 0,3 см3 в каждую лунку, используя восьмиканальный дозатор. После контакта выливают буфер для промывки из лунок и тщательно выбивают капельки жидкости. Процедура отмывки повторяется трижды.

Примечание. Необходимо следовать рекомендованной процедуре промывки и не допускать высыхания микролунок в процессе выполнения анализа.

7. После отмывания добавляют по 0,1 см3 смеси субстрата/хромогена в каждую лунку. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 30 минут в темном месте.

8. По окончании инкубации добавляют в каждую лунку по 0,1 см3 стоп-реагента. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, немедленно измеряют оптическую плотность в каждой лунке.

V.1.9. Учет и обработка результатов при полуколичественном методе определения

V.1.9.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности на микропланшетном иммуноферментном анализаторе (планшетный фотометр, ридер) при длине волны 450 нм против нулевого стандарта, значение которого принимается за 100%.

Величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, ниже 0,8 (A450нм < 0,8) является признаком порчи реагентов. Окрашивание красноватого раствора субстрата/хромогена в голубой цвет перед постановкой анализа также является признаком порчи реагентов. Результаты анализа в таком случае не учитываются.

Измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами образцов.

V.1.9.2. Для обработки результатов иммуноферментного анализа используется специальное программное обеспечение, рекомендованное изготовителем тест-системы. Пример стандартной калибровочной кривой дан в сертификате обеспечения качества на тест-систему.

Программное обеспечение выполняет построение градуировочной зависимости относительной оптической плотности B/B0 от натурального логарифма концентрации антибиотика:

B/B0 = a + b·lnX, где (1)

B — оптическая плотность раствора антибиотика;

B0 — оптическая плотность 1-го градуировочного раствора с концентрацией антибиотика 0,00 мкг/дм3;

X — концентрация антибиотика в растворе, мкг/дм3 (нг/см3).

Расчет коэффициентов линейной регрессии a и b проводится с помощью метода наименьших квадратов на основании пар значений B/B0, lnCi, полученных для пяти градуировочных растворов, где (i = 2...6), Ci — концентрация i-го градуировочного раствора, Bi — среднее значение оптической плотности, рассчитанное по двум значениям оптической плотности параллельных измерений i-го градуировочного раствора.

Массовая концентрация антибиотика в пробе рассчитывается на основании результатов измерений оптической плотности раствора подготовленной пробы, коэффициентов линейной регрессии и фактора разбавления по формуле:

X = F \cdot exp(\frac{\frac{B_{x}}{B_{0}} - a}{b}), где (2)

X — концентрация антибиотика в пробе, мкг/кг (мкг/дм3) (нг/г (нг/см3);

Bx — оптическая плотность, полученная при измерении раствора пробы;

F — фактор разбавления пробы.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции r2 > 0,98.

V.1.9.3. Обработку результатов анализа без программного обеспечения проводят следующим образом.

Измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами образцов.

Вычисляют средние значения оптической плотности стандартных и исследуемых растворов, полученные по 2 параллельным микролункам в результате двух параллельных определений.

Относительную оптическую плотность (A) вычисляют по формуле:

A = \frac{B_{i}}{B_{0}} \times 100 , где (3)

A — значение относительной оптической плотности, выраженное в процентах от оптической плотности нулевого стандарта, % поглощения;

Bi — среднее значение оптической плотности стандартных растворов пенициллина (или исследуемых растворов продуктов);

B0 — среднее значение оптической плотности нулевого стандарта.

V.1.9.4. По величинам значений относительной оптической плотности, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим им значениям концентрации пенициллина в мкг/дм3, строят калибровочную кривую (градуировочный график) в полулогарифмической системе координат.

V.1.9.5. Концентрацию пенициллина (x) в мкг/дм3 (нг/см3) считывают по калибровочной кривой соответственно значениям оптической плотности, которые вычислены по формуле (3).

V.1.9.6. Массовую концентрацию (содержание) пенициллина в испытуемой пробе (X) рассчитывают по формуле:

X = \frac{F \cdot x}{\text{К}} , где (4)

X — массовая концентрация пенициллина в испытуемой пробе, мг/кг (мг/дм3 — для жидких продуктов);

x — массовая концентрация пенициллина в экстракте испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, мкг/дм3;

F — фактор разбавления испытуемой пробы, приведенный в табл. 5.2;

К — коэффициент пересчета мкг/дм3 в мг/кг (мг/дм3 — для жидких проб), равный 1 000.

Таблица 5.2

Факторы разбавления для расчета содержания пенициллинов в различных пробах

V.1.10. Расчет результатов параллельных определений при полуколичественном методе определения

За результат полуколичественного анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений:

\overline{X} = \frac{X_{1} + X_{2}}{2} , где

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг.

V.1.11. Оформление результатов определений при полуколичественном методе определения

Если содержание компонента выше предела определения для соответствующего вида продукта (табл. 5.1), то результат анализа представляют в виде:

«пенициллины в молоке обнаружены».

Если содержание компонента ниже предела определения для соответствующего вида продукта (табл. 5.1), то результат анализа представляют в виде:

«пенициллины в молоке не обнаружены».

V.1.12. Подтверждение результата полуколичественного метода определения

При обнаружении пенициллина в исследованных образцах пищевых продуктов полуколичественным методом анализа на уровне МДУ и выше необходимо подтверждение полученного результата с использованием любого аттестованного метода (например, ВЭЖХ-МС).

Приложение V (рекомендуемое)

КОМПЛЕКТАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕНИЦИЛЛИНОВ

(на примере Penicillin ELISA, арт. 5091PEN) <10>

<10> Допускается использование других тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Набор для определения пенициллина по технологии ИФА на 96 определений с внутренним стандартом включает следующие компоненты:

1. Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов с 8 отделяемыми лунками каждый), сенсибилизированных антителами «захвата», в упаковке из фольги в комплекте с влагопоглотителем.

2. Стандарт в лиофилизированном виде 0,004 мкг/см3 — 3 шт.

3. Конъюгат, концентрат (x100) — 0,1 см3.

4. Антитела, концентрат (x100) — 0,1 см3.

5. Субстрат/хромоген — 12 см3.

6. Готовая смесь субстрата с хромогеном содержит пероксид карбамида и тетраметилбензидин — 12 см3.

7. Стоп-реагент, содержит 1 н серную кислоту — 15 см3.

8. Буфер для разбавления стандартных растворов, конъюгата, антител, образцов, концентрат (x4) — 25 см3.

9. Моющий буфер, концентрат (x20) — 30 см3.

Набор рассчитан на проведение анализа в 2 повторностях 41 исследуемого образца и 7 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).

Специфичность методики определения пенициллина, установленная по перекрестной чувствительности к исследованным антибиотикам в буферной системе (на примере Penicillin ELISA, арт. 5091PEN), представлена ниже.

Специфичность к антибиотикам других тест-систем может отличаться от указанной выше, данная информация должна содержаться в прилагаемом описании тест-систем.

V.2. Определение пенициллинов методами подтверждающего анализа (на основе ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС)

V.2.1. Назначение и область применения

Определение остаточного содержания пенициллинов проводится в молоке и молочных продуктах, яйцах и яичных продуктах, мясе, мясных продуктах и продуктах из мяса птицы, меде, рыбе и морепродуктах и в продовольственном сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС) по ГОСТ Р 54904-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором».

Диапазон определяемых содержаний — 1,0 — 1 000,0 мкг/кг.

V.2.2. Особенности и условия применения метода ВЭЖХ-МС

Особенностью применения метода ВЭЖХ-МС в данном случае является то, что метод может обеспечить надежное определение антибиотиков на уровнях близких к уровням МДУ. Это связано с тем, что в отличие от пищевого сырья, представляющего потенциальную опасность по содержанию антибиотиков, конечная продукция содержит в большинстве случаев продукцию животноводства, рыболовства, пчеловодства, птицеводства в разбавленном виде. Практически единственным исключением является ряд молочных продуктов. В ситуации разбавления пищевого сырья — потенциального источника антибиотиков, метод определения, представленный в ГОСТ Р 54904-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» является качественным, подтверждающим присутствие антибиотиков, обнаруженных методом ИФА, в пробе.

Условия применения метода по ГОСТ Р 54904-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» в качестве подтверждающего следующие:

1. Обнаружение содержаний антибиотиков в пробе пищевого продукта на уровне МДУ, выше уровня МДУ и ниже уровня МДУ. При этом в расчет берется ошибка метода определения ИФА. В случае присутствия антибиотиков в пробе продукта в количествах ниже МДУ, но если определенное количество в интервале ошибки метода определения равно или выше МДУ, необходимо проведение подтверждения присутствия антибиотика методом ВЭЖХ-МС.

2. Идентификация присутствия антибиотиков проводится без использования внутреннего стандарта (ввиду отсутствия необходимости проведения количественного анализа).

3. Идентификация присутствия антибиотиков проводится как по совпадению времени удерживания (совпадающего со временем удерживания стандарта при одинаковых условиях хроматографирования), так и по совпадению молекулярного и дочерних ионов, полученных масс-спектрометрией элюата.

4. Возможно дополнительное подтверждение присутствия антибиотиков в продукте «методом добавки». Метод заключается в предварительном дополнительном внесении в пробу, в которой присутствуют антибиотики, определенные методом ИФА, дополнительного количества антибиотиков. При этом при хроматографировании пробы должны наблюдаться совпадения времен удерживания пиков антибиотиков пробы и антибиотиков добавки, что выражается в следующем: отсутствие дополнительных вершин пиков (расщепление), отсутствие каких-либо изменений формы пиков.

Проведение подтверждения «методом добавки» является дополняющим, т.е. пункт 4 только дополняет пункты 2 - 3 и проводится после выполнения идентификации по пунктам 2 - 3.

Метод по ГОСТ Р 54904-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» может быть использован для подтверждения присутствия или отсутствия пенициллинов в случае внутреннего контроля содержания антибиотиков на предприятии (при входном контроле продуктов переработки животноводства, рыболовства, пчеловодства, птицеводства). При этом объектом контроля служат продукты переработки, не являющиеся продукцией, предназначенной для реализации населению.

V.2.3. Критерии оценки результатов

Критерии оценки:

1. Присутствие антибиотиков в исследованной пробе считается подтвержденным, если выполнены следующие критерии:

а) обнаруженные вещества в составе образца совпадают как по времени удерживания, так и по молекулярным и дочерним ионам со сравнительными величинами, полученными при хроматографическом разделении и масс-спектрометрии стандартов антибиотиков;

б) соотношение сигнал/шум полученных пиков определяемых антибиотиков в хроматограмме составляет 3 и более.

2. Отсутствие антибиотиков в исследуемой пробе считается подтвержденным в случае невыполнения критериев а), б).

Возможна дополнительная идентификация «методом добавки».

V.2.4. Сведения о метрологической аттестации используемого метода

Данные о метрологической аттестации метода по ГОСТ Р 54904-12 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания сульфаниламидов, нитроимидазолов, пенициллинов, амфениколов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором»:

• Номер в реестре сведений об аттестованных методиках (методах) измерений ФР.1.31.2011.09610.
• Свидетельство № 01.00225/205-8-11 от 10.02.2011.

Раздел VI. Определения остаточных количеств хинолонов (фторхинолонов) в пищевой продукции животного происхождения

VI.1. Методика полуколичественного определения остаточных количеств хинолонов (фторхинолонов) в пищевой продукции животного происхождения методом иммуноферментного анализа

VI.1.1. Область применения полуколичественного метода определения

В настоящем разделе методических указаний установлен порядок полуколичественного определения остаточных количеств хинолонов (фторхинолонов) методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией результатов (при 450 нм) (далее — ИФА) для пищевых продуктов животного происхождения, в том числе для яиц, яйцепродуктов, мяса и субпродуктов, птицы, рыбы и креветок, молока (сырого, свежего, пастеризованного, обезжиренного, цельного, сухого).

Пределы обнаружения антибиотиков хинолонов и фторхинолонов (по стандартному веществу), мг/кг (мг/дм3): мясо, субпродукты — 0,010; рыба — 0,008; креветки — 0,006; яйца — 0,009; яйцепродукты сухие (яичный меланж, яичный порошок) — 0,09; молоко — 0,0005; молоко сухое — 0,005; мед — 0,003.

VI.1.2. Методика измерений при полуколичественном методе определения

В основе принципа действия тест-системы лежит реакция «антиген — антитело». Лунки микротитровального планшета покрыты антителами захвата к антителам на хинолоны. В лунки вносят растворы стандартов или проб, ферментный конъюгат ципрофлоксацина и антитела к хинолонам. Свободные хинолоны и ципрофлоксацин из конъюгата конкурируют за места связывания с антителами к хинолонам (конкурентный иммуноферментный анализ). В то же время антитела к хинолонам связываются иммобилизированными антителами захвата. Все несвязанные молекулы конъюгата затем удаляются на этапе отмывки. В лунки вносится раствор субстрат/хромогена, выполняется инкубация. Связанный конъюгат преобразует хромоген в окрашенные в синий продукты реакции. Измерение выполняют фотометрически при 450 нм; оптическая плотность обратно пропорциональна концентрации хинолонов в пробе.

VI.1.3. Пределы полуколичественного метода определения

Пределы полуколичественного метода определения остаточных количеств хинолонов в пищевых продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа представлены в табл. 6.1.

Таблица 6.1

Пределы полуколичественного определения остаточных количеств хинолонов в пищевых продуктах методом ИФА

VI.1.4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы, реактивы и тест-системы для полуколичественного метода определения

VI.1.4.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

VI.1.4.2. Вспомогательные устройства, посуда и материалы

<11> Пересчет относительного центробежного ускорения (в единицах g) (ОЦУ/RFS) в скорость центрифугирования (об./мин) приведен в Приложении для всех разделов.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств, посуды и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

VI.1.4.3. Реактивы

Примечание. Допускается применение других химических реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

VI.1.4.4. Тест-система для иммуноферментного анализа

Тест-система для непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА), укомплектованная в соответствии с Приложением VI (рекомендуемое).

Примечание. Допускается использование других тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

VI.1.5. Требования безопасности, квалификация операторов и условия выполнения измерений при полуколичественном методе определения

1. Исследования пищевых продуктов с использованием методики ИФА проводят с соблюдением требований техники безопасности, установленных для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007), а также в инструкции по использованию тест-наборов.

2. При выполнении измерений с использованием планшетного иммуноферментного анализатора и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцию по эксплуатации прибора.

3. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области иммуноферментного анализа. К проведению анализа допускается только персонал, ознакомленный с руководством по эксплуатации планшетного иммуноферментного анализатора и освоивший данную методику.

5. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• температура окружающего воздуха: от 20 до 30 °C;
• относительная влажность воздуха: от 40 до 80%.

VI.1.6. Подготовка к исследованию при полуколичественном методе определения

VI.1.6.1. Подготовка стеклянной посуды

При подготовке к проведению исследований лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

VI.1.6.2. Подготовка оборудования

Подготовку и проверку фотометра и pH-метра проводят в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

VI.1.6.3. Хранение и использование наборов и реагентов

Тест-системы для ИФА хранят при температуре 2 — 8 °C, не допуская подмораживания компонентов. Использовать набор допускается только в пределах срока годности.

VI.1.6.4. Приготовление 10 мМ моющего буферного раствора с pH 7,4 (PBS-буфер с твином)

Для приготовления буферного раствора используют входящий в комплект набора пакет с сухой солью для PBS-буфера.

Способ 1. Используют пакет с солью для приготовления моющего буфера, входящий в комплект набора. Растворяют содержимое целого пакетика в 1 дм3 дистиллированной воды. Готовый 10 мМ моющий буфер может храниться при температуре 2 — 8 °C в течение 4 — 6 недель.

Способ 2. Растворяют содержимое пакетика в 100 см3 дистиллированной воды, чтобы получить 10-кратный концентрат моющего буфера. Раствор может храниться около 8 — 12 недель при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Для приготовления готового к употреблению 10 мМ моющего буфера растворяют одну часть 10-кратного концентрата в 9 частях дистиллированной воды.

VI.1.6.5. Раствор метанола 70%-й

Для приготовления 70%-го раствора метанола вносят 70 см3 чистого метанола в мерную колбу объемом 100 см3, добавляют 30 см3 дистиллированной воды и тщательно перемешивают.

VI.1.6.6. Раствор метанола 35%-й

Для приготовления 35%-го раствора метанола вносят 35 см3 чистого метанола в мерную колбу объемом 100 см3, добавляют 65 см3 дистиллированной воды и тщательно перемешивают, либо разбавляют готовый 70%-й раствор метанола дистиллированной водой в 2 раза.

VI.1.6.7. Экстрагирующий буфер для креветок

Раствор метанола 70%-й (п. VI.1.6.5) разбавляют готовым моющим буфером (п. VI.1.6.4) в соотношении 1 : 2 (например, 1 часть раствора метанола + 1 часть готового моющего буфера).

VI.1.6.8. Приготовление экстрагирующего буфера (раствор 50 мМ натриевой соли гептансульфоновой кислоты с 25 мМ тринатрийфосфатом, pH 2,0)

Навески 2,0 г натриевой соли гептансульфоновой кислоты и 1,9 г трисодиумфосфата растворить в 170 — 190 см3 дистиллированной воды, установить pH ортофосфорной кислотой до 2,0 +/- 0,1 и довести до конечного объема — до 200 см3.

VI.1.6.9. Приготовление 20 мМ буферного раствора (PBS-буфер)

Навески натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного — 1,10 г, натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного — 3,22 г и натрия хлористого — 8,77 г растворяют в объеме 800 — 900 см3 дистиллированной воды, доводят pH до 7,4 0,5 н раствором гидроокиси натрия, далее доводят объем раствора дистиллированной водой в мерной колбе до метки 1 000 см3, тщательно перемешивают.

VI.1.6.10. Приготовление 20%-го растворов метанола

Для получения 20%-го раствора метанола отбирают 20 см3 метанола в мерную колбу объемом 100 см3 и разводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

VI.1.7. Подготовка проб пищевых продуктов для полуколичественного метода определения

1. Отбор проб осуществляют в соответствии МУК 4.1.3534-18 «Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов».

2. Хранение и транспортирование экстрактов, подготовленных для ИФА.

Готовые экстракты допускается хранить до начала анализа в пределах одной лаборатории при температуре от 2 до 8 °C не более 1 суток. Допускается транспортирование материала при температуре от 2 до 8 °C в течение 1 суток. Доставленные в лабораторию образцы в виде экстрактов хранению не подлежат и сразу направляются на анализ.

VI.1.7.1. Подготовка проб молока (сырого, свежего, пастеризованного, обезжиренного, цельного, сухого)

Образцы продуктов в сухом виде предварительно восстанавливают в воде в соответствии с указанием на этикетке (в нормативно-технической документации на продукт). При отсутствии информации: 1 г сухого продукта суспендируют в 9 см3 дистиллированной воды.

Молоко центрифугируют в течение 15 мин при 1 000 g и температуре не выше 4 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 4 °C).

Образовавшийся верхний слой жира удаляют с помощью шпателя или стеклянной палочки, обезжиренный супернатант отбирают в пустую пробирку и используют для дальнейшего анализа.

Непосредственно перед анализом подготовленную пробу перемешивают с помощью вортекса. Далее используют 0,05 см3 подготовленной пробы на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1, для сухих продуктов дополнительно учитывают коэффициент восстановления — 10.

VI.1.7.2. Подготовка проб мяса и субпродуктов, в том числе птицы

Все количество представительной пробы гомогенизируют вручную в фарфоровой ступке или в гомогенизаторе.

Навеску гомогенизированной пробы в количестве 1,0 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, прибавляют 4 см3 70%-го раствора метанола (п. VI.1.6.5) и перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, переворачивая пробирку вверх-вниз или используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом), или перемешивают на вортексе.

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). Супернатант 1 см3 переносят в чистую пробирку и добавляют 1 см3 моющего буфера (п. VI.1.6.4), после чего перемешивают на вортексе 10 с.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного таким образом экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10.

VI.1.7.3. Подготовка проб рыбы и рыбной продукции, продукции аквакультуры (рыба, креветки) (сырой, охлажденной, мороженной, варено-мороженной)

VI.1.7.3.1. Рыба, экстракцию проводят по п. VI.1.7.2.

VI.1.7.3.2. Креветки

Все количество представительной пробы гомогенизируют вручную в фарфоровой ступке или в гомогенизаторе.

Навеску гомогенизированной пробы в количестве 1,0 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, прибавляют 4 см3 экстрагирующего буфера для креветок (по п. VI.1.6.7) и перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, переворачивая пробирку вверх-вниз или используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом), или перемешивают на вортексе.

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). Супернатант в количестве 1 см3 переносят в чистую пробирку.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного таким образом экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 5.

VI.1.7.4. Подготовка проб яиц (сырых) и яйцепродуктов сухих (яичный порошок, меланж, яичный белок)

VI.1.7.4.1. Яйца (сырые)

Отделяют содержимое яиц от скорлупы (все количество представительной пробы) и перемешивают на гомогенизаторе.

Навеску гомогенизированной пробы в количестве 1,0 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, прибавляют 9 см3 35%-го раствора метанола (п. VI.1.6.6) и перемешивают встряхиванием в течение 10 мин, переворачивая пробирку вверх-вниз или используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом), или перемешивают на вортексе.

Центрифугируют 10 мин при 4 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C). Супернатант в количестве 1 см3 переносят в чистую пробирку.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного таким образом экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10.

VI.1.7.4.2. Яйцепродукты сухие (яичный порошок, меланж, яичный белок)

Из сухого порошка готовят 10%-ю суспензию, для этого 1,0 г сухого продукта разводят в 9 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

Далее проводят экстракцию по п. VI.1.7.4.1.

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного таким образом экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 100.

VI.1.7.5. Подготовка проб меда

Навеску меда гомогенизированную в количестве 4,5 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 и встряхивают с 25,5 см3 экстракционного буфера, pH 2,0 (п. VI.1.6.8) в течение 10 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом) до полного растворения.

Центрифугируют полученную смесь при температуре 20 — 25 °C в течение 5 мин при 1 000 g, переносят супернатант в чистую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3.

К 15 см3 супернатанта добавляют 8 см3 н-гексана, встряхивают 5 мин, используя встряхиватель с вертикальным вращением (переворотом).

Центрифугируют полученную смесь при температуре 20 — 25 °C в течение 3 мин при 1 000 g, нижнюю фазу переносят в чистую центрифужную пробирку. Если нижняя фаза остается мутной, то повторяют процедуру центрифугирования: 3 мин при 1 000 g при комнатной температуре для получения прозрачной фракции раствора меда.

Прозрачную фракцию очищают методом твердофазной экстракции с помощью колонок RIDA^{®} C18 в соответствии с нижеуказанной процедурой.

Очистка раствора меда методом твердофазной экстракции

Колонку для твердофазной экстракции промывают 2 см3 100%-го метанола со скоростью 1 кап./с, используя устройство для твердофазной экстракции (вакуумный манифолд) и руководствуясь инструкцией по его эксплуатации.

Примечание. При отсутствии устройства для твердофазной экстракции для создания давления воздуха на входе в колонку допускается использование пластикового шприца на 20 см3 с резиновой пробкой, соединенного с колонкой через стеклянный буферный цилиндр и пластиковый переходник.

Весь объем подготовленного раствора исследуемой пробы (примерно 10 см3) пропускают через колонку со скоростью 15 кап./мин.

Затем колонку промывают 3 см3 20%-го раствора метанола в воде со скоростью 1 кап./с, удаляют остатки жидкости, после чего высушивают колонку в токе воздуха или азота.

Устанавливают под колонку чистую пробирку. Вносят на колонку 0,5 см3 100%-го метанола и осторожно, со скоростью 15 кап./мин, элюируют адсорбированный аналит (хинолоны) в чистую пробирку, остатки жидкости выдавливают в ту же пробирку.

К 0,5 см3 элюата добавляют 1 см3 20 мМ фосфатного буфера (п. VI.1.6.9).

Для анализа используют 0,05 см3 подготовленного таким образом экстракта на лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

Примечание. При необходимости для дальнейшего разбавления растворов используют раствор метанола в фосфатном буфере (35 см3 метанола и 65 см3 20 мМ фосфатного буфера п. VI.1.6.9).

VI.1.8. Проведение исследований при полуколичественном методе определения

VI.1.8.1. Общие положения

1. Раствор субстрата/хромогена светочувствителен, поэтому необходимо избегать попадания на него прямого света. При появлении окрашивания раствора субстрата/хромогена в голубоватый цвет реагент к работе непригоден.

2. Не допускается заменять реагенты в составе одного комплекта реагентами из другого комплекта с другим номером партии. Не допускается перекрестное использование реагентов из комплектов с разными номерами партий.

VI.1.8.2. Подготовка тест-системы к исследованиям

Подготовку тест-системы к исследованиям проводят следующим образом:

1. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов (8 микролунок скрепленных в одну полоску). Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить в холодильник при температуре 2 — 8 °C.

2. Перед использованием тест-системы доводят температуру всех реагентов до комнатной (20 — 25 °C) в течение 0,5 — 1 ч. Если в концентратах буфера и конъюгате образовались кристаллы, нужно растворить их путем встряхивания при комнатной температуре перед разведением этих реагентов.

3. Перед непосредственным использованием встряхивают каждый флакон с реагентами.

4. После использования реагенты тест-системы сразу убирают в холодильник.

5. На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

6. Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники автоматических дозаторов. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.

7. Каждый исследуемый раствор экстрактов испытуемых проб и градуировочных растворов анализируют в двух повторностях.

VI.1.8.3. Алгоритм проведения исследования

Анализ проводят поэтапно:

1. В рамку планшета вставляют необходимое количество микролунок, достаточное для всех растворов стандартов и растворов исследуемых проб при анализе в двух повторностях каждый. Записывают положения лунок со стандартами и исследуемыми растворами на бланке планшета.

2. Добавляют в выбранные пары лунок по 0,05 см3 каждой концентрации раствора стандарта, раствора подготовленной пробы продукта. Для каждого раствора необходимо использовать новые наконечники.

3. Добавляют в лунки по 0,05 см3 ферментного конъюгата.

4. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 см3 раствора антител. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации в холодильнике при 2 — 8 °C в течение 1 ч.

5. По окончании инкубации выливают жидкость из лунок, переворачивая рамку планшета, и тщательно выбивают капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного интенсивного постукивания рамки с лунками по столу (максимально выбивая капли из лунок), накрытому фильтровальной бумагой.

6. Заполняют лунки буфером для промывки (PBS-буфер с твином по п. VI.1.6.4), внося по 0,25 см3 в каждую лунку, используя восьмиканальный дозатор. После контакта выливают буфер для промывки из лунок, тщательно выбивают капельки жидкости путем троекратного интенсивного постукивания рамки с лунками по столу (максимально выбивая капли из лунок), накрытому фильтровальной бумагой. Процедура отмывки повторяется трижды.

Примечание. Необходимо следовать рекомендованной процедуре промывки и не допускать высыхания микролунок в процессе выполнения анализа.

7. После отмывания добавляют по 0,1 см3 субстрата/хромогена в каждую лунку. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 15 мин в темном месте.

8. По окончании инкубации добавляют в каждую лунку по 0,1 см3 стоп-реагента. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и сразу после этого измеряют оптическую плотность в каждой лунке, время от внесения стоп-реагента до измерения не должно превышать 30 мин.

VI.1.9. Учет и обработка результатов при полуколичественном методе определения

VI.1.9.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности содержимого лунок на микропланшетном иммуноферментном анализаторе (планшетный фотометр, ридер) при длине волны 450 нм. Оптическая плотность каждой лунки сравнивается с нулевым стандартом, значение которого принимается за 100%.

Величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, ниже 0,6 (A450нм < 0,6) является признаком порчи реагентов. Окрашивание красноватого раствора субстрата/хромогена в голубой цвет перед постановкой анализа также является признаком порчи реагентов. Результаты анализа в таком случае не учитываются.

Измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами образцов.

VI.1.9.2. Для обработки результатов иммуноферментного анализа используется специальное программное обеспечение, рекомендованное изготовителем тест-системы. Пример стандартной калибровочной кривой дан в сертификате обеспечения качества на тест-систему.

Программное обеспечение выполняет построение градуировочной зависимости относительной оптической плотности B/B0 от натурального логарифма концентрации антибиотика:

B/B0 = a + b·lnX, где (1)

B — оптическая плотность раствора антибиотика;

B0 — оптическая плотность 1-го градуировочного раствора с концентрацией антибиотика 0,00 мкг/дм3;

X — концентрация антибиотика в растворе, мкг/дм3.

Расчет коэффициентов линейной регрессии a и b проводится с помощью метода наименьших квадратов на основании пар значений B/B0, lnCi, полученных для пяти градуировочных растворов, где (i = 2...6), Ci — концентрация i-го градуировочного раствора, Bi — среднее значение оптической плотности, рассчитанное по двум значениям оптической плотности параллельных измерений i-го градуировочного раствора.

Массовая концентрация антибиотика в пробе рассчитывается на основании результатов измерений оптической плотности раствора подготовленной пробы, коэффициентов линейной регрессии и фактора разбавления по формуле:

X = F \cdot exp(\frac{\frac{B_{x}}{B_{0}} - a}{b}), где (2)

X — концентрация антибиотика в пробе, мкг/кг (мкг/дм3);

Bx — оптическая плотность, полученная при измерении раствора пробы;

F — фактор разведения пробы.

Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции r2 > 0,98.

VI.1.9.3. Обработку результатов анализа без программного обеспечения проводят следующим образом.

Измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами образцов.

Вычисляют средние значения оптической плотности стандартных и исследуемых растворов, полученные по 2 параллельным микролункам в результате двух параллельных определений.

Относительную оптическую плотность (A) вычисляют по формуле:

A = \frac{B_{i}}{B_{0}} \times 100 , где (3)

A — значение относительной оптической плотности, выраженное в процентах от оптической плотности нулевого стандарта, % поглощения;

Bi — среднее значение оптической плотности стандартных растворов антибиотика (или исследуемых растворов продуктов);

B0 — среднее значение оптической плотности нулевого стандарта.

VI.1.9.4. По величинам значений относительной оптической плотности, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим им значениям концентрации антибиотика в мкг/дм3, строят калибровочную кривую (градуировочный график) в полулогарифмической системе координат.

VI.1.9.5. Концентрацию хинолонов (x) в мкг/дм3 считывают по калибровочной кривой соответственно значениям оптической плотности, которые вычислены по формуле (3).

VI.1.9.6. Массовую концентрацию (содержание) хинолонов в испытуемой пробе (X) рассчитывают по формуле:

X = \frac{F \cdot x}{\text{К}} , где (4)

X — массовая концентрация хинолонов в испытуемой пробе, мг/кг (мг/дм3 — для жидких продуктов);

x — массовая концентрация хинолонов в экстракте испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, нг/дм3;

F — фактор разбавления испытуемой пробы, приведенный в табл. 6.2;

К — коэффициент пересчета мкг/дм3 в мг/кг (мг/дм3 — для жидких проб), равный 1 000.

Таблица 6.2

Факторы разбавления для расчета содержания хинолонов в различных пробах

VI.1.10. Расчет результатов параллельных определений при полуколичественном методе определения

За результат полуколичественного анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений:

\overline{X} = \frac{X_{1} + X_{2}}{2} , где

X1, X2 — результаты параллельных определений, мг/кг;

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг.

VI.1.11. Оформление результатов определений при полуколичественном методе определения

Если содержание компонента выше предела определения для соответствующего вида продукта (табл. 6.1), то результат анализа представляют в виде:

«хинолоны в молоке обнаружены».

Если содержание компонента ниже предела определения для соответствующего вида продукта (табл. 6.1), то результат анализа представляют в виде:

«хинолоны в молоке не обнаружены».

VI.1.12. Подтверждение результата полуколичественного определения

При обнаружении хинолонов в исследованных образцах пищевых продуктов полуколичественным методом анализа на уровне МДУ и выше необходимо подтверждение полученного результата с использованием любого аттестованного метода (например, ВЭЖХ-МС).

Приложение VI (рекомендуемое)

КОМПЛЕКТАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХИНОЛОНОВ

(на примере RIDASCREEN® Chinolone/Quinolones, арт. R3113) <12>

<12> Допускается использование других тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Набор для определения хинолонов по технологии ИФА на 96 определений с внутренним стандартом, включает следующие компоненты:

1. Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов с 8 отделяемыми лунками каждый), сенсибилизированных антителами «захвата», в упаковке из фольги в комплекте с влагопоглотителем.

2. Комплект стандартных концентрированных растворов со следующими концентрациями: 0; 0,5; 1,5; 3,0; 6,0; 18,0 мкг/дм3 в воде по 1,3 см3 — 6 шт.

3. Конъюгат с ципрофлоксацином, готовый к употреблению — 10 см3.

4. Антитела к хинолонам — 6 см3.

5. Готовая смесь субстрата с хромогеном содержит пероксид карбамида и тетраметилбензидин — 10 см3.

6. Стоп-реагент, содержит 1 н серную кислоту — 14 см3.

7. Моющий буфер в виде сухой соли для приготовления 10 мМ фосфатного буфера, pH 7,4, содержащей 0,05% твина — 1 пакет.

Наборы рассчитаны на проведение анализа в 2 повторностях 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).

Специфичность методики определения хинолонов, установленная по перекрестной чувствительности к исследованным антибиотикам в буферной системе (на примере, RIDASCREEN® Chinolone/Quinolones, арт. R3113), представлена ниже.

Специфичность к антибиотикам других тест-систем может отличаться от указанной выше, данная информация должна содержаться в прилагаемом описании тест-систем.

VI.2. Определение хинолонов (фторхинолонов) методами подтверждающего анализа (на основе ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС и др.)

VI.2.1. Назначение и область применения

Определение остаточного содержания хинолонов проводится в мясе, мясных продуктах и продуктах из мяса птицы, яйцах, яичном порошке, яичном меланже, молоке, меде, рыбе и в продовольственном сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием по ГОСТ 32797-14 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания хинолонов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором».

Диапазон определяемых содержаний — 1 - 2 000 мкг/кг.

VI.2.2. Особенности и условия применения метода ВЭЖХ-МС

Особенностью применения метода ВЭЖХ-МС в данном случае является то, что метод может обеспечить надежное определение антибиотиков на уровнях, близких к уровням МДУ. Это связано с тем, что в отличие от пищевого сырья, представляющего потенциальную опасность по содержанию антибиотиков, конечная продукция содержит в большинстве случаев продукцию животноводства, рыболовства, пчеловодства, птицеводства в разбавленном виде. Практически единственным исключением является ряд молочных продуктов. В ситуации разбавления пищевого сырья — потенциального источника антибиотиков, метод определения, представленный в ГОСТ 32797-14 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания хинолонов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» является качественным, подтверждающим присутствие антибиотиков, обнаруженных методом ИФА, в пробе.

Условия применения метода по ГОСТ 32797-14 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания хинолонов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» в качестве подтверждающего:

1. Обнаружение содержаний антибиотиков в пробе пищевого продукта на уровне МДУ, выше уровня МДУ и ниже уровня МДУ. При этом в расчет берется ошибка метода определения ИФА. В случае присутствия антибиотиков в пробе продукта в количествах ниже МДУ, но если определенное количество в интервале ошибки метода определения равно или выше МДУ, необходимо проведение подтверждения присутствия антибиотика методом ВЭЖХ-МС.

2. Идентификация присутствия антибиотиков проводится без использования внутреннего стандарта (ввиду отсутствия необходимости проведения количественного анализа).

3. Идентификация присутствия антибиотиков проводится как по совпадению времени удерживания (совпадающего со временем удерживания стандарта при одинаковых условиях хроматографирования), так и по совпадению молекулярного и дочерних ионов, полученных масс-спектрометрией элюата.

4. Возможно дополнительное подтверждение присутствия антибиотиков в продукте «методом добавки». Метод заключается в предварительном дополнительном внесении в пробу, в которой присутствуют антибиотики, определенные методом ИФА, дополнительного количества антибиотиков. При этом при хроматографировании пробы должны наблюдаться совпадения времен удерживания пиков антибиотиков пробы и антибиотиков добавки, что выражается в следующем: отсутствие дополнительных вершин пиков (расщепление), отсутствие каких-либо изменений формы пиков.

Проведение подтверждения «методом добавки» является дополняющим, т.е. пункт 4 только дополняет пункты 2 - 3 и проводится после выполнения идентификации по пунктам 2 - 3.

Метод по ГОСТ 32797-14 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания хинолонов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором» может быть использован для подтверждения присутствия или отсутствия хинолонов в случае внутреннего контроля содержания антибиотиков на предприятии (при входном контроле продуктов переработки животноводства, рыболовства, пчеловодства, птицеводства). При этом объектом контроля служат продукты переработки, не являющиеся продукцией, предназначенной для реализации населению.

VI.2.3. Критерии оценки результатов

Критерии оценки:

1. Присутствие антибиотиков в исследованной пробе считается подтвержденным, если выполнены следующие критерии:

а) обнаруженные вещества в составе образца совпадают как по времени удерживания, так и по молекулярным и дочерним ионам со сравнительными величинами, полученными при хроматографическом разделении и масс-спектрометрии стандартов антибиотиков;

б) соотношение сигнал/шум полученных пиков определяемых антибиотиков в хроматограмме составляет 3 и более.

2. Отсутствие антибиотиков в исследуемой пробе считается подтвержденным в случае не выполнения критериев а), б).

Возможна дополнительная идентификация «методом добавки»

VI.2.4. Сведения о метрологической аттестации используемого метода

Данные о метрологической аттестации метода по ГОСТ 32797-14 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания хинолонов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором»:

• Номер в реестре сведений об аттестованных методиках (методах) измерений ФР.1.31.2011.09610.
• Свидетельство № 01.00225/205-8-11 от 10.02.2011.

Раздел VII. Определение остаточных количеств сульфаниламидов в пищевой продукции животного происхождения

VII.1. Методика полуколичественного определения остаточных количеств сульфаниламидов в пищевой продукции животного происхождения методом иммуноферментного анализа

VII.1.1. Область применения полуколичественного метода определения

В настоящем разделе методических указаний установлен порядок полуколичественного определения остаточных количеств сульфаниламидов методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией результатов (при 450 нм) (далее — ИФА) для следующих групп пищевых продуктов животного происхождения: молоко, мясо, субпродукты, рыба, креветки, цельное яйцо, мед. Пределы обнаружения сульфаниламидов (по стандартному веществу), мг/кг (мг/дм3): мясо (курица) и яйца — 0,0015; мясо (свинина), рыба, креветки, мед — 0,002; молоко — 0,0035.

VII.1.2. Методика измерений при полуколичественном методе определения

В основе теста — взаимодействие антигенов с антителами. Лунки стрипов микротитровального планшета покрыты антителами захвата, связывающимися с антителами к сульфаниламидам. Добавляются стандартные или исследуемые растворы, а также конъюгат сульфаниламида с ферментом и антитела к сульфаниламидам. Свободный сульфаниламид и конъюгат сульфаниламида с ферментом конкурируют за центры связывания антител к сульфаниламиду (конкурентный иммуноферментный анализ). Одновременно антитела к сульфаниламиду связываются иммобилизированными антителами захвата. Несвязавшийся ферментный конъюгат затем удаляется в процессе промывки.

Далее в лунки планшета добавляется раствор субстрата/хромогена. Связавшийся ферментный конъюгат преобразует хромоген в вещество голубого цвета.

Добавление стоп-раствора приводит к изменению цвета с голубого на желтый. Измерение проводится фотометрически при 450 нм. Оптическая плотность раствора в лунках обратно пропорциональна концентрации сульфаниламида в пробе.

VII.1.3. Пределы полуколичественного метода определения

Пределы полуколичественного определения остаточных количеств сульфаниламидов и сульфаметазина в пищевой продукции животного происхождения методом иммуноферментного анализа представлены в табл. 7.1 и 7.2.

Таблица 7.1

Пределы полуколичественного определения остаточных количеств сульфаниламидов в пищевых продуктах методом ИФА

Таблица 7.2

Пределы полуколичественного определения остаточных количеств сульфаметазина в пищевых продуктах методом ИФА

VII.1.4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы, реактивы и тест-системы для полуколичественного метода определения

VII.1.4.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

VII.1.4.2. Вспомогательные устройства, посуда и материалы

<13> Пересчет относительного центробежного ускорения (в единицах g) (ОЦУ/RFS) в скорость центрифугирования (об./мин) приведен в Приложении для всех разделов.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных устройств, посуды и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.

VII.1.4.3. Реактивы

Примечание. Допускается применение других химических реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

VII.1.4.4. Тест-системы для иммуноферментного анализа

Тест-системы для непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) для определения сульфаниламидов — Тест-система № 1 и сульфаметазина — Тест-система № 2, укомплектованные в соответствии с Приложением VII (рекомендуемое).

Примечание. Допускается использование других тест-систем с аналогичными или лучшими характеристиками. При использовании других тест-систем пробоподготовку и анализ проводить в соответствии с прилагаемой инструкцией.

VII.1.5. Требования безопасности, квалификация операторов и условия выполнения измерений при полуколичественном методе определения

1. Исследования пищевых продуктов с использованием методики ИФА проводят с соблюдением требований техники безопасности, установленных для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007), а также в инструкции по использованию тест-наборов.

2. При выполнении измерений с использованием планшетного иммуноферментного анализатора и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцию по эксплуатации прибора.

3. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области иммуноферментного анализа. К проведению анализа допускается только персонал, ознакомленный с руководством по эксплуатации планшетного иммуноферментного анализатора и освоивший данную методику.

5. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• температура окружающего воздуха: от 20 до 30 °C;
• относительная влажность воздуха: от 40 до 80%.

VII.1.6. Подготовка к исследованию при полуколичественном методе определения

VII.1.6.1. Подготовка стеклянной посуды

При подготовке к проведению исследований лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.

VII.1.6.2. Подготовка оборудования

Подготовку и проверку фотометра и pH-метра проводят в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

VII.1.6.3. Хранение и использование наборов и реагентов

Тест-системы для ИФА хранят при температуре 2 — 8 °C, не допуская подмораживания компонентов. Использовать набор допускается только в пределах срока годности.

VII.1.6.4. Приготовление PBS-буфера с pH 7,4 для промывки

Способ 1. Используйте пакет с солью для приготовления PBS-буфера, находящийся в комплекте набора. Растворите содержимое целого пакетика в 1 л дистиллированной воды. Готовый PBS-буфер может храниться при температуре 2 — 8 °C в течение 4 — 6 недель.

Способ 2. Растворите содержимое пакетика в 100 см3 дистиллированной воды, чтобы получить 10-кратный концентрат PBS-буфера. Раствор может храниться около 8 — 12 недель при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Для приготовления готового к употреблению PBS-буфера растворите одну часть 10-кратного концентрата в 9 частях дистиллированной воды.

VII.1.6.5. Приготовление 50 мМ раствора ацетатного буфера

Растворяют 4,1 г ацетата натрия в 900 см3 дистиллированной воды, устанавливают pH = 5 +/- 0,1 с помощью 1 н раствора соляной кислоты и доводят в мерной колбе до 1 000 см3 дистиллированной водой.

VII.1.6.6. Приготовление 84%-го раствора ацетонитрила

Готовят раствор ацетонитрила в воде в соотношении 84 : 16 (по объему).

VII.1.6.7. Приготовление 2М раствора хлорида натрия

Растворяют навеску хлорида натрия 115 г в 900 см3 дистиллированной воды и доводят в мерной колбе до 1 000 см3.

VII.1.6.8. Микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами

Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить в холодильник при температуре 2 — 8 °C.

VII.1.6.9. Приготовление 20%-го раствора метанола в буфере (по объему)

В 80 частях (объемных) буфера для приготовления проб (в комплекте набора) растворить 20 частей (объемных) метанола, перемешать.

VII.1.6.10. Приготовление буфера для разбавления проб для определения сульфаметазина (тест-система № 2) из концентрата

Для приготовления готового к использованию буфера для разбавления проб разбавляют 20-кратный концентрат (в комплекте тест-системы № 2) 1 : 20 (1 + 19) дистиллированной водой. Рекомендуется выполнять разведение буфера для разбавления в один этап (50 см3 буфера для разбавления доливают в мерной колбе дистиллированной водой до метки 1 000 см3).

Срок годности буфера для разбавления, соответствующий указанному на этикетке к концентрату, выдерживается при хранении при температуре не выше 4 °C.

VII.1.6.11. Приготовление буфера для разбавления стандартов для определения сульфаметазина (тест-система № 2) из 10-кратного концентрата

Для приготовления готового к использованию буфера разбавляют 10-кратный концентрат (в комплекте тест-системы № 2) приготовленным буфером для разбавленного проб (п. VII.1.6.10) в соотношении 1 : 10 (например, 1 см3 концентрата + 9 см3 готового буфера для разбавления проб (п. VII.1.6.10) и интенсивно перемешивают (на вортексе), после чего прогревают при (40 +/- 1) °C. Мутность не влияет на результаты анализа. При выпадении осадка буфер следует гомогенизировать на вортексе.

VII.1.7. Подготовка проб пищевых продуктов для полуколичественного метода определения

1. Отбор проб осуществляют в соответствии МУК 4.1.3534-18 «Подготовка проб для проведения исследований по определению остаточных количеств антибиотиков и антимикробных препаратов».

2. Хранение и транспортирование экстрактов, подготовленных для ИФА.

Готовые экстракты допускается хранить до начала анализа в пределах одной лаборатории при температуре от 2 до 8 °C не более 1 суток. Допускается транспортирование материала при температуре от 2 до 8 °C в течение 1 суток. Доставленные в лабораторию образцы в виде экстрактов хранению не подлежат и сразу направляются на анализ.

VII.1.7.1. Пробоподготовка для определения сульфаниламидов с использованием тест-системы № 1

VII.1.7.1.1. Молоко (сырое, свежее, пастеризованное, обезжиренное, цельное), сухие молочные смеси, в том числе для детского питания

Пробы молока разбавляют в соотношении 1 : 5 (1 + 4) буфером для разбавления проб из комплекта поставки (например, 0,1 см3 молока + 0,4 см3 буфера).

Для анализа вносят 0,05 см3 подготовленной пробы в лунку планшета.

VII.1.7.1.2. Мясо и субпродукты, в том числе птицы

VII.1.7.1.2.1. Мясо (свинина) и субпродукты (печень, почки)

Все количество представительной пробы гомогенизируют вручную в фарфоровой ступке или в гомогенизаторе.

Навеску гомогенизированной пробы в количестве 1 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, прибавляют 2 см3 100%-го метанола и встряхивают на вортексе в течение 30 с, после чего центрифугируют 10 мин при 4 000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C).

Метанольный экстракт в количестве 1,5 см3 переносят в чистую пробирку и испаряют досуха в устройстве для испарения.

Сухой остаток растворяют в 0,5 см3 буфера для разбавления проб из набора 1, добавляют 1 см3 н-гексана (или н-гептана) для обезжиривания и встряхивают на вортексе в течение 10 с. После этого центрифугируют при температуре 20 — 25 °C в течение 10 мин при 4 000 g и отбирают нижнюю водную фазу в новую пробирку.

Для анализа вносят 0,05 см3 нижней водной фазы в лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

VII.1.7.1.2.2. Мясо птицы

Все количество представительной пробы гомогенизируют вручную в фарфоровой ступке или в гомогенизаторе.

Навеску гомогенизированной пробы в количестве 2 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, прибавляют 6 см3 84%-го раствора ацетонитрила и встряхивают в течение 10 мин, переворачивая пробирку вверх-вниз, после чего центрифугируют 10 мин при 3 000 g и температуре 15 °C (если нет центрифуги с охлаждением, охладите пробы до 10 °C перед центрифугированием).

Супернатант в количестве 4 см3 переносят в новую центрифужную пробирку, добавляют 2 см3 2М раствора хлорида натрия (п. VII.1.6.7), 7 см3 этилацетата и встряхивают в течение 10 мин (движениями вверх-вниз).

Центрифугируют 10 мин при 3 000 g и температуре не выше 15 °C (если нет центрифуги с охлаждением, охладите пробы до температуры не выше 10 °C перед центрифугированием).

Весь супернатант переносят в новую центрифужную пробирку и испаряют досуха в устройстве для испарения.

Сухой остаток растворяют в 1 см3 буфера для разбавления проб из набора 1, перемешивают на вортексе 1 мин, добавляют 1 см3 н-гексана (или н-гептана), перемешивают на вортексе еще 2 мин.

Полученную смесь центрифугируют 10 мин при 3 000 g и температуре не выше 15 °C (если нет центрифуги с охлаждением, охладите пробы до температуры не выше 10 °C перед центрифугированием) и отбирают нижнюю водную фазу в чистую пробирку.

Для анализа вносят 0,05 см3 нижней водной фазы в лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

VII.1.7.1.3. Пищевая продукция аквакультуры животного происхождения (сырая, охлажденная, мороженная, варено-мороженная)

Рыба и креветки — пробоподготовка по п. VII.1.7.1.2.1.

VII.1.7.1.4. Яйца

Пробоподготовка по п. VII.1.7.1.2.2.

VII.1.7.1.5. Мед

Навеску меда в количестве 3 г вносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3 и встряхивают с 6 см3 50 мМ ацетатного буферного раствора, pH 5,0 (п. VII.1.6.5) до полного растворения.

Центрифугируют полученную смесь 10 минут при 4000 g при комнатной температуре (20 — 25 °C), полученный прозрачный супернатант отбирают в пустую пробирку.

Готовят 1 см3 раствора метанола в буфере для разбавления проб (из комплекта набора) (20 : 80 по объему, например, 0,2 см3 метанола и 0,8 см3 буфера). Для удаления воздушных пузырьков непосредственно перед использованием раствор перемешивают на вортексе.

Далее проводят очистку методом твердофазной экстракции с помощью колонок RIDA^{®} C18 в соответствии со следующей процедурой.

Очистка раствора меда методом твердофазной экстракции

Скорость потока 1 кап./с.

Кондиционирование колонки RIDA^{®} C18 проводят следующим образом: колонку промывают сначала 2 см3 100%-го метанола, а затем 2 см3 50 мМ ацетатного буферного раствора (п. VII.1.6.5), используя устройства для твердофазной экстракции (вакуумный манифолд) и руководствуясь инструкцией по его эксплуатации.

Примечание. При отсутствии устройства для твердофазной экстракции для создания давления воздуха на входе в колонку допускается использование пластикового шприца на 20 см3 с резиновой пробкой, соединенного с колонкой через стеклянный буферный цилиндр и пластиковый переходник.

После кондиционирования на подготовленную колонку наносят весь объем супернатанта и медленно продавливают через колонку.

Затем колонку промывают 8 см3 50 мМ ацетатного буферного раствора (п. VII.1.6.5), удаляют из нее остатки жидкости, после чего высушивают в токе воздуха или азота в течение 2 мин.

Адсорбированные на колонке вещества медленно элюируют 1 см3 раствора метанола в буфере для разбавления проб (20 : 80 по объему) в чистую пробирку.

Элюат разбавляют в соотношении 1 : 3 (1 + 2) буфером для разбавления проб (например, 0,1 см3 элюата + 0,2 см3 буфера).

Для анализа вносят 0,05 см3 подготовленной пробы в лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 1.

VII.1.7.2. Пробоподготовка для определения сульфаметазина с использованием тест-системы № 2

VII.1.7.2.1. Молоко

VII.1.7.2.1.1. Молоко обезжиренное

Пробы молока разбавляют в соотношении 1 : 5 (1 + 4) приготовленным к использованию буфером для разбавления проб (п. VII.1.6.10) (например, 0,05 см3 молока с 0,45 см3 буфера для разбавления).

Для анализа вносят 0,05 см3 подготовленной пробы в лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10.

VII.1.7.2.1.2. Молоко жирное

Пробу молока центрифугируют для обезжиривания в течение 10 мин при 3 000 g и температуре не выше 10 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры не выше 10 °C).

Верхний жирный слой полностью удаляют (шпателем, стеклянной палочкой или с помощью пипетки Пастера) и смешивают пробу обезжиренного молока с буфером для разбавления (п. VII.1.6.10) в соотношении 1 : 10 (1 + 9) (например, 0,05 см3 молока с 0,45 см3 буфера для разбавления).

Для анализа вносят 0,05 см3 подготовленной пробы в лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 10.

VII.1.7.2.2. Полуколичественный метод: мясо и почки (в том числе мясо кролика).

От мяса (или почек) отделяют жир и гомогенизируют пробу с помощью гомогенизатора или миксера до пастообразного состояния.

Навеску гомогенизированной пробы в количестве 5 г интенсивно перемешивают с 20 см3 смеси ацетонитрил/вода (п. VII.1.6.6) в течение 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при 3 000 g и температуре не выше 15 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры 10 — 15 °C).

Супернатант объемом 3 см3 разбавляют 3 см3 дистиллированной воды, добавляют к раствору 4,5 см3 этилацетата и перемешивают в течение 10 мин.

Для разделения фаз смесь центрифугируют 10 мин при 3 000 g и температуре не выше 15 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры 10 — 15 °C).

Этилацетатный супернатант переносят в пустую пробирку и испаряют экстракт досуха в устройстве для испарения.

Сухой остаток растворяют в 1,5 см3 буфера для разбавления проб (п. VII.1.6.10), для обезжиривания раствора добавляют в пробирку 1,5 см3 н-гексана (н-гептана) и перемешивают 5 мин. Затем раствор центрифугируют 10 мин при 3 000 g и температуре не выше 15 °C (при отсутствии центрифуги с охлаждением допускается проводить центрифугирование при комнатной температуре с предварительным охлаждением проб в холодильнике до температуры 10 — 15 °C). Верхний гексановый слой по окончании центрифугирования полностью удаляют, нижнюю водную фазу отбирают в пустую пробирку.

Для анализа вносят 0,05 см3 нижней водной фазы в лунку планшета. При расчете конечного результата учитывают фактор разбавления — 2,5.

VII.1.7.2.3. Качественный метод: Мясо и почки (исключая мясо кролика).

Для анализа используют свежее или замороженное мясо (мышцы или почки).

Замороженные пробы размораживают при комнатной температуре (20 — 25 °C), промывают дистиллированной водой и просушивают с помощью фильтровальной бумаги.

От исследуемых образцов отделяют жир.

Навеску образца в количестве 1 г помещают в пробирку, добавляют 11 см3 готового буфера для разбавления (п. VII.1.6.10). Содержимое пробирки гомогенизируют при 13 500 об./мин в течение 30 с с помощью гомогенизатора (ультратюрекса) или миксером в течение 3 — 5 мин.

Полученную смесь центрифугируют 10 мин при 4 000 g и комнатной температуре (20 — 25 °C), супернатант с помощью пипетки отбирают в чистую пробирку, избегая попадания жира в пипетку.

Для анализа используют 0,05 см3 супернатанта на лунку планшета.

VII.1.8. Проведение исследований при полуколичественном методе определения

VII.1.8.1. Общие положения

1. Раствор субстрата/хромогена светочувствителен, поэтому необходимо избегать попадания на него прямого света. При появлении окрашивания раствора субстрата/хромогена в голубоватый цвет реагент к работе непригоден.

2. Не допускается заменять реагенты в составе одного комплекта реагентами из другого комплекта с другим номером партии. Не допускается перекрестное использование реагентов из комплектов с разными номерами партий.

VII.1.8.2. Подготовка тест-системы к исследованиям

Подготовку тест-системы к исследованиям проводят следующим образом:

1. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов (8 микролунок скрепленных в одну полоску). Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить в холодильник при температуре 2 — 8 °C.

2. Перед использованием тест-системы доводят температуру всех реагентов до комнатной (20 — 25 °C) в течение 0,5 — 1 ч. Если в концентратах буфера и конъюгата образовались кристаллы, нужно растворить их путем встряхивания при комнатной температуре перед разведением этих реагентов.

3. Перед непосредственным использованием встряхивают каждый флакон с реагентами.

4. После использования реагенты тест-системы сразу убирают в холодильник.

5. На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

6. Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники автоматических дозаторов. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.

7. Каждый исследуемый раствор экстрактов испытуемых проб и градуировочных растворов анализируют в двух повторностях.

VII.1.8.3. Алгоритм проведения исследования

Анализ проводят поэтапно, используя соответствующую тест-систему (N 1 или № 2, п. VII.1.4.4):

1. В рамку планшета вставляют необходимое количество микролунок, достаточное для всех растворов стандартов и растворов исследуемых проб при анализе в двух повторностях каждый. Записывают положения лунок со стандартами и исследуемыми растворами на бланке планшета.

2. Добавляют в выбранные пары лунок по 0,05 см3 каждой концентрации раствора стандарта, раствора подготовленной пробы продукта, для каждого раствора использовать новые наконечники.

3. Добавляют по 0,05 см3 смеси ферментного конъюгата в каждую лунку.

4. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 см3 раствора антител. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 1 часа в темном месте.

5. По окончании инкубации выливают жидкость из лунок, переворачивая рамку планшета, и тщательно выбивают капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного интенсивного постукивания рамки с лунками по столу (максимально выбивая капли из лунок), накрытому фильтровальной бумагой.

6. Заполняют лунки буфером для промывки (PBS-буфер по п. VII.1.6.4), внося по 0,25 см3 в каждую лунку, используя восьмиканальный дозатор. После контакта выливают буфер для промывки из лунок и тщательно выбивают капельки жидкости. Процедура отмывки повторяется трижды.

Примечание. Необходимо следовать рекомендованной процедуре промывки и не допускать высыхания микролунок в процессе выполнения анализа.

7. После отмывания добавляют по 0,1 см3 смеси субстрата/хромогена (для тест-системы № 1) или 0,05 см3 субстрата и 0,05 см3 хромогена (для тест-системы № 2) в каждую лунку. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 15 мин в темном месте.

8. По окончании инкубации добавляют в каждую лунку по 0,1 см3 стоп-реагента. Перемешивают, осторожно покачивая планшет рукой, и сразу после этого измеряют оптическую плотность в каждой лунке, время от внесения стоп-реагента до измерения не должно превышать 30 мин.

VII.1.9. Учет и обработка результатов при полуколичественном методе определения

VII.1.9.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности на микропланшетном иммуноферментном анализаторе (планшетный фотометр, ридер) при длине волны 450 нм против нулевого стандарта, значение которого принимается за 100%.

Величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, ниже 0,8 (A450нм < 0,8) является признаком порчи реагентов. Окрашивание красноватого раствора субстрата/хромогена в голубой цвет перед постановкой анализа также является признаком порчи реагентов. Результаты анализа в таком случае не учитываются.