МУК 4.1.3513-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств глифосата в зеленой массе растений, зерне и соломе зерновых колосовых культур, зерне гороха, зерне кукурузы, семенах подсолнечника, рапса, льна, бобах сои, растительном масле, плодах и соке плодовых семечковых и плодовых косточковых, ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 декабря 2017 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ГЛИФОСАТА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ РАСТЕНИЙ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР, ЗЕРНЕ ГОРОХА, ЗЕРНЕ КУКУРУЗЫ, СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА, РАПСА, ЛЬНА, БОБАХ СОИ, РАСТИТЕЛЬНОМ МАСЛЕ, ПЛОДАХ И СОКЕ ПЛОДОВЫХ СЕМЕЧКОВЫХ И ПЛОДОВЫХ КОСТОЧКОВЫХ, ЯГОДАХ И СОКЕ ВИНОГРАДА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3513-17

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» (В.И. Долженко, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская) и ООО «Инновационный центр защиты растений» (И.А. Цибульская, А.А. Далинова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики измерений № 01.5.04.235/01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации глифосата в зеленой массе растений, зерне и соломе зерновых колосовых культур, зерне гороха, зерне кукурузы, семенах подсолнечника, рапса, льна, бобах сои, растительном масле, плодах и соке плодовых семечковых и плодовых косточковых, ягодах и соке винограда в диапазоне концентраций 0,5 — 10,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Глифосат

N-(фосфонометил)-глицин (ИЮПАК).

Структурная формула:

Брутто формула: C₃H₈NO₅P.

Молекулярная масса: 169,1.

Бесцветные кристаллы без запаха. Температура плавления: (189,5 +/- 0,5) °C. Температура разложения 230 °C. Давление паров 1,31 ? 10-2 мПа·(при 25 °C). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода Kow logP < -3,2.

Растворимость в воде: 10,5 г/дм3 (pH 1,9, 20 °C). Нерастворим в большинстве органических растворителей, таких как ацетон, этанол, ксилен. Глифосат и все его соли нелетучи, не разлагаются фотохимически, и стабильны в водных растворах. Глифосат стабилен к гидролизу при pH 3, 6 и 9 (5 — 35 °C). pKa 2,34 (20 °C), 5,73 (20 °C), 10,2 (25 °C). Не горюч.

Острая пероральная токсичность для крыс и мышей (ЛД50) составляет 5 600 и 11 300 мг/кг соответственно. Ингаляционная токсичность (ЛС50) для крыс более 4,98 мг/л воздуха. Малотоксичен для человека, животных, птиц и пчел. Не обладает побочными эффектами.

Область применения. Не селективный системный гербицид. Абсорбируется листьями и быстро перемещается по растению. Не активен при контакте с почвой. Используется для контроля однолетних и многолетних злаковых и широколиственных сорняков. Рекомендован для применения на зерновых, бобовых, масличных культурах, в виноградниках и плодовых садах.

Механизм действия — ингибирование ферментов биосинтеза ароматических кислот, что предотвращает синтез основных ароматических аминокислот, необходимых для биосинтеза белка.

Гигиенические нормативы для глифосата в России: МДУ в плодовых (семечковые, косточковые), овощах, картофеле — 0,3; виноград, ягоды (в том числе дикорастущие) — 0,1; зерно хлебных злаков — 20,0; кукуруза (зерно) — 1,0; соя (сухие бобы) — 20,0; подсолнечник (семена) — 7,0; рапс (зерно) — 10,0; горох (сухой) — 5,0; в масле рапса, подсолнечника, сои — не нормируется.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения глифосата, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0,95

2. Метод измерений

Метод основан на определении глифосата методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием флуоресцентного детектора после извлечения из образцов раствором соляной кислоты и последующей дериватизации.

Идентификация глифосата проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности «Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением» (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 № 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,5 — 1,0 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2 Приготовление растворов

7.2.1. 0,1 н раствор соляной кислоты: 8,1 см3 концентрированной соляной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 000 см3, содержащую 200 см3 бидистиллированной воды, перемешивают и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

7.2.2. 0,025 М раствор натрия тетраборнокислого: 4,88 г натрия тетраборнокислого 10-водного помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

7.2.3. 0,001 М раствор 9-флуоренилметилхлорформиата: 31,8 мг 9-флуоренилметилхлорформиата помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном.

7.2.4. 0,01 М раствор калия фосфорнокислого однозамещенного: 1,36 г KH₂PO₄ помещают в мерную колбу вместимостью 1 000 см3, содержащую 200 см3 дистиллированной воды, перемешивают и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

7.3 Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску глифосата (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

7.3.1.1. Исходный раствор для градуировки с концентрацией 10 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 2,0 см3 основного раствора и доводят до метки бидистиллированной водой. 2,0 см3 исходного раствора для градуировки переносят в градуированные пробирки вместимостью 5 см3 и проводят дериватизацию по п. 9.3.

7.3.2. Приготовление градуировочных растворов. Градуировочные растворы с концентрациями глифосата 0,002; 0,005; 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя 0,025 М раствор натрия тетраборнокислого.

7.3.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 1,0 см3 исходного раствора для градуировки и доводят до метки 0,025 М раствором натрия тетраборнокислого.

7.3.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки 0,025 М раствором натрия тетраборнокислого.

7.3.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки 0,025 М раствором натрия тетраборнокислого.

7.3.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,02 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора № 2 и доводят объем до метки 0,025 М раствором натрия тетраборнокислого.

7.3.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,01 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 2 и доводят объем до метки 0,025 М раствором натрия тетраборнокислого.

7.3.2.6. Раствор № 6 с концентрацией 0,005 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 3 и доводят объем до метки 0,025 М раствором натрия тетраборнокислого.

7.3.2.7. Раствор № 7 с концентрацией 0,002 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 4 и доводят объем до метки 0,025 М раствором натрия тетраборнокислого.

Основной, исходный и градуировочные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 7 дней.

При изучении полноты определения глифосата используют растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему бидистиллированной водой.

7.4 Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация глифосата в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации глифосата в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

C = K·S, где

S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|C - C_{\text{К}}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.} , где

C — аттестованное значение массовой концентрации глифосата в градуировочном растворе;

Cк — результат контрольного измерения массовой концентрации глифосата в градуировочном растворе;

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Пробы семян подсолнечника, рапса, льна, зерна кукурузы и бобов сои хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Отбор проб зерна проводят в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна»; гороха в соответствии с ГОСТ 6201-68 «Горох шлифованный. Технические условия». Пробы гороха, зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Отбор проб яблок производят в соответствии с ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки» и ГОСТ 16270-70 «Яблоки свежие ранних сортов созревания. Технические условия», вишни — в соответствии с ГОСТ 21921-76 «Вишня свежая. Технические условия» и ГОСТ Р 56672-15 «Вишня свежая для промышленной переработки. Технические условия»; винограда — в соответствии с ГОСТ 32786-14 «Виноград столовый свежий. Технические условия».

Зеленую массу хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °C до анализа. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев. Пробы яблок и яблочного сока, винограда и виноградного сока хранят до анализа в герметичной таре в морозильной камере при температуре не выше -18 °C, в холодильнике сок хранят при температуре 0 — 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

9. Проведение определения

9.1 Определение глифосата в зеленой массе растений, зерне

и соломе зерновых колосовых культур, зерне гороха, зерне кукурузы, семенах подсолнечника, рапса, льна, бобах сои, растительном масле

Образец измельченных проб растительной продукции 5 г (соломы — 2 г) помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3 и добавляют 30 см3 0,1 н раствора соляной кислоты. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. Аликвоту экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 300 мм3 с помощью пипетки переносят в пробирки, добавляют 4,7 см3 0,025 М раствора натрия тетраборнокислого и перемешивают вручную. 2,0 см3 раствора образца переносят в градуированные пробирки вместимостью 5 см3 и проводят дериватизацию по п. 9.3.

9.2 Определение глифосата в плодах и соке плодовых

семечковых (яблоки) и плодовых косточковых (вишня), ягодах и соке винограда

Образец измельченных проб растительной продукции или сока 15 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3 и добавляют 30 см3 0,1 н раствора соляной кислоты. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. Аликвоту экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 900 мм3 с помощью пипетки переносят в пробирки, добавляют 4,1 см3 0,025 М раствора натрия тетраборнокислого и перемешивают вручную. 2,0 см3 раствора образца переносят в градуированные пробирки вместимостью 5 см3 и проводят дериватизацию по п. 9.3.

9.3 Дериватизация

К 2,0 см3 приготовленного для дериватизации раствора глифосата (п. 7.3.1.1) или образца добавляют 1 см3 0,001 М ацетонового раствора 9-флуоренилметилхлорформиата, перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Пробирки с реакционной смесью помещают в воздушный испаритель для удаления ацетона в токе воздуха при температуре 40 °C. Водный остаток трижды обрабатывают 1,5 см3 этилацетата для удаления избытка 9-флуоренилметилхлорформиата, этилацетат отбрасывают. Остаток этилацетата удаляют в токе воздуха. Водный остаток доводят до 2 см3 0,025 М раствором натрия тетраборнокислого, переносят в виалы для хроматографирования и анализируют на содержание глифосата по п. 9.4.

9.4 Условия хроматографирования

Высокоэффективный жидкостной хроматограф с флуорометрическим детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми бифункциональными полярными группами C18, (250 ? 4,6) мм, 5 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,01 М KH2PO4 в соотношении 20:80. Скорость потока элюента: 1 см3/мин. Длина волны: \lambda_{\text{тах}} возбуждения 270 нм; \lambda_{\text{тах}} эмиссии 313 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание глифосата в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = \frac{S_{x} \cdot K \cdot V}{P} , где

Sx — площадь пика глифосата на хроматограмме испытуемого образца, (EU);

K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P — навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств глифосата в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор глифосата с концентрацией 0,1 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,5 мг/кг <>, где <> 0,5 мг/кг — предел обнаружения глифосата в семенах подсолнечника).»

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода «добавок».

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime} , где

\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:

Кк = X' — X - Cд, где

X', X, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} (1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Кк| <= К, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , где (3)

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.