МУК 4.1.3413-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пентиопирада в плодах томата и томатном соке, в ягодах винограда и виноградном соке, в семенах и масле подсолнечника, рапса и сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
Актуально на 01.11.2026.
Как цитировать: "МУК 4.1.3413-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пентиопирада в плодах томата и томатном соке, в ягодах винограда и виноградном соке, в семенах и масле подсолнечника, рапса и сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания". МУК 4.1.3413-17. https://bukva.ai/docs/muk-4-1-3413-17
(утв. Роспотребнадзором 14.02.2017)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 14 февраля 2017 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПЕНТИОПИРАДА В ПЛОДАХ ТОМАТА И ТОМАТНОМ СОКЕ, В ЯГОДАХ ВИНОГРАДА И ВИНОГРАДНОМ СОКЕ, В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА, РАПСА И СОИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3413-17
1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, Е.Н. Тестова, Ю.Н. Савушкин).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 14 февраля 2017 г.
Свидетельство о метрологической аттестации МВИ № РОСС RU. 0001.310430/0259.31.03.2016 от 31.03.2016.
Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств пентиопирада в ягодах винограда и виноградном соке в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг, в плодах томата и томатном соке, в семенах и масле подсолнечника, рапса и сои в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг. Методические указания носят рекомендательный характер.
(RS)-N-[2-(1,3-диметилбутил)-3-тиенил]-1-метил-3-(трифторметил)-1H-пиразол-4 карбоксамид
Эмпирическая формула: C16H20F3N3OS.
Агрегатное состояние: порошок.
Цвет, запах: белый, без запаха.
Давление паров: 6,43 x 10-6 Па (25 °C).
Коэффициент распределения октанол-вода: log Kow = 4,36 (pH 4); log Kow = 4,62 (pH 7); log Kow = 4,54 (pH 10).
Температура плавления: 108,7 °C.
Растворимость в воде (мг/дм3, при 20 °C): 7,53.
Растворимость в органических растворителях (г/дм3, 20 °C): ацетон — 557; н-гексан — 0,75; гептан — 0,74; дихлорметан — 531; ксилол — 42,7; толуол — 67,0; метанол — 402; этанол — 234,5; этилацетат — 349.
Стабилен в водных растворах при pH 3 — 10 и температуре 20 °C в низких концентрациях (менее 1 мг/дм3).
Краткая токсикологическая характеристика. Пентиопирад относится к мало опасным по острой оральной (ЛД50 для крыс более 2 000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД50 для крыс более 2 000 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК50 для крыс (4 часа) более 5 669 мг/м3). Не раздражает кожу и слизистую оболочку глаз. Не является мутагеном.
Область применения. Пентиопирад — системный фунгицид, ингибирует процесс дыхания грибов путем связывания с митохондриальным дыхательным комплексом II, останавливает прорастание спор, ингибирует рост мицелия и обладает сильным антиспоруляционным действием.
Пентиопирад используется для борьбы с паршой и мучнистой росой на яблонях с нормой расхода 0,375 — 1,125 л/га.
Пентиопирад рекомендуется для борьбы с грибковыми заболеваниями зерновых колосовых культур — септриозом, фузариозом, сетчатой пятнистостью, листовой ржавчиной и мучнистой росой в дозах 125 — 1 000 г действующего вещества на гектар.
В России установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД — 0,13 мг/кг массы тела человека; ОДК в почве — 0,9 мг/кг; ПДК в воде водоемов — 0,02 мг/дм3; ОБУВ в воздухе рабочей зоны — 0,8 мг/м3; ОБУВ в атмосферном воздухе — 0,02 мг/м3; МДУ в сельскохозяйственной продукции (мг/кг): плодовые семечковые — 0,5.
МДУ в импортируемой продукции (мг/кг): зерно пшеницы — 0,1.
1. Погрешность измерений
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические параметры для пентиопирада
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для пентиопирада
2. Метод измерений
Метод основан на определении пентиопирада с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта на колонках с окисью алюминия, на колонках с флоризилом.
Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1 Средства измерений
| Весы аналитические класса точности — специальный (I) с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г | ГОСТ Р 53228-08 |
|---|---|
| Весы лабораторные общего назначения класса точности — средний (III) с наибольшим пределом взвешивания до 400 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,5 г | ГОСТ Р 53228-08 |
| Колбы мерные на 10, 25, 50, 100, 500 и 1 000 см3 | ГОСТ 1770-74 |
| Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 см3 | ГОСТ 29227-91 |
| pH-метр/милливольтметр с диапазоном измерения 0 — 14 pH; +/- 1 999 мВ | |
| Хроматографическая система, включающая: - хроматограф жидкостный с диодно-матричным детектором, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °C и с возможностью использования стандартного автосамплера с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм3 для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему; - компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ |
|
| Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770-74 |
Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
| Пентиопирад, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 99,9% | CAS 183675-82-3 |
|---|---|
| Алюминий окись для хроматографии, ч | ТУ 6-09-3916-75 |
| Ацетон, осч | ТУ 6-09-3513-86 |
| Ацетонитрил, осч, УФ-200 нм | ТУ 6-09-2167-84 |
| Вода дистиллированная и (или) бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости) | ГОСТ 6709-72 |
| Гелий, очищенный | ТУ 51-940-80 |
| n-Гексан, хч | ТУ 6-09-3818-89 |
| Калий марганцовокислый, чда | ГОСТ 20490-75 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный, 3-водный, чда | ГОСТ 2493-75 |
| Кальций хлористый, ч | ТУ 6-09-4711-81 |
| Кислота муравьиная, чда | ГОСТ 5848-73 |
| Метилен хлористый, хч | ТУ 6-09-2662-77 |
| Натрия гидроокись, хч | ГОСТ 4328-77 |
| Натрий сернокислый, безводный, хч | ГОСТ 4166-76 |
| Натрий углекислый, кислый, хч | ГОСТ 4201-79 |
| Натрий хлористый, хч | ГОСТ 4233-77 |
| Флоризил (магния силикат, 99%,) для колоночной хроматографии, зернение 60/100 меш | CAS 1343-88-0 |
Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
| Алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами | ГОСТ 25336-82 |
|---|---|
| Аппарат для встряхивания проб с возвратно-поступательным направлением колебаний, с максимальной загрузкой 10 кг, с амплитудой колебаний 30 мм и скоростью от 10 до 300 колебаний в минуту | |
| Банки полипропиленовые с крышками для экстракции вместимостью 250 см3 | |
| Ванна ультразвуковая с потребляемой мощностью 140 Вт, рабочей частотой 50 Гц, рабочим объемом 4,5 дм3 | |
| Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная | ГОСТ 5556-81 |
| Виалы объемом 2 см3, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, прокалываемой микрошприцем для автоматического дозатора проб | |
| Воронки делительные на 250 см3 | ГОСТ 25336-82 |
| Воронки лабораторные, стеклянные | ГОСТ 25336-82 |
| Испаритель ротационный вакуумный с ручным подъемником, с диагональным конденсором и объемом испарительной колбы от 50 до 3 000 см3, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об./мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом 5 дм3 и с диапазоном температур от 20 до 100 °C | |
| Колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1 000 см3 | ГОСТ 25336-82 |
| Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100, 250 и 4 000 см3 ТС | ТУ 92-891.029-91 |
| Колонка хроматографическая стальная, длиной 150 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18 | |
| Насос диафрагменный, химически стойкий на 100%, с мощностью электропривода 245 Вт, предельным вакуумом 100 мбар/абс., с избыточным давлением 1 бар и скоростью откачки 34 дм3/мин | |
| Предколонка хроматографическая стальная, длиной 4 мм, внутренним диаметром 4 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18 | |
| Стаканы стеклянные, термостойкие объемом 100 — 500 см3 | ГОСТ 25336-82 |
| Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4 000 см3 и приемной конической колбой объемом 1000 см3 | |
| Фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие, диаметром 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г | ТУ 6-09-1678-86 |
| Шприц инъекционный многократного применения объемом 10 см3 | ГОСТ 22967-90 |
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-91.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению определений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия и флоризилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия и флоризилом и установление градуировочной характеристики.
7.1 Подготовка органических растворителей
7.1.1. Очистка ацетонитрила. Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.
7.1.2. Очистка ацетона. Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 ч. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см3 аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/дм3. Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.
7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды. Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см3 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3 и кипятят в течение 6 ч.
Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.
7.1.4. Очистка хлористого метилена. Хлористый метилен промывают равным объемом 5% раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 12 — 24 ч. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см3 аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °C, отбрасывают.
7.1.5. Очистка гексана. Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 ч. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Гексан перегоняют при температуре 68,7 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 68,7 °C, отбрасывают.
7.2 Приготовление растворов для проведения анализа
7.2.1 Приготовление рабочих растворов
7.2.1.1. Приготовление 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты. В мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 500 см3 бидистиллированной воды, прибавляют 1,0 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки бидистиллированной водой.
7.2.1.2. Приготовление 1 М раствора гидроокиси натрия. В мерную колбу на 500 см3 переносят 20 г гидроокиси натрия, добавляют 200 — 300 см3 дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).
7.2.1.3. Приготовление 0,05 М раствора двузамещенного фосфорнокислого калия. В мерную колбу на 500 см3 переносят 5,7 г двузамещенного фосфорнокислого калия и 50 г хлористого натрия, добавляют 200 — 300 см3 бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения солей, проверяют pH полученного раствора. Если pH раствора менее 9, доводят его до указанного значения с помощью 1 М раствора гидроокиси натрия, контролируя pH. После достижения нужного значения pH объем доводят водой до метки. Раствор хранят не более 3 месяцев при комнатной температуре.
7.2.2 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и 0,1%-й водный раствор муравьиной кислоты.
В плоскодонную колбу объемом 1 дм3 помещают 600 см3 ацетонитрила и 350 см3 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см3/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.
7.2.3 Приготовление градуировочных растворов
7.2.3.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией пентиопирада 1,0 мг/см3. Взвешивают 50 мг пентиопирада в мерной колбе объемом 50 см3. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.
7.2.3.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией пентиопирада 10,0 мкг/см3. Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 2 хранится в холодильнике не более 3 месяцев.
7.2.3.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией пентиопирада 1,0 мкг/см3. Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 3 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 3 хранится в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.3.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией пентиопирада 0,5 мкг/см3. Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 4 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 4 хранится в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.3.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией пентиопирада 0,2 мкг/см3. Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 50 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 5 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 5 хранится в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.3.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией пентиопирада 0,1 мкг/см3. Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 6 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 5 хранится в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.3.7. Стандартные растворы пентиопирада с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4 и 0,2 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы. Из стандартного раствора № 2 методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4 и 0,2 мкг/см3 и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы. Стандартные растворы для внесения хранят в холодильнике не более месяца.
7.2.3.8. Стандартные растворы пентиопирада с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы растительных масел. Из стандартного раствора № 2 методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкг/см3 и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы растительных масел. Стандартные растворы для внесения хранят в холодильнике не более месяца.
7.3 Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации пентиопирада в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3.
В инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
7.4 Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки
экстракта и проверка хроматографического поведения пентиопирада на ней
7.4.1 Подготовка колонки с окисью алюминия
для очистки экстракта
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 см3 ацетонитрила.
7.4.2 Проверка хроматографического поведения пентиопирада
на колонке с окисью алюминия
В концентратор объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора пентиопирада в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 10 см3 ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C.
Исходный концентратор последовательно обмывают двумя порциями по 10 см3 ацетонитрила. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы объемом по 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие пентиопирад, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.
Изучение поведения пентиопирада на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.
7.5 Подготовка колонки с флоризилом для очистки экстракта
и проверка хроматографического поведения пентиопирада на ней
7.5.1 Подготовка колонки с флоризилом для очистки экстракта
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г флоризила с зернением 60/100 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой флоризила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см.
Непосредственно перед использованием колонку последовательно промывают 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 8:2, а затем 15 см3 гексана.
7.5.2 Проверка хроматографического поведения пентиопирада
на колонке с флоризилом
Из стандартного раствора пентиопирада в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/см3, отбирают 1 см3, помещают в круглодонную колбу объемом 100 см3 и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см3 гексана, перемешивают и полученный раствор вносят на колонку. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.
Исходную колбу последовательно обмывают 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и 5 порциями объемом 5 см3 каждая смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие пентиопирад, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.
Изучение поведения пентиопирада на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии флоризила.
7.6 Подготовка и кондиционирование колонки
для жидкостной хроматографии
Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 1 см3/мин 3 — 4 ч.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб проводится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» № 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 55906-13 «Томаты свежие, реализуемые в розничной торговой сети», ГОСТ Р 32876-14 «Консервы. Соки овощные, Сок томатный. ТУ», ГОСТ 32786-14 «Виноград свежий столовый. ТУ», ГОСТ Р 52184-03 «Соки плодовые и ягодные натуральные. ТУ», ГОСТ 22391-89 «Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках», ГОСТ 1129-13 «Масло подсолнечное. ТУ», ГОСТ 31759-12 «Масло рапсовое. ТУ», ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ 17109-88 «Соя. Требования при заготовках и поставках», ГОСТ 31760-12 «Масло соевое. ТУ», ГОСТ 32190-13 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб».
Пробы плодов томатов и ягод винограда хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 — 4 °C в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °C.
Отобранные пробы семян подсолнечника, рапса и сои подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Пробы томатного и виноградного соков, а также подсолнечного, рапсового и соевого масел хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более 10 суток.
9. Выполнение определения
9.1 Плоды томатов и ягоды винограда
9.1.1 Экстракция
Образец измельченных плодов томатов массой 10 г или измельченных ягод винограда массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 30 см3 ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в коническую колбу объемом 250 см3 с 5 г хлорида натрия через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 30 см3 ацетонитрила в тех же условиях. Ацетонитрильные экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 см3 с 5 г хлорида натрия, перемешивают и выдерживают 10 мин при комнатной температуре.
Затем объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку (не растворившуюся соль оставляют в колбе) объемом 250 см3, оставляют до полного разделения слоев в делительной воронке. Нижний водный слой отбрасывают, а верхний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
9.1.2 Очистка экстракта на колонке с флоризилом
Сухой остаток, полученный в п. 9.1.1, растворяют в 1 см3 ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см3 гексана, перемешивают и полученный раствор вносят на колонку, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, элюаты отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 20 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1, вносят на колонку, элюат собирают в концентратор объемом 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °C.
Сухой остаток растворяют в 5 см3 (для ягод винограда — в 2 см3) смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
9.2 Томатный и виноградный сок
9.2.1 Экстракция
Навеску томатного сока массой 10 г или виноградного сока массой 20 г помещают в делительную воронку объемом 250 см3, добавляют 10 см3 насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают содержимое воронки, приливают 20 см3 ацетонитрила и встряхивают содержимое воронки в течение двух минут. После разделения фаз нижний слой сливают в стакан объемом 100 см3, а ацетонитрил пропускают через безводный сульфат натрия и собирают в концентратор объемом 250 см3. Водно-солевую фазу из стакана возвращают в делительную воронку и повторяют экстракцию пентиопирада в ацетонитрил еще 2 раза, используя каждый раз по 20 см3 ацетонитрила и встряхивая смесь в течение двух минут. Объединенный ацетонитрильный экстракт выпаривают до водного остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Далее проводят очистку экстракта по схеме, указанной в п. 9.1.2.
Сухой остаток растворяют в 5 см3 (для виноградного сока — в 2 см3) смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
9.3 Семена подсолнечника, рапса и сои
9.3.1 Экстракция
Образец измельченных семян подсолнечника (рапса или сои) массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 30 см3 ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Ацетонитрильный экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см3 через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 30 см3 ацетонитрила, в тех же условиях. Ацетонитрильные экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
9.3.2 Очистка экстракта на колонке с флоризилом
Сухой остаток, полученный в п. 9.3.1, растворяют в 1 см3 ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см3 гексана и проводят очистку экстракта по схеме, указанной в п. 9.1.2.
9.3.3 Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия
Сухой остаток, полученный в п. 9.3.2, растворяют в 10 см3 ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, наносят на подготовленную колонку, элюат собирают в концентратор. Исходную колбу обмывают 10 см3 ацетонитрила и вносят на колонку. Элюаты объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Сухой остаток растворяют в 5 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
9.4 Масло подсолнечника, рапса и сои
9.4.1 Экстракция
Из пробы растительного масла отбирают в стакан навеску массой 10 г и переносят ее в делительную воронку объемом 250 см3 двумя порциями гексана объемом по 25 см3. Пентиопирад экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 см3, встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой объединяют в концентраторе объемом 250 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Верхний слой (гексан) отбрасывают.
9.4.2 Очистка экстракта перераспределением в системе
несмешивающихся растворителей
К маслянистому остатку, полученному по п. 9.4.1, добавляют 5 см3 ацетонитрила, 100 см3 0,05 М щелочного буфера (pH 9), тщательно обмывают стенки концентратора и переносят в делительную воронку объемом 250 см3. Пентиопирад экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 см3, встряхивая каждый раз делительную воронку по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке хлористый метилен собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2 и 9.3.3.
Сухой остаток растворяют в 5 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм3 пробы вводят в хроматограф.
9.5 Условия хроматографирования
Хроматографическая система, включающая:
- хроматограф жидкостный с диодно-матричным детектором, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °C и стандартным автосамплером с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм3 для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;
- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.
Колонка хроматографическая стальная длиной 150 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 3,5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Предколонка хроматографическая стальная длиной 4 мм, внутренним диаметром 4 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,1%-я муравьиная кислота в соотношении 600:350.
Скорость потока элюента: 0,3 см3/мин.
Чувствительность: не менее 12 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пентиопирада с концентрацией 1,0 мкг/см3, соответственно разбавляют.
10. Обработка результатов
Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание пентиопирада рассчитывают по формуле без учета полноты извлечения вещества из проб:
X = \frac{S_{\text{пр}} \cdot A \cdot V}{100 \cdot S_{\text{ст}} \cdot m} P , где
X — содержание пентиопирада в пробе, мг/кг;
Sст — высота (площадь) пика стандарта, мм;
Sпр — высота (площадь) пика образца, мм;
A — концентрация стандартного раствора, мкг/см3;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г;
P — содержание пентиопирада в аналитическом стандарте, %.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq r , где (1)
X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 \times \sigma_{r} .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг при вероятности P = 0,95, где
\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} , где
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг». <*>
<*> 0,01 мг/кг — предел обнаружения.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
Контроль стабильности градуировочной характеристики для пентиопирада проводят при смене основного градуировочного раствора № 1 каждые шесть месяцев, при смене основных градуировочных растворов № 2, 3, 4, 5 и 6 — каждый месяц, а также в начале и окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание пентиопирада в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см3.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
A = \frac{(X - C)}{C} \cdot 100 \leq 1,48 , где
X — концентрация пентиопирада контрольного измерения, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора пентиопирада в смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
1,48 — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 1,48%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов пентиопирада, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки C_{\partial} должна удовлетворять условию:
C_{\partial} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime} , где
\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} , где
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры Kк рассчитывают по формуле:
\text{К}_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - C_{\partial} , где
\overline{X}\prime , \overline{X} , Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле:
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}}
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Kк) с нормативом контроля (K).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}|}{X_{1} + X_{2}} \cdot 100 \leq R , где (3)
X1, X2 — результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ПЕНТИОПИРАДА ИЗ ПЛОДОВ ТОМАТОВ, ТОМАТНОГО СОКА, ЯГОД ВИНОГРАДА, ВИНОГРАДНОГО СОКА, СЕМЯН И МАСЛА ПОДСОЛНЕЧНИКА, РАПСА И СОИ (5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, P = 0,95)