ГОСТ Р 52147-2003. Национальный стандарт Российской Федерации. Белково-витаминно-минеральные и амидо-витаминно-минеральные добавки. Методы определения содержания ретинола-ацетата (витамина A), эргокальциферола (холекальциферола) (витамина D), токоферола-ацетата (витамина E)
(принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 03.12.2003 № 342-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень национальных стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения Федерального закона «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей» и осуществления оценки соответствия (Распоряжение Правительства РФ от 19.05.2009 № 690-р). Документ введен в действие с 1 января 2005 года.
от 3 декабря 2003 г. № 342-ст
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
БЕЛКОВО-ВИТАМИННО-МИНЕРАЛЬНЫЕ И АМИДО-ВИТАМИННО-МИНЕРАЛЬНЫЕ ДОБАВКИ
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ РЕТИНОЛА-АЦЕТАТА (ВИТАМИНА A), ЭРГОКАЛЬЦИФЕРОЛА (ХОЛЕКАЛЬЦИФЕРОЛА) (ВИТАМИНА D), ТОКОФЕРОЛА-АЦЕТАТА (ВИТАМИНА E)
Protein-vitamin-mineral and amide-vitamin-mineral additives. Methods for the determination of retinol-acetate (vitamin A), argocalciferol (holecalciferol) (vitamin D), tokoferol-acetate (vitamin E)
1 января 2005 года
Предисловие
1. Разработан Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (ОАО «ВНИИКП»);
Всероссийским научно-исследовательским и технологическим институтом птицеводства (ВНИТИП);
Всероссийским научно-исследовательским институтом кормов им. В.Р. Вильямса (ВНИИК).
Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 «Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы».
2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 3 декабря 2003 г. № 342-ст.
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на белково-витаминно-минеральные и амидо-витаминно-минеральные добавки и устанавливает хроматографические методы определения ретинола-ацетата (витамина A), эргокальциферола (холекальциферола) (витамина D), токоферола-ацетата (витамина E).
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.018-93. Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования
ГОСТ 12.1.019-79. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств защиты
ГОСТ 1770-74. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 4147-74. Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия
ГОСТ 4166-76. Натрий сернокислый. Технические условия
ГОСТ 4517-87. Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147-80. Посуда и оборудование фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 9736-91. Приборы электрические прямого преобразования для измерения неэлектрических величин. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 12026-76. Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13496.0-80. Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
ГОСТ 16317-87. Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 19627-74. Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия
ГОСТ 24104-2001. Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 24363-80. Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 28498-90. Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77). Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81). Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ Р 51652-2000. Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия.
3. Определения
3.1. Содержание витамина A: содержание ретинола-ацетата, определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в международных единицах в 1 кг испытуемой пробы (МЕ/кг). 1 МЕ витамина A соответствует 0,344 мкг ретинола-ацетата.
3.2. Содержание витамина E: содержание токоферола-ацетата, определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в миллиграммах в 1 кг (мг/кг) испытуемой пробы.
3.3. Содержание витамина D: содержание эргокальциферола (витамина D_{2} ) или холекальциферола (витамина D_{3} ), определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в международных единицах в 1 кг испытуемой пробы (МЕ/кг). 1 МЕ витамина D соответствует 0,025 мкг эргокальциферола (холекальциферола).
4. Диапазоны измерений содержания витаминов и характеристики погрешности измерений
Диапазоны измерений содержания витаминов и характеристики погрешности измерений приведены в таблице 1.
5. Требования техники безопасности
5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на фотоэлектроколориметр, спектрофотометр и хроматограф.
5.2. Помещение, в котором проводят измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить в вытяжном шкафу.
5.3. При работе с газовыми баллонами необходимо руководствоваться НД [1].
6. Подготовка проб к испытанию
6.1 Отбор проб — по ГОСТ 13496.0.
6.2 Измельчение пробы
6.2.1 Оборудование:
мельница лабораторная электрическая, обеспечивающая измельчение пробы до прохода остатка через сито с отверстиями диаметром 1 мм;
сито с отверстиями диаметром 1 мм.
6.2.2. Из средней пробы исследуемого продукта методом квартования выделяют часть пробы массой не менее 100 г и измельчают на лабораторной мельнице до такого состояния, чтобы весь продукт проходил через сито с отверстиями диаметром 1 мм без остатка. Размолотую пробу тщательно перемешивают.
7. Определение содержания ретинола-ацетата (витамина A) и токоферола-ацетата (витамина E) фотометрическим методом
Сущность метода заключается в омылении образца водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов диэтиловым эфиром, разделении витаминов хроматографией на колонке с окисью алюминия и количественном определении витаминов фотометрическим методом.
7.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Весы лабораторные высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Спектрофотометр типа СФ-26, СФ-46 со спектральным диапазоном работы 186 — 1100 нм, основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%, градуировкой длин волн в ультрафиолетовой (УФ) области — не более 0,1 нм.
Фотоэлектроколориметр с пределом измерений оптической плотности от 0 до 2, основной погрешностью измерений не более 1% и светофильтром длиной волны \lambda = (520 \pm 25)\text{нм} .
Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
Баллон с азотом рабочим давлением от 40 до 60 кг/см2 (от 4 до 6 МПа) [1].
Испаритель ротационный диапазоном измерения рабочего давления от 7 до 760 мм рт. ст. (\text{от }9 \cdot 10^{2}\text{до}10 \cdot 10^{4}\text{Па}) или насос водоструйный по ГОСТ 25336.
Баня водяная с регулятором нагрева.
Термометр жидкостный по ГОСТ 28498.
Печь муфельная электрическая, обеспечивающая поддержание температуры от 0 до 800 °C с погрешностью +/- 10 °C по ГОСТ 9736.
Секундомер [2].
Чашки выпарительные фарфоровые диаметром 123 мм по ГОСТ 9147.
Лампа ультрафиолетовая со светофильтрами \lambda = 260 - 350\text{нм} .
Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание температуры от 0 °C до 110 °C с погрешностью +/- 2 °C [3].
Холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336.
Колбы конические со шлифом \text{К}_{\text{н}} = - 1 - 100(250) - 24/29 по ГОСТ 25336.
Колбы мерные 1(2)-50(100, 200)-2 по ГОСТ 1770.
Воронки делительные вместимостью 250, 500 см3 по ГОСТ 25336.
Цилиндры мерные 1(2, 2а, 3, 4, 4а)-25(100, 250)-2 по ГОСТ 1770.
Воронки для фильтрования ВФ-1-56(75)ХС по ГОСТ 25336.
Пипетки с одной отметкой 1-2-0,5(1,2) по ГОСТ 29169.
Пипетки градуированные 1(2, 3, 5)-1(1а, 2, 2а)-2-0,5(1, 2, 5) по ГОСТ 29227.
Пробирки мерные с притертыми пробками П-1(2)-5(10)-0,1(0,2)ХС по ГОСТ 1770.
Колбы с тубусом вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336.
Колбы круглодонные К-1-100(250)-14/23(19/26) по ГОСТ 25336.
Колонки стеклянные для хроматографии размером 10 x 200 мм.
Эксикатор по ГОСТ 25336, заправленный хлористым кальцием, прокаленным при температуре 250 — 300 °C в течение 2 ч.
Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026 или фильтры [4].
Вата обезжиренная, готовят по ГОСТ 4517.
Витамин E фармакопейный [5].
Спирт этиловый абсолютированный [6] или приготовленный по ГОСТ 4517.
Железо хлорное, раствор массовой долей около 0,2% в абсолютированном этиловом спирте.
Калия гидроокись по ГОСТ 24363, раствор массовой долей 50%.
Натрий сернокислый по ГОСТ 4166, безводный.
Алюминия окись безводная [7].
Эфир петролейный, фракция (40 — 70) °C, не содержащая ненасыщенные и ароматические углеводороды.
Эфир диэтиловый фармакопейный, не содержащий пероксидные соединения (испытание на отсутствие пероксидных соединений — по ГОСТ 4517).
Пирогаллол или гидрохинон по ГОСТ 19627.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652.
o-Фенантролин или \alpha,\alpha\prime - \text{дипиридил} , раствор массовой долей около 0,5% в абсолютированном этиловом спирте.
Кислота аскорбиновая [8].
Фенолфталеин [9], спиртовый раствор массовой долей 1%.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
1. Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и реактивов, по качеству не ниже вышеуказанных.
2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
7.2 Подготовка к испытанию
7.2.1 Приготовление раствора хлорного железа массовой долей около 0,2% в абсолютированном спирте
Навеску реактива массой 0,2 г растворяют в 99,8 см3 абсолютированного этилового спирта.
Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут.
7.2.2. Приготовление раствора o-фенантролина или \alpha,\alpha\prime - \text{дипиридила} массовой долей около 0,5% в абсолютированном этиловом спирте
Навеску реактива массой 0,500 г растворяют в 99,5 см3 абсолютированного этилового спирта.
Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут.
7.2.3 Приготовление безводного сернокислого натрия
Реактив высушивают в сушильном шкафу при температуре (105 +/- 2) °C в течение 3 ч, хранят в склянке с притертой пробкой.
7.2.4 Приготовление окиси алюминия
Реактив прокаливают в муфельной печи при температуре (400 +/- 10) °C в течение 4 ч, охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе. К 97 г реактива добавляют 3 см3 дистиллированной воды и тщательно перемешивают.
После отстаивания в течение не менее 3 ч реактив годен к использованию.
Реактив хранят в склянке с притертой пробкой.
7.2.5 Приготовление раствора \alpha - \text{токоферола} массовой концентрации 1 мг/см3
Навеску токоферола-ацетата массой 0,1120 г в расчете на содержание чистого вещества помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см3, добавляют от 100 до 200 мг аскорбиновой кислоты, 50 см3 этилового спирта и 10 см3 раствора гидроокиси калия массовой долей 50%. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают в водяной бане при температуре (85 +/- 2) °C в течение 25 мин. Затем содержимое колбы быстро охлаждают под струей водопроводной воды до комнатной температуры, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, приливают по 50 см3 дистиллированной воды и диэтилового эфира, встряхивают и отстаивают до разделения слоев.
После расслаивания нижний водно-спиртовый слой сливают в коническую колбу, а эфирный слой оставляют в делительной воронке. В коническую колбу приливают 50 см3 диэтилового эфира, встряхивают, отстаивают и после расслаивания верхний эфирный слой присоединяют к эфирному экстракту в делительной воронке, а к водно-спиртовому слою в конической колбе снова приливают 50 см3 диэтилового эфира и проводят экстракцию, как было указано выше. После расслаивания эфирный слой из конической колбы снова присоединяют к экстракту в делительной воронке.
Объединенные эфирные экстракты промывают дистиллированной водой порциями по 30 см3 до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с фенолфталеином. Промытый экстракт переносят в коническую колбу вместимостью 250 см3, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сернокислого натрия (10 — 15 г). После окончания фильтрации сернокислый натрий три раза промывают порциями (по 20 — 30 см3) диэтилового эфира. Эфир отгоняют в водяной бане при температуре не выше 50 °C в токе азота или под вакуумом, используя водоструйный насос или роторный испаритель.
К сухому остатку приливают 10 — 15 см3 абсолютированного этилового спирта, количественно переносят раствор в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем в колбе до метки этим же спиртом и тщательно перемешивают.
7.2.6 Приготовление раствора \alpha - \text{токоферола} массовой концентрации 20 мкг/см3
1 см3 раствора \alpha - \text{токоферола} массовой концентрации 1 мг/см3 переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят объем в колбе абсолютированным спиртом до метки и тщательно перемешивают.
В полученном растворе проверяют массовую концентрацию \alpha - \text{токоферола} и его чистоту, снимая спектр в пределах 260 — 310 нм на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно абсолютированного этилового спирта. Чистый \alpha - \text{токоферол} имеет симметричный пик максимумом поглощения при длине волны 292 нм.
Массовую концентрацию \alpha - \text{токоферола} в растворе C_{E} , мкг/см3, вычисляют по формуле
C_{E} = \frac{D \cdot 10^{6}}{E_{1\text{см}}^{1\%}100} , (1)
10^{6} — коэффициент пересчета граммов в микрограммы;
E_{1\text{см}}^{1\%} — оптическая плотность раствора \alpha - \text{токоферола} в абсолютированном этиловом спирте массовой концентрации 1 г в 100 см3 при длине волны 292 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см (для \alpha - \text{токоферола} E_{1\text{см}}^{1\%} = 75 ).
7.2.7 Построение градуировочного графика для определения токоферола-ацетата (витамина E)
В пять мерных пробирок вместимостью по 5 см3 приливают 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 и 4,0 см3 раствора \alpha - \text{токоферола} массовой концентрации 20 мкг/см3. В первые четыре пробирки добавляют 3,5; 3,0; 2,0 и 1,0 см3 абсолютированного этилового спирта. Затем в пробирки добавляют по 0,5 см3 раствора o-фенантролина и по 0,5 см3 раствора хлорного железа, перемешивают. Ставят опытную пробу в темное место на 5 мин для развития окраски. По истечении времени измеряют оптические плотности испытуемых растворов в порядке возрастания их концентрации на фотоэлектроколориметре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм при длине волны (520 +/- 25) нм относительно абсолютированного этилового спирта. Одновременно проводят контрольное испытание на реактивы без внесения \alpha - \text{токоферола} .
По полученным данным строят градуировочный график, откладывая на оси ординат значения разности оптической плотности испытуемых растворов и контрольного раствора, на оси абсцисс — содержание \alpha - \text{токоферола} , мкг/5 см3 (10, 20, 40, 60 и 80 мкг/5 см3).
7.2.8 Приготовление элюирующих растворов
7.2.8.1 Приготовление раствора I
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 6 см3 диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.
7.2.8.2 Приготовление раствора II
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 12 см3 диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.
7.2.8.3 Приготовление раствора III
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 30 см3 диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.
7.3 Проведение испытаний
Из-за высокой чувствительности витаминов к ультрафиолетовому свету и воздуху все процедуры, связанные с анализом, следует завершить в течение одного рабочего дня, избегая воздействия натурального и интенсивного флуоресцентного света.
7.3.1 Омыление и экстракция
Навеску исследуемого продукта массой 4,00 — 5,00 г помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см3, приливают 50 см3 этилового спирта, 10 см3 раствора гидроокиси калия массовой долей 50% и добавляют 40 — 50 мг пирогаллола или гидрохинона (на кончике скальпеля).
Колбу соединяют с обратным холодильником, помещают в водяную баню и нагревают при температуре (85 +/- 2) °C в течение 25 мин, периодически перемешивая содержимое колбы. После этого содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры.
Затем в колбу приливают 20 — 25 см3 дистиллированной воды, 50 см3 диэтилового эфира, перемешивают, жидкую часть сливают в делительную воронку вместимостью 500 см3, сохраняя осадок в колбе. Экстракцию витаминов диэтиловым эфиром проводят трижды по 7.2.5.
При образовании устойчивой эмульсии в делительную воронку добавляют 20 см3 этилового спирта.
В объединенный эфирный экстракт добавляют несколько кристаллов бутилокситолуола и промывают его дистиллированной водой порциями по 100 см3 до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с фенолфталеином. Затем экстракт переносят в круглодонную колбу, пропуская его через бумажный фильтр со слоем безводного сернокислого натрия (30 — 50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают 40 см3 диэтилового эфира. Эфир выпаривают досуха в водяной бане при температуре не выше 50 °C в токе азота или под вакуумом на ротационном испарителе. Сухой остаток растворяют в 4 см3 петролейного эфира.
Примечание. Допускается для экстракции применять петролейный эфир.
7.3.2 Подготовка хроматографической колонки
В нижнюю часть колонки помещают кусочек ваты, затем активированную окись алюминия, уплотняя ее постукиванием по колонке деревянной палочкой до высоты сорбента 7 см. Сверху помещают слой безводного сернокислого натрия высотой 1 см.
В колбу с тубусом вставляют резиновую пробку, через сквозное отверстие которой проходит утонченный конец хроматографической колонки. Через колонку при вакууме, создаваемом с помощью водоструйного насоса, пропускают петролейный эфир до полного смачивания слоя окиси алюминия (около 15 см3).
Промывание колонки проводят со скоростью одна капля в секунду, не допуская при этом высыхания верха колонки и просасывания воздуха.
7.3.3 Хроматографическое разделение ретинола и \alpha - \text{токоферола}
4 см3 раствора экстракта испытуемого продукта, полученного по 7.3.1, помещают в колонку, подготовленную по 7.3.2, не допуская высыхания верха колонки. Промывают колонку 15 см3 элюирующего раствора I. Эту фракцию отбрасывают.
\alpha - \text{Токоферол} элюируют от 15 до 25 см3 раствора II, контролируя продвижение витамина в УФ свете ( \alpha - \text{токоферол} имеет голубоватое свечение).
Элюат количественно переносят в коническую колбу вместимостью 50 см3.
К колонке присоединяют другую колбу с тубусом и элюируют ретинол 30 — 35 см3 раствора III, также контролируя продвижение витамина в УФ-свете (ретинол имеет желто-зеленое свечение). Элюат количественно переносят в коническую колбу вместимостью 50 см3 и выпаривают досуха в водяной бане при температуре не выше 50 °C в токе азота или под вакуумом.
Сухой остаток растворяют в 5 — 50 см3 абсолютированного этилового спирта в зависимости от предполагаемого содержания витамина A.
7.3.4. Оптическую плотность полученного раствора ретинола измеряют на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно абсолютированного этилового спирта.
7.3.5 Проведение цветной реакции с раствором \alpha - \text{токоферола}
Собранный и перенесенный в коническую колбу элюат \alpha - \text{токоферола} выпаривают досуха на водяной бане при температуре не выше 50 °C в токе азота или под вакуумом. Остаток растворяют в 10 см3 абсолютированного этилового спирта. Ориентируясь на рецептуру добавки, берут 0,2 — 3,5 см3 раствора и переносят в кювету толщиной поглощающего свет слоя 10 мм или в мерную пробирку вместимостью 5 см3, добавляют соответственно от 3,8 до 0,5 см3 абсолютированного этилового спирта, 0,5 см3 раствора o-фенантролина и 0,5 см3 раствора хлорного железа. Опытную пробу ставят в темное место на 5 мин для развития окраски. По истечении времени измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны (520 +/- 25) нм относительно абсолютированного этилового спирта.
Одновременно проводят контрольное испытание на реактивы без внесения \alpha - \text{токоферола} .
7.4 Обработка и оформление результатов
7.4.1 Содержание ретинола-ацетата X, МЕ/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле
X = \frac{18,3VD \cdot 10^{3} \cdot 1,15}{m} , (2)
где 18,3 — массовая концентрация раствора ретинола в абсолютированном этиловом спирте, имеющего оптическую плотность, равную 1, при длине волны 326 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см, МЕ/см3;
D — оптическая плотность раствора;
10^{3} — коэффициент пересчета граммов в килограммы;
1,15 — коэффициент пересчета ретинола в ретинол-ацетат.
7.4.2 Содержание токоферола-ацетата X, мг/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле
X = \frac{KV \cdot 10^{3} \cdot 1,1}{mV_{1} \cdot 10^{3}} , (3)
где K — масса \alpha - \text{токоферола} , найденная по градуировочному графику, мкг;
10^{3} — коэффициенты пересчета микрограммов в миллиграммы и граммов в килограммы;
1,1 — коэффициент пересчета \alpha - \text{токоферола} в ацетатную форму;
V_{1} — объем раствора, взятый для проведения цветной реакции (0,2 — 3,5), см3.
7.4.3. Результат вычисляют до третьей значащей цифры и округляют до двух значащих цифр.
7.4.4. При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Если расхождение между результатами параллельных определений не превышает допустимое |X_{1} - X_{2}| \leq 0,01dX , где X_{1} , X_{2} и X — результат первого и второго параллельных определений и их среднеарифметическое значение соответственно, то среднеарифметическое значение принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют.
Если расхождения между параллельными определениями вновь превышают регламентируемые допуски, выясняют и устраняют причины плохой сходимости результатов анализа.
Значения d приведены в таблице 2.
По полученному результату анализа и значению относительной погрешности (таблица 1) рассчитывают абсолютную погрешность \Delta по формуле
8. Определение содержания ретинола-ацетата (витамина A), эргокальциферола (холекальциферола) (витамина D), токоферола-ацетата (витамина E) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
Сущность метода заключается в омылении образца водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов диэтиловым эфиром с последующим определением витаминов на жидкостном хроматографе.
При содержании витамина D в испытуемом продукте менее 10 МЕ/г перед проведением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) необходима очистка экстракта на колонке с окисью алюминия по 8.3.2. Анализ проводят из отдельно взятой навески массой 10 г.
8.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Аппаратура, материалы и реактивы по 7.1 со следующим дополнением.
Хроматограф жидкостный «Милихром» с УФ-детектором со спектральным диапазоном 190 — 360 нм, обеспечивающий одновременное измерение на не менее 3 длинах волн с уровнем шумов не более 10^{- 4} единиц оптической плотности (е. о. п.).
Колонка аналитическая хроматографическая для ВЭЖХ, размером 80 (64, 120) x 2 мм, заполненная сорбентом Силасорб 600 (размер частиц 5 мкм) с эффективностью не ниже 5000 теоретических тарелок.
Прибор для перегонки при атмосферном давлении [10].
Ретинол-ацетат (витамин A) фармакопейный [11].
Эргокальциферол кристаллический (витамин D_{2} ) [12] или холекальциферол кристаллический (витамин D_{3} ) [13].
Спирт изопропиловый [14].
Гексан [15].
Алюминия окись для хроматографии [16].
2,6-Ди-трет-бутил-п-крезол (бутиолокситолуол) [17].
Примечание. Допускается применение других типов хроматографов, сорбентов и соответствующих им растворителей, обеспечивающих эффективное разделение исследуемых компонентов. При этом условия разделения витаминов подбираются самостоятельно каждым пользователем.
8.2 Подготовка к испытанию
8.2.1 Приготовление элюирующего раствора
Готовят смесь гексана с изопропиловым спиртом в объемном соотношении 98,5:1,5 (98:2).
8.2.2 Очистка изопропилового спирта
Изопропиловый спирт перегоняют над гидроокисью калия или натрия (10 г гидроокиси требуется для перегонки 1 дм3 спирта).
Реактив должен иметь оптическую плотность не более 0,1 е. о. п. при \lambda = 320 - 350\text{нм} относительно дистиллированной воды.
8.2.3 Приготовление окиси алюминия
Реактив прокаливают в муфельной печи при температуре (750 +/- 10) °C в течение 4 ч, охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе. К 91 г реактива добавляют 9 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и хранят в посуде с притертой пробкой.
Годен для использования после отстаивания в течение 3 ч.
8.2.4. Приготовление безводного сернокислого натрия — по 7.2.3.
8.2.5 Приготовление растворов ретинола
8.2.5.1 Приготовление раствора ретинола массовой концентрации 1000 МЕ/см3
Навеску ретинола-ацетата, соответствующую 50000 МЕ препарата, помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 см3, добавляют около 200 мг пирогаллола или гидрохинона (на кончике скальпеля), 30 см3 этилового спирта и 5 см3 раствора гидроокиси калия массовой долей 50%. Колбу соединяют с обратным холодильником и проводят омыление в водяной бане при температуре (85 +/- 2) °C в течение 30 мин, охлаждают до комнатной температуры под струей водопроводной воды и добавляют 15 см3 дистиллированной воды. Затем содержимое колбы переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, промывают колбу 20 см3 этилового спирта, который тоже переносят в делительную воронку. Добавляют 30 см3 смеси диэтилового эфира и гексана в объемном соотношении 1:1, полученную смесь тщательно перемешивают. После расслаивания нижний слой (водно-спиртовый) сливают в коническую колбу, а гексано-эфирный оставляют в делительной воронке. Эту операцию экстракции ретинола гексано-эфирной смесью из водно-спиртового слоя в конической колбе проводят еще дважды по 7.2.5, каждый раз сливая в делительную воронку гексано-эфирный слой. Объединенный экстракт в делительной воронке промывают дистиллированной водой порциями по 30 см3 до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с раствором фенолфталеина. Промытый экстракт переносят в коническую колбу вместимостью 250 см3, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сернокислого натрия (40 — 50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают дважды порциями гексано-эфирной смеси (20 — 30 см3). Экстракт выпаривают досуха в водяной бане при температуре не выше 60 °C в токе азота или под вакуумом на ротационном испарителе. Сухой остаток растворяют в гексане, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавляют 100 мг бутилокситолуола, перемешивают, объем раствора в колбе доводят гексаном до метки и снова тщательно перемешивают.
8.2.5.2 Приготовление градуировочных растворов ретинола массовой концентрации 20, 100 и 500 МЕ/см3
В три мерные колбы вместимостью по 50 см3 помещают 1; 5 и 25 см3 раствора ретинола массовой концентрации 1000 МЕ/см3, доводят объемы растворов в колбах до метки гексаном и тщательно перемешивают.
Оптическую плотность растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно гексана.
\text{С}_{\text{А}} = \frac{D \cdot 10^{6}}{E_{1\text{см}}^{1\%}100 \cdot 0,3} , (4)
где D — оптическая плотность раствора ретинола;
10^{6} — коэффициент пересчета граммов в микрограммы;
E_{1\text{см}}^{1\%} — оптическая плотность раствора ретинола в гексане массовой концентрации 1 г в 100 см3 при длине волны 326 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см (для ретинола E_{1\text{см}}^{1\%} = 1830 );
0,3 — коэффициент пересчета массы ретинола в МЕ, мкг/МЕ.
8.2.6 Приготовление растворов \alpha - \text{токоферола}
8.2.6.1 Приготовление раствора \alpha - \text{токоферола} массовой концентрации 1000 мкг/см3
Навеску витамина E массой 0,1120 г в расчете на содержание чистого вещества помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см3 и проводят омыление, экстракцию и обезвоживание по 7.2.5.
После выпаривания сухой остаток растворяют в 100 см3 гексана.
8.2.6.2 Приготовление градуировочных растворов \alpha - \text{токоферола} массовой концентрации 20, 100 и 500 мкг/см3
В три мерные колбы вместимостью 50 см3 помещают 1; 5 и 25 см3 раствора \alpha - \text{токоферола} массовой концентрации 1000 мкг/см3, доводят объем раствора в колбах до метки гексаном и тщательно перемешивают.
Массовые концентрации \alpha - \text{токоферола} в растворах проверяют спектрофотометрически по 7.2.6 и вычисляют по формуле 1.
8.2.7 Приготовление растворов витамина D
8.2.7.1 Приготовление раствора витамина D массовой концентрации 20000 МЕ/см3
Навеску кристаллического эргокальциферола (холекальциферола) массой 0,100 г помещают в мерную колбу вместимостью 200 см3, растворяют в гексане, объем раствора в колбе доводят до метки гексаном и тщательно перемешивают.
8.2.7.2 Приготовление градуировочных растворов витамина D массовой концентрации 50 и 100 МЕ/см3
В две мерные колбы вместимостью 200 см3 помещают 0,5 и 1,0 см3 раствора витамина D массовой концентрации 20000 МЕ/см3. Объемы растворов в колбах доводят до метки гексаном и тщательно перемешивают.
Оптическую плотность растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 265 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно гексана.
Массовую концентрацию витамина D в растворе C_{D} , МЕ/см3, вычисляют по формуле
\text{С}_{D} = \frac{D \cdot 10^{6}}{E_{1\text{см}}^{1\%}100 \cdot 0,025} , (5)
где D — оптическая плотность раствора витамина D;
10^{6} — коэффициент пересчета граммов в микрограммы;
E_{1\text{см}}^{1\%} — оптическая плотность раствора витамина D в гексане массовой концентрации 1 г в 100 см3 раствора при длине волны 265 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см (для витамина D_{2} E_{1\text{см}}^{1\%} = 465 ; для витамина D_{3} E_{1\text{см}}^{1\%} = 500 );
0,025 — коэффициент пересчета массы витамина D в МЕ, мкг/МЕ.
8.2.8. В растворы витаминов добавляют несколько кристаллов 2,6-ди-трет-бутил-п-крезола (бутиолокситолуола) и хранят в холодильнике не более 1 мес.
8.3 Проведение испытания
8.3.1 Омыление и экстракция
Навеску исследуемого продукта массой 5,00 — 10,00 г помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см3, добавляют 100 — 150 мг пирогаллола или гидрохинона (на кончике скальпеля) и соответственно 50 — 70 см3 этилового спирта и 10 — 15 см3 раствора гидроокиси калия массовой долей 50%. Дальнейшую процедуру омыления и экстракции проводят по 7.3.1. Сухой остаток витаминов растворяют в 4 см3 гексана.
Примечание. Допускается для экстракции применять петролейный эфир.
8.3.2 Очистка раствора, полученного по 8.3.1, на колонке с окисью алюминия
8.3.2.1 Подготовка хроматографической колонки — по 7.3.2.
8.3.2.2 Элюирование витамина D
В колонку (8.3.2.1), не допуская высыхания верха колонки, вносят 4 см3 раствора (8.3.1) и промывают ее 20 см3 петролейного эфира и 4 см3 смеси петролейного и диэтилового эфира в объемном соотношении 1:1. Эту фракцию отбрасывают.
Витамин D элюируют 20 см3 смеси петролейного и диэтилового эфира в объемном соотношении 1:1. Элюат количественно переносят в коническую колбу вместимостью 50 см3 и выпаривают досуха в водяной бане под током азота при температуре (60 +/- 2) °C.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 гексана.
Полученный раствор (далее испытуемый раствор) используют для ВЭЖХ.
8.3.3 Подготовка жидкостного хроматографа к работе
Подготовку прибора осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
Перед началом работы колонку промывают элюентом при скорости его подачи 100 — 200 мкдм3/мин в течение 5 — 10 мин.
8.3.4 Выполнение измерений на хроматографе «Милихром»
8.3.4.1 Условия проведения измерений
Измерения проводят в следующих условиях:
а) разделение компонентов проводят на колонке размером 64 (80, 120) x 2 мм;
в) элюент — гексан-изопропиловый спирт в объемном соотношении 98,5:1,5 (98:2);
г) рабочие длины волн УФ-детектора — 264, 292 и 324 нм (соответственно для витаминов D, E, A);
д) скорость элюирования — 150 — 200 мкдм3/мин;
е) объем анализируемого раствора — 10 — 40 мкдм3 для витамина D и 4 — 5 мкдм3 для витаминов A, E.
8.3.4.2 Проведение измерений испытуемого раствора
Для измерений используют метод внешнего стандарта. В колонку хроматографа последовательно вводят равные объемы испытуемого и градуировочного растворов.
В качестве градуировочного выбирают раствор, высота пика которого наименее отличается от высоты пика испытуемого раствора.
Концентрация градуировочных растворов должна уточняться в день их использования по 8.2.5.2, 8.2.6.2 и 8.2.7.2.
Пик витамина на хроматограмме испытуемого раствора идентифицируют по времени удерживания.
Примеры хроматограмм экстрактов витаминов A, D, E из белково-витаминно-минеральных добавок представлены в Приложении А.
8.4 Обработка результатов
8.4.1. Содержание витаминов X, витамина A — МЕ/кг, витамина E — мг/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле
X = \frac{ch_{\text{обр}}V \cdot 10^{3} \cdot \alpha}{h_{\text{гр}}m} , (6)
где c — концентрация используемых градуировочных растворов, МЕ/см3 (ретинол), мг/см3 (\alpha - \text{токоферол}) ;
h_{\text{обр}} — среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика испытуемого раствора для двух параллельных определений анализируемого компонента, мм или е. о. п.;
V — объем разведения, см3 (4 см3);
10^{3} — коэффициент пересчета граммов в килограммы;
\alpha — коэффициент пересчета в ацетатную форму (для витамина A \alpha = 1,15 , для витамина E \alpha = 1,1 );
h_{\text{гр}} — среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика градуировочного раствора для двух параллельных определений анализируемого компонента, мм или е. о. п.;
m — масса навески испытуемой пробы, г.
Примечание. При расчете содержания витамина A высоты (площади) пиков испытуемого и градуировочного растворов рассчитывают как сумму высот (площадей) цис- и транс-формы ретинола.
8.4.2 Содержание витамина D X, МЕ/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле
X = \frac{ch_{\text{обр}}V \cdot 10^{3} \cdot 1,15}{h_{\text{гр}}m} , (7)
где c — концентрация используемого градуировочного раствора, МЕ/см3;
h_{\text{обр}} — среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика испытуемого раствора для двух параллельных анализов, мм или е. о. п.;
V — объем разведения, см3 (4 см3);
10^{3} — коэффициент пересчета граммов в килограммы;
1,15 — коэффициент, учитывающий превращение витамина D в провитамин;
h_{\text{гр}} — среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика градуировочного раствора для двух параллельных анализов, мм или е. о. п;
m — масса навески испытуемой пробы, г.
При определении витамина D, если в качестве градуировочного вещества используют эргокальциферол (витамин D_{2} ), то числитель в формуле дополнительно умножают на коэффициент 0,97.
8.4.3. Результаты вычисляют до третьей значащей цифры и округляют до двух значащих цифр.
8.4.4. Контроль сходимости результатов параллельных определений и представление результатов по 7.4.4.
9. Контроль точности испытаний
9.1. Контроль сходимости результатов параллельных определений — по 7.4.4.
9.2. Для контроля воспроизводимости используют рабочие пробы. Каждую пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой настоящего стандарта, получают два результата испытаний в разных лабораториях или в одной, но выполненные разными исполнителями на разном оборудовании с использованием реактивов разных партий в разное время. Воспроизводимость считают удовлетворительной, если |\overline{X_{1}} - \overline{X_{2}}| \leq 0,01D\overline{X} , где \overline{X_{1}} , \overline{X_{2}} и \overline{X} — результаты испытаний одной и той же пробы, полученные в двух разных лабораториях или в разных условиях в одной лаборатории, и их среднеарифметическое значение. Значение D приведено в таблице 2.
9.3. Контроль точности выполняют методом добавок. Рабочую пробу делят на две равные части, первую из которых анализируют в соответствии с методикой, а во вторую вводят известную добавку витамина и затем анализируют в соответствии с методикой настоящего стандарта. Значение добавки должно составлять 50% — 150% содержания витамина в испытуемой пробе. Точность контрольных испытаний признают удовлетворительной, если |\overline{X_{\text{д}}} - \overline{X} - C| \leq K , где \overline{X_{\text{д}}} , \overline{X} и C — результаты контрольных испытаний пробы с добавкой, без добавки и значение добавки. Значение норматива K для вероятности P = 0,90 вычисляют по формуле
K = 0,84 \sqrt{\Delta_{x}^{2} + \Delta_{x_{\text{д}}}^{2}} , (8)
где \Delta_{x} и \Delta_{x_{\text{д}}} — значения погрешности результатов анализа пробы без добавки и пробы с добавкой, вычисленные по 7.4.4.
Пример - Проведен анализ пробы с добавкой (X_{\text{д}} = 40\text{МЕ}/\text{кг}) и без добавки (X = 30 МЕ/кг) на содержание витамина A. Значение добавки составляет C = 20 МЕ/кг, значение относительной погрешности \delta = 25\% . Результат контрольного анализа равен:
(X_{\text{д}} - X - C) = 40 - 30 - 20 = 10.
Норматив контроля точности находят по формуле
K = 0,84 \sqrt{(0,01 \cdot 25 \cdot 40)^{2} + (0,01 \cdot 25 \cdot 30)^{2}} = 10,5.
Анализ выполнен с достаточной точностью, так как результат контрольного анализа меньше норматива контроля точности (10 < 10,5).
(справочное)
ХРОМАТОГРАММЫ ЭКСТРАКТОВ ВИТАМИНОВ A, D, E
Рисунок А.1. Хроматограмма экстракта витамина A:
1 — цис-форма, 2 — транс-форма
1. ПВ 10-115-96. Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением
2. ТУ 25-1819.0021-90. Секундомеры механические «Слава»
3. ТУ 64-1.1411-76. Шкаф сушильный
4. ТУ 6-09-1678-86. Фильтры обеззоленные (белая, красная, синяя ленты)
5. ГФ СССР-Х ст. 695. Токоферола-ацетат
6. ТУ 84-11-99-89. Этиловый абсолютированный спирт
7. МРТУ 6-09-426-70. Алюминия окись безводная
8. ГФ СССР-Х ст. 6. Кислота аскорбиновая
9. ТУ 6-09-53-60-87. Фенолфталеин (индикатор)
10. Воскресенский П.И. Техника лабораторных работ. Химия, М., 1969, стр. 490
11. ГФ СССР-Х ст. 579. Раствор ретинола-ацетата в масле 3,44%
12. ФС 42-1764-96. Эргокальциферол кристаллический
13. ФС 421046299. Витамин D_{3} 1000000 МЕ/г субстанция (производитель «Хоффманн — Ля Рош», Швейцария)
14. ТУ 6.09-402-87. 2-Пропанол (изопропиловый спирт химически чистый)
16. ТУ 6-09-3916-85. Окись алюминия для хроматографии
17. ТУ 6.09-10-9954-74. 2,6-Ди-трет-бутил-п-крезол.
------------------------------------------------------------------