ГОСТ Р 51940-2002. Государственный стандарт Российской Федерации. Соки фруктовые и овощные. Метод определения D-яблочной кислоты
(принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 25.09.2002 № 348-ст)
Внимание
Документ утратил силу с 1 июля 2019 года в связи с изданием Приказа Росстандарта от 26.06.2018 № 355-ст. Взамен введен в действие ГОСТ 34408-2018. Документ утратил силу с 1 июля 2019 года в связи с изданием Приказа Росстандарта от 26.06.2018 № 355-ст. Взамен введен в действие ГОСТ 34408-2018. Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей» (ТР ТС 023/2011) и осуществления оценки (подтверждения) соответствия продукции (Решение Комиссии Таможенного союза от 09.12.2011 № 882). Документ включен в Перечень национальных стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения Федерального закона «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей» и осуществления оценки соответствия (Распоряжение Правительства РФ от 19.05.2009 № 690-р). С 1 июля 2003 года до вступления в силу технических регламентов акты федеральных органов исполнительной власти в сфере технического регулирования носят рекомендательный характер и подлежат обязательному исполнению только в части, соответствующей целям, указанным в пункте 1 статьи 46 Федерального закона от 27.12.2002 № 184-ФЗ. Документ введен в действие с 1 октября 2003 года.
ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ
flowchart LR n0["ГОСТ Р 51940-2002"]:::rst click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-51940-2002" "ГОСТ Р 51940-2002. Государственный стандарт Российской Федерации. Соки фруктовые и овощные. Метод определения D-яблочной кислоты (принят и введен в действие Постановлением Госстанд" n1["ГОСТ 34408-2018"]:::doc click n1 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-34408-2018" "ГОСТ 34408-2018. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение D-яблочной кислоты ферментативным методом (введен в действие Приказом Росстандарта от 26.06.2018 N 355-" n0 --> n1 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
от 25 сентября 2002 г. № 348-ст
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ D-ЯБЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ
Fruit and vegetable juices. Method for determination of D-malic acid content
Предисловие
1. Разработан Московским государственным университетом пищевых производств.
Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность».
2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 25 сентября 2002 г. № 348-ст.
3. Настоящий стандарт за исключением раздела 2 и пунктов 3.2, 5.3 - 5.5, 6.1, 6.5 и 6.6 представляют собой аутентичный текст национального стандарта ФРГ ДИН ЕН 12138-97 «Фруктовые и овощные соки. Ферментативное определение D-яблочной кислоты. Спектрофотометрическое определение НАД».
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на фруктовые и овощные соки, нектары и сокосодержащие напитки и устанавливает метод определения массовой концентрации D-яблочной кислоты.
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 1770-74. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3769-78. Аммоний сернокислый. Технические условия
ГОСТ 4328-77. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9262-77. Кальция гидроокись. Технические условия
ГОСТ 24104-88 <*>. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
<*> С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001.
ГОСТ 24363-80. Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81). Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
ГОСТ Р 51652-2000. Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия.
3. Определение, обозначения и сокращения
3.1 В настоящем стандарте применяют следующий термин с соответствующим определением:
Массовая концентрация D-яблочной кислоты во фруктовых и овощных соках, нектарах и сокосодержащих напитках: массовая концентрация D-яблочной кислоты, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в граммах на кубический дециметр.
3.2 В настоящем стандарте применяют следующие обозначения и сокращения:
НАД — \beta - \text{никотинамидадениндинуклеотид} ;
НАДH — \beta - \text{никотинамидадениндинуклеотид} , восстановленная форма;
Е — международная единица, определяющая количество (активность) фермента, который служит катализатором для превращения 1 мкмоля вещества в минуту при 25 °C.
4. Сущность метода
Метод основан на ферментативном преобразовании [1, 2] D-яблочной кислоты в оксалоацетат под действием НАД в присутствии D-МДГ и спектрофотометрическом измерении массовой концентрации образовавшегося НАДH, эквивалентного массовой концентрации D-яблочной кислоты в пробе. Оксалоацетат в конце реакции распадается на пируват и углекислый газ.
В ходе анализа протекает следующая ферментативная реакция:
D - \text{яблочнаякислота} + \text{НАД}^{+}<^{D - \text{МДГ}}>\text{пируват} + \text{СО}_{2} + \text{НАД}H + H^{+} . (1)
В связи с тем, что фермент D-МДГ не обладает абсолютной специфичностью, при испытаниях проб, содержащих наряду с D-яблочной L-винную кислоту, для связывания последней воздействуют гидроокисью кальция и этиловым спиртом.
5. Реактивы
5.1 Общие требования
При проведении анализа используют реактивы х.ч., ч.д.а. и дистиллированную воду по ГОСТ 6709.
Препараты НАД должны содержать не менее 90% основного вещества.
Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов для определения D-яблочной кислоты и отдельные реактивы при условии, что качество реактивов не ниже указанного в настоящем стандарте.
5.2 Стандартный набор состоит из трех реактивов.
5.2.1. Реактив 1 — HEPES-буфер (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоновая кислота) объемом 30 см3 и активной кислотностью 9,0 pH, содержащий стабилизаторы [3].
5.2.2 Раствор реактива 2 — НАД
Флакон, содержащий 0,21 г лиофильно высушенного НАД [3], растворяют в 4 см3 дистиллированной воды.
5.2.3 Раствор реактива 3 — D-МДГ удельной активностью около 13 Е/см3
Одну из трех содержащихся в наборе порций лиофильно высушенной D-МДГ [3] растворяют в 0,6 см3 дистиллированной воды.
5.3 Кальция гидроокись по ГОСТ 9262.
5.4. Спирт этиловый по ГОСТ Р 51652 массовой долей основного вещества 96%.
5.5 Калия гидроокись по ГОСТ 24363.
6. Аппаратура
Обычная лабораторная аппаратура, а также:
6.1. Дозаторы пипеточные объемами доз 0,02; 0,05; 0,10; 0,50; 1,0; 2,0; 5,0 и 10 см3 и относительной погрешностью дозирования +/- 1% [4] или пипетки градуированные по ГОСТ 29227, номинальной вместимостью 0,02; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 см3, 2-го класса точности.
6.2. Кюветы фотометрические из оптического стекла или пластмассы толщиной поглощающего слоя 1 см для измерений при длинах волн 334, 340 или 365 нм.
6.3. Шпатели пластиковые или палочки стеклянные оплавленные длиной от 10 до 15 см для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.
6.4. Спектрофотометр или фотометр фотоэлектрический для измерений при длинах волн 334, 340 или 365 нм, допускаемой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания +/- 1%.
6.5. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, наибольшим пределом взвешивания 20 г, 2-го класса точности.
6.6. Колбы мерные по ГОСТ 1770 номинальной вместимостью 50 см3.
6.7 Фильтры мембранные диаметром пор 0,2 мкм.
7. Проведение испытания
7.1 Подготовка пробы к испытанию
7.1.1 Стандартная методика
Как правило, пробы не нуждаются в особых методиках подготовки к испытаниям. Результаты испытаний, выполненных в соответствии с настоящей методикой, выражают в миллиграммах на кубический дециметр.
Испытания концентрированных продуктов проводят после их разбавления дистиллированной водой до получения значения относительной плотности разбавленного продукта согласно рецептуре натурального сока, нектара или сокосодержащего напитка. При этом относительную плотность разбавленной пробы выражают в граммах на кубический дециметр.
Результаты испытаний концентрированного продукта могут быть также выражены в миллиграммах на килограмм. При расчете результата испытаний учитывают массу пробы концентрированного продукта и фактор разбавления.
При испытании продуктов высокой вязкости и/или с очень большим содержанием мякоти результаты выражают в миллиграммах на килограмм продукта.
Продукты с мутной взвесью перед испытанием хорошо перемешивают и осветляют путем центрифугирования.
Сильно окрашенные продукты разбавляют дистиллированной водой.
7.1.2 Модицированная методика (для проб с высокой концентрацией винной кислоты)
К 25 см3 сока, нектара или сокосодержащего напитка добавляют 0,125 г сухой гидроокиси кальция и 5 см3 этилового спирта. Пробу перемешивают 2 мин. Активную кислотность раствора устанавливают равной 7 — 8 pH, добавляя сухую гидроокись калия. Раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой. При проведении ферментативного определения используют прозрачную осветленную пробу. При необходимости раствор осветляют по 7.1.1.
7.2 Испытание
7.2.1 Общие требования
Испытание проводят при постоянной температуре от 20 до 25 °C. Допускается проводить испытание при постоянной температуре от 25 до 37 °C при условии получения равноценных результатов.
При использовании спектрофотометра с переменной длиной волны измерения проводят при длине волны 340 нм, при использовании спектрофотометра на ртутной лампе — при длине волны 334 или 365 нм.
Буферные растворы, растворы проб, ферментов и коферментов дозируют градуированными пипетками или автоматическими дозаторами.
Для контроля точности результатов определения используют стандартный раствор D-яблочной кислоты.
7.2.2 Контрольный раствор
В кювету спектрофотометра (фотометра) вносят 1,00 см3 HEPES-буфера по 5.2.1; 0,10 см3 раствора НАД по 5.2.2 и 1,80 см3 дистиллированной воды, перемешивают пластиковым шпателем или стеклянной палочкой. Раствор выдерживают 6 мин и измеряют оптическую плотность относительно оптической плотности воздуха — A_{1\text{к}} .
7.2.3 Раствор пробы
В кювету спектрофотометра (фотометра) вносят 1,00 см3 HEPES-буфера по 5.2.1; 0,10 см3 раствора НАД по 5.2.2; 1,70 см3 дистиллированной воды и 0,10 см3 подготовленной пробы, перемешивают пластиковым шпателем или стеклянной палочкой. Раствор выдерживают 6 мин и измеряют оптическую плотность относительно оптической плотности воздуха — A_{1\text{пр}} .
7.2.4 Ферментативная реакция и количественное определение
В кюветы с контрольным раствором по 7.2.2 и раствором пробы по 7.2.3 вносят по 0,05 см3 раствора D-МДГ по 5.2.3 и перемешивают пластиковым шпателем или стеклянной палочкой. Через 20 мин измеряют оптические плотности растворов относительно оптической плотности воздуха — A_{2\text{пр}} и A_{2\text{к}} . Показания прибора проверяют повторным считыванием оптических плотностей через 5 мин. Если оптические плотности растворов увеличиваются с течением времени, то окончательные значения оптических плотностей определяют методом экстраполяции на момент внесения раствора D-МДГ по 5.2.3.
Примечание. При появлении побочных, так называемых «медленнотекущих», реакций расчет окончательных значений оптической плотности проводят по методике, приведенной в Приложении А.
8. Выражение результатов
Разность измеренных величин оптических плотностей \Delta A вычисляют по формуле
Массовую концентрацию D-яблочной кислоты в пробе \rho , мг/дм3, вычисляют в соответствии с законом Ламберта-Бера по формуле
где M — молярная масса D-яблочной кислоты, г/моль (M = 134,09 г/моль);
V_{1} — общий объем раствора в кювете, см3;
F — фактор разбавления по 7.1.1 или 7.1.2;
\epsilon — молярный коэффициент поглощения НАДH, \text{дм}^{3} \cdot \text{ммоль}^{- 1} \cdot \text{см}^{- 1} :
\delta — толщина поглощающего слоя в кювете, см;
При отсутствии отклонений от объемов, указанных в 7.2, формула принимает вид
При использовании имеющихся в продаже отдельных реактивов численный коэффициент (3,956) в формуле (4) может быть иным из-за изменения общего объема раствора в кювете (V_{1}) .
За результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, округленное до 0,1 мг/дм3.
9. Точность определения
Характеристики точности метода вычислены по статистическим результатам кругового испытания (Приложение Б).
9.1 Сходимость
Абсолютное расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать более чем в 5% случаев значения показателя сходимости r, мг/дм3, вычисляемого по формуле
где \rho_{1} — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений массовой концентрации D-яблочной кислоты, мг/дм3.
9.2 Воспроизводимость
Абсолютное расхождение между результатами двух измерений, выполненных в двух лабораториях, не должно превышать более чем в 5% случаев значения показателя воспроизводимости R, мг/дм3, вычисляемого по формуле
где \rho_{2} — среднеарифметическое значение результатов двух измерений массовой концентрации D-яблочной кислоты, мг/дм3.
10. Отчет об испытании
В отчете об испытании должны быть указаны:
- информация, которая необходима для идентификации пробы (вид пробы, данные изготовителя, описание пробы);
- обозначение настоящего стандарта;
- дата и способ отбора пробы (если возможно);
- дата доставки пробы;
- результаты испытания и наименования единиц измерений, в которых они приводятся;
- дата испытания;
- информация о выполнении условий сходимости метода;
- замечания об особенностях проведения испытания;
- особые условия проведения испытания, которые не учтены настоящим стандартом, но могли бы оказать влияние на результаты испытания.
Медленнотекущие реакции возникают вследствие присутствия в матрице пробы ферментов, не указанных в стандарте, а также вследствие взаимодействия побочных компонентов матрицы с реактивами, участвующими в ферментативной реакции.
При проведении запланированной ферментативной реакции оптическая плотность через 10 — 20 мин принимает постоянное значение, которое зависит от скорости специфичной ферментативной реакции. При появлении медленнотекущей реакции оптическая плотность раствора пробы в кювете меняется с течением времени.
В случае возникновения медленнотекущей реакции проводят повторные определения оптической плотности раствора пробы в кювете через каждые 2 — 5 мин. После выполнения 5 — 6 повторных определений и при условии достижения постоянного изменения оптической плотности за единицу времени (\Delta A/\Delta t = const) фотометрические измерения прекращают.
По полученным данным строят график зависимости оптической плотности A от времени t.
Для определения окончательного значения оптической плотности, используемого при расчете массовой концентрации испытуемого вещества, экстраполируют кривую на момент внесения фермента в реакционную систему ( t_{0} , рисунок А.1). Для получения достоверных результатов испытания пробы разность конечного (A_{f}) и начального (A_{i}) значений оптических плотностей должна быть не менее 0,040.
При проведении в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2 круговых испытаний получены следующие характеристики точности метода, приведенные в таблице Б.1, и установлена линейная зависимость сходимости и воспроизводимости от среднеарифметического массовой концентрации D-яблочной кислоты.
Испытание проведено под руководством Международной федерации производителей фруктовых соков (г. Париж, Франция).
Год проведения кругового испытания — 1991.
Число участвовавших лабораторий - 24/18.
Количество проб - 3 (с добавкой D-яблочной кислоты).