ГОСТ Р 50928-96. Государственный стандарт Российской Федерации. Премиксы. Методы определения витаминов A, D, E
(принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 29.07.1996 № 487)
Внимание
Документ утратил силу с 1 июля 2014 года в связи с изданием Приказа Росстандарта от 28.06.2013 № 306-ст. Взамен введен ГОСТ 32043-2012. Документ утратил силу с 1 июля 2014 года в связи с изданием Приказа Росстандарта от 28.06.2013 № 306-ст. Взамен введен ГОСТ 32043-2012. Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания» (ТР ТС 027/2012) и осуществления оценки (подтверждения) соответствия продукции (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 18.10.2012 № 191).
ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ
flowchart LR n0["ГОСТ Р 50928-96"]:::rst click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-50928-96" "ГОСТ Р 50928-96. Государственный стандарт Российской Федерации. Премиксы. Методы определения витаминов A, D, E (принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 29." n1["ГОСТ 32043-2012"]:::doc click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-32043-2012" "ГОСТ 32043-2012. Межгосударственный стандарт. Премиксы. Методы определения витаминов A, D, E (введен в действие Приказом Росстандарта от 28.06.2013 N 306-ст)" n0 --> n1 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
от 29 июля 1996 г. № 487
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ A, D, E
Piemixes. Methods for determination of vitamins A, D, E
1 января 1997 года
Предисловие
1. Разработан и внесен МТК 4, АООТ «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (АООТ «ВНИИКП»).
2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 29 июля 1996 г. № 487.
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Настоящий стандарт распространяется на премиксы и устанавливает хроматографические методы определения витаминов A, D, E в премиксах с различными наполнителями из одной навески.
2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия
ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый. Технические условия
ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификованный. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9412-93 Марля медицинская. Технические условия
ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия
ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
ГОСТ 24363-80 Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26573.0-85 Премиксы. Технические условия
ГОСТ 29169-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ A, E ОБРАЩЕННО-ФАЗНОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ
Сущность метода заключается в экстракции витаминов A (ретинола ацетат) E ( \alpha -токоферола ацетат) из премикса изопропиловым спиртом и последующем анализе содержания витаминов с использованием жидкостного хроматографа «Милихром».
3.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Хроматограф жидкостный микроколоночный «Милихром» по нормативному документу [1] или его последующие модификации со спектрофотометрическим детектором и спектральным диапазоном 190 — 360 нм.
Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы 186 — 1100 нм.
Колонка хроматографическая одного из указанных размеров: 2 x 64, 2 x 80, 2 x 120 мм с числом теоретических тарелок не менее 4 тыс., заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С 18, Силасорб РНС 18, Сепарон С 18.
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Насос водоструйный по ГОСТ 25336.
Баня водяная с терморегулятором.
Колбы конические со шлифом вместимостью 25, 50 см3, КН-2-25-18МХС по ГОСТ 25336.
Пипетки 1-1-(1, 2)-1 по ГОСТ 29169.
Пипетки 1-1-1(2)-1(10) по ГОСТ 29227.
Цилиндры 1(2, 3, 4)-100, 1(2, 3, 4)-500 по ГОСТ 1770.
Колбы мерные 2-25-1(2) (исполнения 2, вместимостью 25 см3, 1-го или 2-го класса точности) по ГОСТ 1770.
Колбы мерные 2-50-1(2) по ГОСТ 1770.
Воронка ВФО-40-ПОР 16 ХС по ГОСТ 25336.
Холодильник ХПТ-1-100-18 ХС по ГОСТ 25336.
Ретинол ацетат по нормативному документу [11].
Витамин E-ацетат по нормативному документу [12].
Спирт изопропиловый (пропанол-2), х.ч. по нормативному документу [2].
Спирт пропиловый (пропанол-1), х.ч. по нормативному документу [3].
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, х.ч. по нормативному документу [4].
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
3.2 Порядок подготовки к проведению контроля
3.2.1 Отбор проб — по ГОСТ 13496.0
3.2.2 Приготовление элюента для хроматографии
Трехкомпонентный элюент готовят смешиванием ацетонитрила, пропилового спирта и дистиллированной воды в объемном соотношении 42:50:8. Для этого в склянку вместимостью 1000 см3 вносят цилиндром 500 см3 пропилового спирта, 420 см3 ацетонитрила и 80 см3 дистиллированной воды.
Приготовленную смесь растворителей фильтруют через стеклянный фильтр и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой. Полученный раствор можно хранить в течение 1 мес.
3.2.3 Подготовка хроматографической колонки
При использовании новой колонки или колонки после длительного перерыва в работе из нее следует удалить воздух и тщательно промыть элюентом до получения стабильной нулевой линии. Для этого через колонку пропускают элюент в количестве 20 — 30 свободных объемов колонки, т.е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мкдм3/мин, а затем 100 мкдм3/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.
После промывки колонки проводят ее насыщение витаминами A, E, для этого выполняют 7 — 10 анализов наиболее концентрированных градуировочных растворов витаминов A, E. Насыщение колонки прекращают, когда отношение разности между двумя последовательными определениями концентрации витамина A (E) к среднему арифметическому значению этих операций не превышает 3%.
При правильной эксплуатации колонка выдерживает 500 — 600 анализов.
3.2.4 Приготовление растворителя для экстракции витаминов A, E из премикса
Для экстракции витаминов используют двухкомпонентный экстрагент состава: изопропиловый спирт и дистиллированную воду в объемном соотношении 97:3. Для этого в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят пипеткой 30 см3 дистиллированной воды и доводят до метки изопропиловым спиртом.
Хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой до полного использования экстрагента.
3.2.5 Определение активности витамина A в масляном препарате
(0,1 +/- 0,002) г препарата растворяют в абсолютном спирте в мерной колбе вместимостью 50 см3. Доводят этим же спиртом объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Отбирают 1 — 2 см3 полученного раствора в колбу вместимостью 50 см3, заполняют ее до метки абсолютным спиртом и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной слоя 1 см. В качестве контрольного раствора применяют абсолютный спирт.
Массовую концентрацию витамина A, X, г/см3, определяют по формуле
где D — оптическая плотность раствора;
V_{1} , V_{2} — первое и второе разведения, см3;
d — плотность препарата, г/см3;
m — масса навески препарата, г;
V — объем раствора, используемый для второго разведения, см3;
1550 — удельный показатель поглощения E_{1\text{см}}^{1\%} при длине волны 326 нм для 100%-ного раствора витамина A в абсолютном спирте;
Содержание витамина A в 1 см3 соответственно должно быть 0,0310 — 0,0378 г (90000 — 110000 МЕ), 0,0619 — 0,0757 г (180000 — 220000 МЕ), 0,0774 — 0,0946 г (225000 — 275000 МЕ).
Полученные результаты используют для расчета содержания витамина A в стандартном растворе.
3.2.6 Построение градуировочного графика для витамина A
Для приготовления стандартного раствора взвешивают навеску масляного препарата витамина A, необходимую для получения раствора с активностью 30000 МЕ в 50 см3 или 600 МЕ/см3. Навеску помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, растворяют в изопропиловом спирте, перемешивают и доводят этим спиртом до метки.
Раствор хранят в холодильнике в емкости с притертой пробкой и используют в течение одной недели.
Из этого раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы, содержащие 120, 300, 600, 1200, 3000, 6000, 12000 МЕ витамина A в 25 см3. Для этого берут соответственно 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0 см3 основного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 25 см3 и доводят до метки изопропиловым спиртом.
Срок годности растворов не более 1 мес при хранении в холодильнике в емкости с притертой пробкой при температуре 4 — 10 °C.
Полученные рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе «Милихром» при следующих условиях:
хроматографическая колонка 2 x 64 (2 x 80), (2 x 120) мм;
сорбент — Силасорб C_{18} , Силасорб SPHC_{18} , Сепарон C_{18} ;
трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;
скорость подачи элюента — 150 мкдм3/мин.
Удерживаемый объем пика витамина A составляет 300 — 360 мкдм3 (может меняться в зависимости от длины колонки).
Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 100 — 200 мкдм3 элюента до выхода на нулевую линию.
Значения средних высот хроматографических пиков, выраженных в единицах оптической плотности (е.о.п.), откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс — значения активности витамина A в 25 см3 раствора.
Градуировочный график строят также, откладывая по оси ординат средние высоты хроматографических пиков, выраженные в миллиметрах.
Построение градуировочных графиков можно заменить расчетом коэффициентов наклона K, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм, по формуле
где K_{i} — коэффициент наклона градуировочного графика для i-го градуировочного раствора, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм;
n — количество точек, по которым строится градуировочная кривая.
Значение коэффициента наклона K_{i} , МЕ/е.о.п. или МЕ/мм, вычисляют по формуле
где C_{i} — содержание витамина A в соответствующем i-м градуировочном растворе, МЕ;
h_{i} — высота i-го хроматографического пика, е.о.п. или мм.
3.2.7 Построение градуировочного графика для витамина E
0,02 г витамина E-ацетата стандарта растворяют в изопропиловом спирте в колбе вместимостью 50 см3, доводят спиртом до метки и перемешивают. Получают основной раствор витамина E с концентрацией 0,4 мг/см3.
Из полученного основного раствора готовят рабочие растворы, содержащие 7, 5, 3, 1, 0,5, 0,1 и 0,05 мг витамина E в 25 см3 раствора. Для этого соответственно 17,5; 12,5; 7,5; 2,5; 2,25; 1,25; 0,25; 0,125 см3 основного раствора помещают в мерные колбы вместимостью 25 см3 и объем доводят до метки изопропиловым спиртом. Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:
хроматографическая колонка 2 x 64 мм (2 x 80 мм), (2 x 120 мм);
сорбент — Силасорб C_{18} , Силасорб SPHC_{18} , Сепарон C_{18} ;
трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;
скорость подачи элюента — 100 мкдм3/мин;
Удерживаемый объем пика витамина E составляет 540 — 660 мкдм3 (может меняться в зависимости от длины колонки).
Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 200 — 250 мкдм3 элюента до выхода на нулевую линию.
Значение средних высот хроматографических пиков (в единицах оптической плотности или миллиметрах) откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс — значение активности витамина E в миллиграммах в 25 см3 раствора.
Построение градуировочного графика можно заменить расчетом коэффициента наклона K по 3.2.6.
3.2.8 Проверка градуировочных графиков
Градуировочные графики контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1 — 2 рабочих растворов витаминов A, E следует хроматографировать по 3.2.6 и 3.2.7.
Отклонение полученных результатов (высота пика, выраженная в единицах оптической плотности или миллиметрах) от измеренных в момент построения градуировочного графика a, %, определяют по формуле
где h_{1} и h_{2} — высота хроматографического пика, определенная при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно, е.о.п. или мм.
При отклонении более 5% строят новый градуировочный график по свежеприготовленным растворам масляного препарата витамина A, витамина E-ацетат стандарта.
3.3 Порядок проведения контроля
3.3.1 Экстракция витаминов A, E из премиксов
Из тщательно перемешанной пробы исследуемого премикса берут навеску с погрешностью не более 0,0005 г. Затем навеску премикса помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 25 см3 или 50 см3 и приливают раствор для экстракции в соответствии с таблицей 1.
Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане при температуре (75 +/- 1) °C в течение 10 мин. Колбу с экстрактом премикса отсоединяют от обратного холодильника, закрывают притертой пробкой, охлаждают под струей воды до комнатной температуры и фильтруют через фильтр ПОР-16 с размером пор 10 — 16 мкм с использованием водоструйного вакуумного насоса. Фильтрат собирают в мерную колбу вместимостью 25 см3. Коническую колбу и осадок на фильтре тщательно промывают два — три раза небольшими порциями (2 — 3 см3) изопропилового спирта. Раствор в мерной колбе доводят до метки изопропиловым спиртом, тщательно перемешивают и хроматографируют.
3.3.2 Хроматографирование
Полученные экстракты хроматографируют по 3.2.6 и 3.2.7. Примеры хроматограмм экстрактов витаминов A, E из премиксов представлены в Приложении А, рисунок А.1.
При возникновении сомнений в правильности выбора пика (по объему или времени удержания), соответствующего витамину A (E), необходимо в анализируемый экстракт внести небольшое количество одного из градуировочных растворов витамина A (E) (объемное соотношение экстракт — раствор витамина A (E) равно 10:2 (10:5)). Увеличение высоты соответствующего пика по сравнению с высотой этого пика на хроматограмме, полученной до введения градуировочного раствора в анализируемый экстракт, свидетельствует, что этот пик соответствует витамину A (E).
3.4 Обработка результатов контроля
Для определения содержания витаминов A, E в премиксе проводят две экстракции и каждый экстракт хроматографируют два раза. Находят среднее арифметическое значение высоты пиков, выраженное в единицах оптической плотности или миллиметрах, и по градуировочному графику определяют содержание витаминов A, E в международных единицах и миллиграммах соответственно.
Содержание в премиксах витаминов A X_{A} , E X_{E} , МЕ/г или мкг/г, определяют по формуле
где C_{A} , C_{E} — содержание витаминов A, E, найденное по градуировочным графикам, соответственно МЕ, мкг;
m — масса навески премикса, г.
Содержание в премиксе витамина A X_{A} или витамина E X_{E} , МЕ/г или мкг/г, при использовании коэффициента K вычисляют по формуле
где K — коэффициент наклона градуировочного графика для витамина A, E соответственно, МЕ/е.о.п., мкг/е.о.п.;
h_{A} , h_{E} — высота хроматографического пика витамина A, E соответственно, е.о.п.;
m — масса навески премикса, г.
3.5 Оформление результатов контроля
3.5.1. Результаты контроля витаминов в премиксе записывают в специальном журнале для регистрации анализов.
3.5.2. Журнал ведется работником, на которого возложено проведение анализов по определению содержания витаминов в премиксах.
В журнале регистрируют все пробы с обязательным заполнением следующих данных:
- обозначения премикса и витамина, на который проводится анализ;
- наименования предприятия-поставщика премикса;
- массы партии;
- даты отбора пробы;
- фамилии и личной подписи лица, отобравшего пробу;
- результата контроля;
- фамилии и личной подписи лица, проводившего контроль.
При необходимости в журнал могут быть включены дополнительные сведения.
3.5.3 Записи должны вестись четко, аккуратно.
3.6 Допустимая погрешность контроля
Результат контроля вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат контроля принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны быть более 10% для витамина A и 15% для витамина E относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 расхождения не должны превышать 15% для витамина A и 20% для витамина E соответственно.
4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ A, D, E НОРМАЛЬНО-ФАЗНОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ
Сущность метода заключается в омылении навески премикса водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов A, D, E гексаном с последующим определением витаминов на жидкостном хроматографе.
Метод применим в диапазоне концентраций витамина A от 10 до 10000 международных единиц на 1 г премикса (МЕ/г), витамина D от 40 до 10000 МЕ/г, витамина E от 10 до 10000 МЕ/г.
4.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором и систематической погрешностью измерений не выше 10% отн.: Хром-900 (ЧСФР), Ликвохром (Венгрия), Цвет (РФ) и др. жидкостные хроматографы с аналогичными характеристиками.
Колонка для хроматографии стеклянная или металлическая высотой 150 мм и диаметром 3 мм, заполненная сепароном S6X зернением 7 мкм.
Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы от 186 до 1100 нм.
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Линейка измерительная металлическая.
Испаритель ротационный ИР-IM на 2 дм3 или его аналоги.
Баня водяная, обеспечивающая нагрев до 80 — 100 °C
Холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336.
Колбы конические со шлифом вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336.
Пипетки 1-1-1(2)-1 по ГОСТ 29169.
Пипетки 1-1-1(2)-1(5) по ГОСТ 29227.
Микрошприцы МШ-10М, МШ-50М по нормативному документу [5].
Колбы мерные 2-25-1(2); 2-50-1(2); 2-100-1(2) по ГОСТ 1770.
Воронки делительные вместимостью 200,500 см3 по ГОСТ 25336.
Цилиндры 1(2, 3, 4)-50; 1(2, 3, 4)-100; 1(2, 3, 4)-250; 1(2, 3, 4)-1000 по ГОСТ 1770.
Пробирки с притертой пробкой 2-5-0,1(0,2); 2-10-0,1(0,2) по ГОСТ 1770.
Воронки стеклянные диаметром 4 — 6 см по ГОСТ 25336.
Марля медицинская по ГОСТ 9412.
Колонки стеклянные диаметром 2 — 4 см и высотой 80 см.
Калия гидроокись по ГОСТ 24363.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962 или ГОСТ 18300.
Спирт этиловый абсолютированный для спектрофотометрии или по нормативному документу [6].
Гексан по нормативному документу [7].
Спирт изопропиловый (пропанол-2) по нормативному документу [2].
Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.
Ретинол ацетат (витамин A) по нормативному документу [11].
Эргокальциферол кристаллический (витамин D) по нормативному документу [13].
\alpha -токоферолацетат (витамин E) по нормативному документу [12].
Алюминия окись для хроматографии, нейтральная по нормативному документу [8].
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Бумага универсальная индикаторная по нормативному документу [9].
Фильтры обеззоленные (красная лента) по нормативному документу [10].
Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
4.2 Порядок подготовки к проведению контроля
4.2.1. Определение массовой концентрации масляного раствора витамина A по 3.2.5.
4.2.2 Приготовление стандартного раствора витамина A
Для приготовления стандартного раствора взвешивают (лучше на часовом стекле) навеску масляного препарата, необходимую для приготовления раствора с активностью витамина 10000 МЕ/см3, переносят ее в мерную колбу вместимостью 25 см3 и растворяют в изопропиловом спирте. Раствор перемешивают и доводят до метки спиртом. Хранят в холодильнике в емкости с притертой пробкой и используют в течение недели.
4.2.3 Приготовление стандартного раствора витамина D_{2}
Ампулу кристаллического эргокальциферола, содержащую 0,1000 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят содержимое колбы до метки изопропиловым спиртом и перемешивают. Полученный раствор (1) содержит 40000 МЕ/см3 витамина D_{2} . Из него берут 1 см3 раствора, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят до метки этим же спиртом и перемешивают. Полученный раствор (2) содержит 800 МЕ/см3 витамина D_{2} . Раствор хранят в плотно закрытой стеклянной посуде в холодильнике.
4.2.4 Приготовление стандартного раствора витамина E
Навеску масляного препарата \alpha -токоферолацетата массой 0,0500 г переносят в мерную колбу вместимостью 25 см3, растворяют в изопропиловом спирте, доводят им до метки и тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в емкости с притертой пробкой в течение одной недели.
4.2.5 Подготовка растворителей
Очистку растворителей, применяемых в хроматографии, проводят посредством перегонки, отбрасывая первую и последнюю фракции в количестве 1/10 от первоначального объема, или пропусканием через колонку, заполненную активированной окисью алюминия.
Окись алюминия активируют при нагревании в течение 1 ч при температуре 400 — 450 °C. Колонку высотой 60 — 80 см и диаметром 2 см заполняют 80 г активированной окиси алюминия и пропускают через нее 700 см3 растворителя. Для проверки чистоты в колонку жидкостного хроматографа загружают 50 мкдм3 растворителя. В случае его загрязнения на хроматограмме появляются пики, соответствующие времени удерживания витаминов A, D, E.
4.2.6 Приготовление водно-спиртового раствора гидроокиси калия с массовой долей 10%
Растворяют 20 г гидроокиси калия в смеси из 20 см3 воды и 180 см3 этилового спирта. Раствор готовят непосредственно перед контролем.
4.3 Порядок проведения контроля
4.3.1 Омыление и подготовка к контролю стандартных растворов витаминов A, D, E
В конические колбы вместимостью 250 см3, снабженные обратным холодильником, помещают 1 см3 раствора [2] витамина D по 4.2.3, 0,25 см3 ретинолацетата и 0,2 см3 \alpha -токоферолацетата. Добавляют 0,1 гидрохинона и 30 см3 10%-ного водно-спиртового раствора гидроокиси калия. Подвергают омылению в течение 30 мин на водяной бане при температуре 85 °C. Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды, добавляют 30 см3 дистиллированной воды и 30 см3 гексана. Полученную смесь тщательно перемешивают и сливают в делительную воронку вместимостью 200 см3.
После расслаивания нижний слой (водно-спиртовый) сливают в коническую колбу, а гексановый слой оставляют в делительной воронке. Эту операцию экстракции гексаном водно-спиртового слоя в конической колбе проводят еще дважды, каждый раз сливая в делительную воронку гексановый слой.
Гексановые вытяжки объединяют и промывают в делительной воронке дистиллированной водой порциями по 30 см3 до нейтральной реакции среды (проверяют по индикаторной бумаге). Промытый экстракт переносят в сухую перегонную колбу, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сульфата натрия (40 — 50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают свежими порциями гексана (20 — 30 см3).
Все гексановые растворы объединяют и помещают в колбу роторного испарителя. Температура водяной бани роторного испарителя 70 °C. После отгонки гексана сухой остаток растворяют в 3 см3 гексана и переносят в мерную предварительно откалиброванную пробирку с притертой пробкой. Раствор может храниться в темном месте при температуре 4 — 8 °C.
4.3.2 Омыление и подготовка к хроматографированию образцов премиксов
Навеску премикса массой 10 г взвешивают с погрешностью не более 0,0005 г, помещают в коническую колбу вместимостью 250 см3, снабженную обратным холодильником. Добавляют антиоксидант (0,1 г гидрохинона), 50 см3 водно-спиртового раствора щелочи и подвергают омылению на водяной бане при температуре 82 — 85 °C в течение 30 мин.
По окончании омыления содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры, добавляют 50 см3 дистиллированной воды и 50 см3 гексана, смесь тщательно перемешивают и дают отстояться. После расслаивания смеси гексановый слой осторожно сливают в делительную воронку вместимостью 500 см3.
Экстракцию гексаном повторяют дважды порциями по 50 см3, последнюю фракцию переносят в делительную воронку, сливая содержимое колбы через воронку с марлевым слоем. Остаток на марле слегка отжимают стеклянной палочкой и выбрасывают. Воронку обмывают дистиллированной водой (около 50 см3) в делительную воронку, в которой собраны гексановые вытяжки. Содержимое воронки промывают дистиллированной водой порциями по 50 см3 до нейтральной реакции среды (по индикаторной бумаге). Промытый экстракт переносят в сухую перегонную колбу, пропуская его через обеззоленный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия (около 50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают 40 см3 гексана. Отгоняют гексан на ротационном испарителе при температуре бани 70 °C. Сухой остаток растворяют в 3 см3 гексана, который добавляют порциями, чтобы перенести в предварительно откалиброванную пробирку с притертой пробкой.
Полученный экстракт используют для хроматографического анализа.
4.3.3 Подготовка жидкостного хроматографа к работе
Подготовка хроматографа осуществляется в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
Перед началом измерений хроматограф прогревают в течение 15 мин. Сначала проводят заполнение насоса элюентом. В качестве подвижной фазы используют смесь гексана с этанолом в объемном отношении 99,5:0,5. Устанавливают скорость элюирования, соответствующую эффективности колонки для конкретных премиксов от 0,5 до 2 см3/мин. При определении витаминов A, E устанавливают светофильтр длиной волны 289 нм, для определения витамина D — светофильтр длиной волны 254 нм. Скорость движения диаграммной ленты регистратора устанавливают равной 0,3 — 0,6 см/мин.
После промывания колонки элюентом регистрирующий прибор должен показывать нулевую линию без дрейфа нуля. С целью повышения чувствительности и точности измерений для каждого хроматографа подбирают оптимальные условия хроматографирования.
4.3.4 Проведение хроматографических измерений
Для хроматографических измерений используют метод сравнения со стандартом. Сравнивают высоты хроматографических пиков для анализируемой пробы и пробы стандарта.
В колонку последовательно вводят от 3 до 20 мкдм3 исследуемого раствора, стандартного раствора витамина A и стандартного раствора витамина E. Получают соответствующие хроматограммы при длине волны фотометрического детектора 289 нм, Приложение Б, рисунок Б.1. После этого меняют светофильтр, устанавливая рабочую длину волны 254 нм, и при этих условиях снимают хроматограммы для растворов анализируемой пробы и стандарта витамина D, Приложение Б, рисунок Б.2.
Высоты пиков, соответствующие времени удерживания витаминов A, D, E, измеряют металлической линейкой, как расстояние от вершины пика до линии, проведенной в основании пика. Значения высот пиков (в миллиметрах) используют для вычисления содержания витаминов A, D, E в анализируемом образце.
4.4 Обработка результатов контроля
Содержание витамина A X_{1} , МЕ/г, рассчитывают по формуле
X_{1} = \frac{Q_{A} \cdot V_{A} \cdot V_{\text{заг}}^{\text{ст}} \cdot V_{\text{х}} \cdot h_{\text{х}}}{V_{\text{к}} \cdot V_{\text{заг}}^{\text{х}} \cdot V_{\text{ст}} \cdot h_{\text{ст}} \cdot a} ,
где Q_{A} — содержание витамина A в стандартном растворе, МЕ;
V_{A} — объем стандартного раствора витамина A, взятый на омыление, см3;
V_{\text{к}} — объем мерной колбы с исходным стандартным раствором витамина A, см3;
V_{\text{заг}}^{\text{х}} , V_{\text{заг}}^{\text{ст}} — объемы загрузки в колонку растворов пробы и стандарта, полученные после омыления, мкдм3;
V_{\text{х}} , V_{\text{ст}} — объемы экстрактов пробы и стандарта после проведения подготовительных операций (омыление и т.д.), см3;
h_{\text{х}} — высота пика витамина A на хроматограмме премикса, мм;
h_{\text{ст}} — высота пика на хроматограмме для стандарта витамина A, мм;
a — масса навески премикса, г.
Содержание витамина D_{2} , X_{2} , МЕ/г, рассчитывают по формуле
X_{2} = \frac{Q_{\text{Д}} \cdot V_{n}\prime \cdot V_{n}\prime\prime \cdot V_{\text{заг}}^{\text{ст}} \cdot V_{\text{х}} \cdot h_{\text{х}}}{V_{\text{к}}\prime \cdot V_{\text{к}}\prime\prime \cdot V_{\text{заг}}^{\text{х}} \cdot V_{\text{ст}} \cdot h_{\text{ст}} \cdot a} ,
где Q_{\text{Д}} — содержание витамина D_{2} в стандартном препарате, МЕ;
V_{n}\prime — объем стандартного раствора витамина D_{2} , взятый для последующего разбавления, см3;
V_{\text{к}}\prime — объем колбы со стандартным раствором витамина D_{2} , см3;
V_{n}\prime\prime — объем стандартного раствора витамина D_{2} , взятый на омыление, см3;
V_{\text{к}}\prime\prime — объем колбы со стандартным раствором витамина D_{2} после первого разведения, см3;
V_{\text{заг}}^{\text{ст}} , V_{\text{заг}}^{\text{х}} — объемы загрузки в колонку омыленных растворов стандарта и пробы, мкдм3;
V_{\text{х}} , V_{\text{ст}} — окончательные объемы растворов пробы и стандарта, подготовленные для хроматографии, см3;
h_{\text{ст}} , h_{\text{х}} — соответствующие высоты пиков витамина D_{2} на хроматограммах стандарта и премикса, мм;
a — масса навески премикса, г.
Примечание. При обогащении премиксов витамином D_{3} в числитель формулы следует вводить коэффициент 0,97 (отношение коэффициентов экстинкций витамина D_{2} к D_{3} ).
Содержание витамина E X_{3} , мкг/г, рассчитывают по формуле
X_{3} = \frac{Q_{E} \cdot V_{n} \cdot V_{\text{заг}}^{\text{ст}} \cdot V_{\text{х}} \cdot h_{\text{х}}}{V_{\text{к}} \cdot V_{\text{заг}}^{\text{х}} \cdot V_{\text{ст}} \cdot h_{\text{ст}} \cdot a} ,
где Q_{E} — масса навески \alpha -токоферола-стандарта, мкг;
V_{n} — объем стандартного раствора витамина E, взятый на омыление, см3;
V_{\text{к}} — объем мерной колбы со стандартным раствором витамина E, см3;
V_{\text{заг}}^{\text{х}} , V_{\text{заг}}^{\text{ст}} — объемы загрузки растворов пробы и стандарта в хроматографическую колонку, мкдм3;
V_{\text{х}} , V_{\text{ст}} — окончательные объемы растворов пробы и стандарта, подготовленные для хроматографии, см3;
h_{\text{х}} , h_{\text{ст}} — высоты пиков витамина E на хроматограммах стандарта и премикса, мм;
a — масса навески премикса, г.
Результат контроля вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение двух или более параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности P = 0,95 не должны превышать 10% относительно среднего арифметического значения.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности P = 0,95 не должно превышать 20% по отношению к среднему арифметическому значению результатов измерений.
ХРОМАТОГРАММЫ ЭКСТРАКТОВ ВИТАМИНОВ A, E
ХРОМАТОГРАММЫ ЭКСТРАКТОВ ВИТАМИНОВ A, D, E
Рисунок Б.1. Хроматограммы экстрактов витаминов A, E
из премикса при длине волны 289 нм
Рисунок Б.2. Хроматограммы экстрактов стандарта витамина D из премикса при длине волны 254 нм