ГОСТ 32043-2012. Межгосударственный стандарт. Премиксы. Методы определения витаминов A, D, E

(введен в действие Приказом Росстандарта от 28.06.2013 № 306-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ Р 50928-96"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-50928-96" "ГОСТ Р 50928-96. Государственный стандарт Российской Федерации. Премиксы. Методы определения витаминов A, D, E (принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 29."
  n1["ГОСТ 32043-2012"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-32043-2012" "ГОСТ 32043-2012. Межгосударственный стандарт. Премиксы. Методы определения витаминов A, D, E (введен в действие Приказом Росстандарта от 28.06.2013 N 306-ст)"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРЕМИКСЫ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ A, D, E

Premixes. Methods for determination of vitamin A, D, E

ГОСТ 32043-2012

Предисловие

Сведения о стандарте

1. Разработан Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (ОАО «ВНИИКП»).

2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 004).

4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 июня 2013 г. № 306-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32043-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.

5. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и правок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомления и тексты размещаются в информационной системе общего пользования — на информационном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на премиксы с различными наполнителями и устанавливает хроматографические методы определения содержания витаминов A (ретинола ацетата), D ( D_{2} — эргокальциферола и D_{3} — холекальциферола), E (токоферола ацетата).

Метод с использованием обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии применим при содержании в премиксах витамина A в диапазоне от 40 до 6000 млн. МЕ/т, витамина E — от 50 до 1000 г/т.

Метод с использованием нормально-фазной высокоэффективной хроматографии — при содержании в премиксе витамина A в диапазоне от 10 до 10000 млн. МЕ/т, витамина D_{2} — от 40 до 10000 млн. МЕ/т, витамина E — от 10 до 10000 г/т.

Примечание. МЕ — международная единица измерения количества вещества, основанная на биологической активности витаминов.

1 МЕ витамина A соответствует 0,344 мкг ретинола ацетата, витамина D — 0,025 мкг холе- или эргокальциферола.

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.2.007.0-75 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 8677-76 Реактивы. Кальция оксид. Технические условия

ГОСТ 9412-93 Марля медицинская. Общие технические условия

ГОСТ 9805-84 Спирт изопропиловый. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 31218-2003 (ИСО 6498:1998) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб.

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяют в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Отбор проб

4. Подготовка проб для испытаний

Подготовка проб — по ГОСТ 31218.

5. Определение витаминов A (ретинола ацетата), E (токоферола ацетата) методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии

5.1. Сущность метода заключается в экстракции витаминов A (ретинола ацетата), E (токоферола ацетата) из премикса изопропиловым спиртом и последующем определении содержания витаминов обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией.

5.2 Средства измерений, оборудование, материалы и реактивы

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью +/- 0,001 г.

Хроматограф жидкостный микроколоночный «Милихром», укомплектованный спектрофотометрическим детектором, пригодным для измерения оптической плотности при длине волны от 190 до 360 нм, самописцем или интегратором, позволяющим измерять высоту и площадь пиков, и компьютером с установленным программным обеспечением для обработки результатов измерений.

Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы от 186 до 1100 нм.

Колонка хроматографическая одного из указанных размеров: 2 x 64, 2 x 80, 2 x 120 мм, с числом теоретических тарелок не менее 4000, заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С-18, Силасорб РНС-18, Сепарон С-18.

Насос водоструйный по ГОСТ 25336.

Баня водяная с терморегулятором.

Колбы конические со шлифом Кн-2-25(50)-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Пипетки 1-1-(1, 2)-1 по ГОСТ 29169.

Пипетки 1-1-1(2)-1(10) по ГОСТ 29227.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-100(500) по ГОСТ 1770.

Колбы мерные 2-25(50)-1(2) по ГОСТ 1770.

Колба К-1-500-29/32 ХС по ГОСТ 25336.

Воронка с фильтром ВФО-40-ПОР 16 ХС по ГОСТ 25336.

Холодильники ХПТ-1-100-18 ХС, ХШ-1-400-29/32 ХС по ГОСТ 25336.

Окись кальция по ГОСТ 8677.

Стандартный образец витамина A (ретинола ацетата), содержащий не менее 1 млн. МЕ витамина A в 1 г.

Стандартный образец витамина E (токоферола ацетата) с массовой долей не менее 99,0%.

Спирт изопропиловый (пропанол-2) по ГОСТ 9805.

Спирт этиловый ректификованный технический объемной долей 96% по ГОСТ 18300.

Спирт пропиловый (пропанол — 1).

Ацетонитрил.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1. Допускается использование других средств измерений и оборудования с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

3. Допускается использование других материалов с характеристиками не ниже указанных.

5.3 Подготовка к проведению испытания

5.3.1 Приготовление элюента для хроматографии

Трехкомпонентный элюент готовят смешиванием ацетонитрила, пропилового спирта и дистиллированной воды в объемном соотношении 42:50:8. Для этого в склянку вместимостью 1000 см3 вносят цилиндром 500 см3 пропилового спирта, 420 см3 ацетонитрила и 80 см3 дистиллированной воды.

Приготовленную смесь растворителей фильтруют через стеклянный фильтр и помещают в стеклянную емкость с притертой пробкой.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

5.3.2 Подготовка хроматографической колонки

При использовании новой колонки или колонки после длительного перерыва в работе из нее следует удалить воздух и тщательно промыть элюентом до получения стабильной нулевой линии. Для этого через колонку пропускают элюент в количестве 20 — 30 свободных объемов колонки, т.е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мм3/мин, а затем 100 мм3/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.

После промывки колонки проводят ее насыщение витаминами A, E. Для насыщения колонки в начале работы проводят 7 — 10 загрузок наиболее концентрированного градуировочного (рабочего) раствора (см. 5.3.6 или 5.3.7) и отмечают высоты пиков. Насыщение колонки проводят до достижения постоянной высоты пиков (отношение разности между двумя последовательными определениями концентрации витамина к среднему арифметическому значению этих операций не более 3% отн.).

5.3.3 Приготовление растворителя для экстракции витаминов A, E

Двухкомпонентный экстрагент готовят смешиванием изопропилового спирта и дистиллированной воды в объемном соотношении 97:3. Для этого в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят пипеткой 30 см3 дистиллированной воды, объем доводят до метки изопропиловым спиртом.

5.3.4 Получение абсолютного спирта

5.3.5 Определение массовой концентрации витамина A в стандартном образце

Взвешивают (0,100 +/- 0,002) г стандартного образца витамина A, затем растворяют в абсолютном спирте в мерной колбе вместимостью 50 см3.

Доводят этим же спиртом объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Отбирают 1 — 2 см3 полученного раствора в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят объем до метки абсолютным спиртом и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной слоя 1 см. В качестве контрольного раствора применяют абсолютный спирт.

Массовую концентрацию витамина A, X, г/см3, определяют по формуле

, (1)

где D — оптическая плотность раствора витамина A, е.о.п.;

V_{1} — первоначальный объем разведения раствора стандартного образца витамина A, см3;

V_{2} — окончательный объем разведения раствора стандартного образца витамина A, см3;

\rho — плотность стандартного образца витамина A, г/см3;

m — масса стандартного образца витамина A, г;

V — объем раствора витамина A, используемый для второго разведения, см3;

100 — коэффициент пересчета;

1550 — удельный показатель поглощения E_{1\text{см}}^{1\%} при длине волны 326 нм для 100%-ного раствора витамина A в абсолютном спирте.

Содержание витамина A в 1 см3 соответственно должно быть:

0,0310 — 0,0378 г (90000 — 110000 МЕ); 0,0619 — 0,0757 г (180000 — 220000 МЕ);

0,0774 — 0,0946 г (225000 — 275000 МЕ).

Полученные результаты используют для расчета содержания витамина A в стандартном растворе.

5.3.6 Построение градуировочного графика для витамина A

Для приготовления основного стандартного раствора взвешивают стандартный образец витамина A массой, необходимой для получения раствора с содержанием этого витамина 600 МЕ/см3, помещают его в мерную колбу вместимостью 50 см3, растворяют в изопропиловом спирте, перемешивают и доводят этим спиртом до метки.

Срок хранения основного стандартного раствора в емкости с притертой пробкой в холодильнике при температуре 4 °C — 10 °C — не более одной недели.

Из этого раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы, содержащие 120, 300, 600, 1200, 3000, 6000, 12000 МЕ витамина A в 25 см3 раствора. Для этого берут соответственно 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 и 20,0 см3 основного стандартного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 25 см3 и доводят объемы до метки изопропиловым спиртом.

Срок хранения градуировочных (рабочих) растворов в емкостях с притертыми пробками, в холодильнике при температуре 4 °C — 10 °C — не более 1 мес.

Полученные рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:

• колонка хроматографическая 2 x 64 (2 x 80, 2 x 120) мм с сорбентом;
• элюент трехкомпонентный по 5.3.1;
• объем пробы — 6 мм3;

Удерживаемый объем пика витамина A составляет 300 — 360 мм3 (может меняться в зависимости от длины колонки).

Каждый раствор хроматографируют два раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 100 — 200 мм3 элюента до выхода на нулевую линию.

Средние значения высот хроматографических пиков, выраженные в единицах оптической плотности или в миллиметрах, откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс — значения содержания витамина A, МЕ, в 25 см3 раствора.

где n — количество точек, по которым строят градуировочный график;

K_{i} — коэффициент наклона градуировочного графика для i-го градуировочного раствора, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм.

Значение коэффициента наклона градуировочного графика для i-го градуировочного раствора, K_{i} , МЕ/е.о.п. или МЕ/мм, вычисляют по формуле

, (3)

где C_{i} — содержание витамина A в соответствующем i-ом градуировочном растворе, МЕ;

h_{i} — высота i-го хроматографического пика, е.о.п. или мм.

5.3.7 Построение градуировочного графика для витамина E

Взвешивают на весах (0,020 +/- 0,001) г стандартного образца витамина E, затем растворяют в изопропиловом спирте в мерной колбе вместимостью 50 см3, объем доводят спиртом до метки и перемешивают. Получают основной стандартный раствор витамина E с массовой концентрацией 0,4 мг/см3.

Из полученного основного стандартного раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы, содержащие 7,0; 5,0; 3,0; 1,0; 0,5; 0,1 и 0,05 мг витамина E в 25 см3 раствора. Для этого соответственно 17,5; 12,5; 7,5; 2,5; 2,25; 1,25; 0,25; 0,125 см3 основного стандартного раствора помещают в мерные колбы вместимостью 25 см3 и объемы доводят до метки изопропиловым спиртом.

Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:

• колонка хроматографическая 2 x 64 (2 x 80, 2 x 120) мм с сорбентом;
• элюент трехкомпонентный по 5.3.1;
• объем пробы — 6 мм3;
• длина волны — 286 нм;

Каждый раствор хроматографируют два раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 200 — 250 мм3 элюента до выхода на нулевую линию.

Средние значения высот хроматографических пиков (в единицах оптической плотности или миллиметрах) откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс — значения содержания витамина E в микрограммах в 25 см3 раствора.

Построение градуировочных графиков можно заменить расчетом коэффициента наклона, K, мг/е.о.п. или мг/мм, по формуле

K_{i} — коэффициент наклона градуировочного графика для i-го градуировочного раствора, мг/е.о.п. или мг/мм.

Значение коэффициента наклона градуировочного графика для i-го градуировочного раствора, K_{i} , мг/е.о.п. или мг/мм, вычисляют по формуле

, (5)

5.3.8 Проверка градуировочных графиков

Градуировочные графики контролируют не реже одного раза в неделю. Для этого 1 — 2 стандартных рабочих растворов витаминов A, E следует хроматографировать по 5.3.6 и 5.3.7. Отклонение полученных результатов (высота пика, выраженная в единицах оптической плотности или миллиметрах) от измеренных в момент построения градуировочного графика, a, %, определяют по формуле

, (6)

где h_{1} , h_{2} — высоты хроматографических пиков, определенные при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно, е.о.п. или мм;

100 — коэффициент пересчета в проценты.

При отклонении полученных результатов более чем на 5% строят новый градуировочный график по свежеприготовленным стандартным растворам препаратов витамина A и витамина E.

5.4 Проведение испытания

5.4.1 Экстракция витаминов A, E из премиксов

Колбу соединяют с холодильником типа ХПТ и нагревают на водяной бане при температуре (75 +/- 1) °C в течение 10 мин. Затем колбу с экстрактом премикса отсоединяют от холодильника, закрывают притертой пробкой, охлаждают под струей воды до комнатной температуры и фильтруют через воронку с фильтром ПОР-16 с использованием водоструйного вакуумного насоса. Фильтрат собирают в мерную колбу вместимостью 25 см3. Коническую колбу и осадок на фильтре тщательно промывают 2 — 3 раза небольшими порциями по 2 — 3 см3 изопропилового спирта. Объем в мерной колбе доводят до метки изопропиловым спиртом, тщательно перемешивают и хроматографируют.

5.4.2 Хроматографирование

Полученные экстракты хроматографируют по 5.3.6 и 5.3.7. Примеры хроматограмм экстрактов витаминов A, E из премиксов представлены в Приложении А, рисунок А.1.

5.5 Обработка результатов

Содержание в премиксе витамина A, X_{A} , млн. МЕ/т, вычисляют по формуле

X = \_\_\_\_ \frac{m_{1} \cdot 10^{- 6}}{{}^{A}m \cdot 10^{- 6}} , (7)

Содержание в премиксе витамина E, X_{E} , г/т, вычисляют по формуле

X = \_\_\_\_ \frac{m_{2} \cdot 10^{- 3}}{{}^{E}m \cdot 10^{- 6}} , (8)

где m_{2} — содержание витамина E, найденное по градуировочному графику, мг;

Содержание в премиксе витамина A, X_{A} , млн. МЕ/т, при использовании коэффициента наклона K вычисляют по формуле

X_{A} = K\_\_\_\_ \frac{h_{A} \cdot 10^{- 6}}{m \cdot 10^{- 6}} , (9)

где K — коэффициент наклона градуировочного графика для витамина A, рассчитанный по формуле (2), МЕ/е.о.п. или МЕ/мм;

Содержание в премиксе витамина E, X_{E} , г/т, при использовании коэффициента наклона K вычисляют по формуле

X_{E} = K\_\_\_\_ \frac{h_{E} \cdot 10^{- 3}}{m \cdot 10^{- 6}} , (10)

где K — коэффициент наклона градуировочного графика для витамина E, рассчитанный по формуле (3), мг/е.о.п. или мг/мм;

h_{E} — высота хроматографического пика витамина E, е.о.п. или мм;

10^{- 3} — коэффициент пересчета миллиграммов в граммы;

m — масса анализируемой пробы премикса, г;

D ( D_{2} — эргокальциферола и D_{3} — холекальциферола), E (токоферола ацетата) методом нормально-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии

6.1. Сущность метода заключается в омылении анализируемой пробы премикса водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов A (ретинола ацетата), D_{2} (эргокальциферола), E (токоферола ацетата) гексаном с последующим определением содержания витаминов нормально-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией, пересчетом содержания витамина D_{2} (эргокальциферола) на содержание витамина D_{3} (холекальциферола).

6.2 Средства измерений, оборудование, материалы и реактивы

Хроматограф жидкостный, укомплектованный спектрофотометрическим детектором, пригодным для измерения оптической плотности при длине волны от 190 до 360 нм, самописцем или интегратором, позволяющим измерять высоту и площадь пиков, и компьютером с установленным программным обеспечением для обработки результатов измерений.

Колонка для хроматографии стеклянная или металлическая высотой 150 мм и диаметром 3 мм, заполненная сепароном S6X с зернением 7 мкм.

Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы от 186 до 1100 нм.

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью +/- 0,001 г.

Испаритель ротационный.

Баня водяная.

Холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336.

Колбы конические со шлифом Кн-2-250-29/32 ТХС по ГОСТ 25336.

Пипетки 1-1-1(2)-1 по ГОСТ 29169.

Пипетки 1-1-1(2)-1(5) по ГОСТ 29227.

Микрошприцы МШ-10М, МШ-50М.

Колбы мерные 2-25(50, 100)-1(2) по ГОСТ 1770.

Воронки делительные ВД 1(2)-200(500) ХС по ГОСТ 25336.

Цилиндры 1(2, 3, 4)-50(100, 250, 1000) по ГОСТ 1770.

Пробирки с притертой пробкой 2-5(10)-0,1(0,2) по ГОСТ 1770.

Воронки стеклянные В-36(56)-50(80) ХС по ГОСТ 25336.

Склянки с притертой пробкой.

Палочки стеклянные.

Марля медицинская по ГОСТ 9412.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Колонки стеклянные диаметром 2 — 4 см и высотой 80 см.

Гексан.

Спирт этиловый ректификованный технический объемной долей 96% по ГОСТ 18300.

Спирт изопропиловый (пропанол-2) по ГОСТ 9805.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.

Стандартный образец витамина A (ретинола ацетата), содержащий не менее 1 млн. МЕ витамина A в 1 г.

Стандартный образец витамина E (токоферола ацетата) с массовой долей не менее 99,0%.

Стандартный образец витамина D_{2} (эргокальциферола) с массовой долей не менее 99,0%.

Алюминия окись для хроматографии, нейтральная.

Гидрохинон по ГОСТ 19627.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Бумага индикаторная.

Фильтры обеззоленные (красная лента).

Примечания

1. Допускается использование других средств измерений и оборудования с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.

2. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

3. Допускается использование других материалов с характеристиками не ниже указанных.

6.3 Подготовка к измерению

6.3.1. Определение содержания витамина A в стандартном образце по 5.3.5.

6.3.2 Получение абсолютного спирта по 5.3.4.

6.3.3 Приготовление стандартного раствора витамина A

Стандартный образец витамина A массой, необходимой для приготовления раствора с содержанием витамина 10000 МЕ/см3, переносят в мерную колбу вместимостью 25 см3 и растворяют в изопропиловом спирте. Раствор перемешивают и доводят объем до метки спиртом. Хранят в холодильнике в склянке с притертой пробкой и используют в течение одной недели.

6.3.4 Приготовление стандартного раствора витамина D_{2} (эргокальциферола)

Ампулу (капсулу), содержащую 0,1 г витамина D_{2} , помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3. Доводят содержимое колбы до метки изопропиловым спиртом и перемешивают. Полученный раствор 1 содержит 40000 МЕ/см3 витамина D_{2} . Из него берут 1 см3 раствора, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят до метки этим же спиртом и перемешивают. Полученный раствор 2 содержит 800 МЕ/см3 витамина D_{2} .

Срок хранения раствора в стеклянной емкости с притертой пробкой в холодильнике — не более одной недели.

6.3.5 Приготовление стандартного раствора витамина E

0,05 г стандартного образца витамина E переносят в мерную колбу вместимостью 25 см3, растворяют в изопропиловом спирте, доводят им объем до метки и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в стеклянной емкости с притертой пробкой в холодильнике — не более одной недели.

6.3.6 Подготовка растворителей

Очистку растворителей, применяемых в хроматографии, проводят посредством перегонки, отбрасывая первую и последнюю фракции в количестве 1/10 от первоначального объема, или пропусканием через колонку, заполненную активированной окисью алюминия.

Окись алюминия активируют при нагревании в течение 1 ч при температуре 400 °C — 450 °C. Колонку высотой 60 — 80 см и диаметром 2 см заполняют 80 г активированной окиси алюминия и пропускают через нее 700 см3 растворителя. Для проверки чистоты в колонку жидкостного хроматографа загружают 50 мм3 растворителя. В случае его загрязнения на хроматограмме появляются пики, соответствующие времени удерживания витаминов A, D, E.

6.3.7 Приготовление водно-спиртового раствора гидроокиси калия с массовой долей 10%

Растворяют 20 г гидроокиси калия в смеси из 20 см3 воды и 180 см3 этилового спирта. Раствор готовят непосредственно перед контролем.

6.4 Проведение испытания

6.4.1 Омыление и подготовка к контролю стандартных растворов витаминов A, D, E

В конические колбы вместимостью 250 см3, снабженные холодильником, помещают 0,25 см3 раствора витамина A по 6.3.3, 1 см3 раствора витамина D_{2} по 6.3.4 (раствор 2), 0,2 см3 раствора витамина E по 6.3.5. В каждую колбу добавляют 0,1 г гидрохинона, 30 см3 10%-ного водно-спиртового раствора гидроокиси калия и подвергают омылению в течение 30 мин на водяной бане при температуре 85 °C. Колбы охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды и добавляют по 30 см3 дистиллированной воды и по 30 см3 гексана. Полученные смеси тщательно перемешивают и переносят в делительные воронки вместимостью 200 см3.

После расслаивания нижние слои (водно-спиртовые) сливают в конические колбы, а гексановые слои оставляют в делительной воронке. Экстракцию гексаном водно-спиртовых слоев в конической колбе проводят еще дважды, каждый раз сливая в делительную воронку гексановый слой.

Гексановые вытяжки объединяют и промывают в делительной воронке дистиллированной водой порциями по 30 см3 до нейтральной реакции среды (проверяют по индикаторной бумаге). Промытые экстракты переносят в сухие перегонные колбы, пропуская их через бумажные фильтры со слоем безводного сульфата натрия (около 50 г). Делительные воронки и фильтрующие материалы промывают свежими порциями гексана по 20 — 30 см3.

Все гексановые растворы каждого стандартного раствора витамина объединяют и переносят в колбы роторного испарителя. Температура водяной бани роторного испарителя 70 °C. После отгонки гексана полученные сухие остатки растворяют в 3 см3 гексана и переносят в предварительно откалиброванные мерные пробирки с притертыми пробками. Растворы хранят в темном месте при температуре 4 °C — 8 °C.

6.4.2 Омыление и подготовка образцов премиксов к хроматографированию

(10,000 +/- 0,001) г анализируемой пробы премикса помещают в коническую колбу вместимостью 250 см3, снабженную обратным холодильником. Добавляют антиоксидант (0,1 г гидрохинона), 50 см3 водно-спиртового раствора щелочи и подвергают омылению на водяной бане при температуре 82 °C — 85 °C в течение 30 мин.

По окончании омыления колбу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 50 см3 дистиллированной воды и 50 см3 гексана, смесь тщательно перемешивают и дают отстояться. После расслаивания смеси гексановый слой осторожно сливают в делительную воронку вместимостью 500 см3.

Экстракцию гексаном повторяют дважды порциями по 50 см3, последнюю фракцию переносят в делительную воронку, сливая содержимое колбы через воронку с марлевым слоем. Остаток на марле слегка отжимают стеклянной палочкой и выбрасывают. Воронку обмывают дистиллированной водой (около 50 см3) в делительную воронку, в которой собраны гексановые вытяжки. Содержимое делительной воронки промывают дистиллированной водой порциями по 50 см3 до нейтральной реакции среды (по индикаторной бумаге). Промытый экстракт переносят в сухую перегонную колбу, пропуская его через обеззоленный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия (около 50 г). Делительную воронку и фильтр промывают 40 см3 гексана. Отгоняют гексан на ротационном испарителе при температуре бани 70 °C. Сухой остаток растворяют в 3 см3 гексана, который добавляют порциями, чтобы перенести в предварительно откалиброванную пробирку с притертой пробкой.

Полученный экстракт используют для хроматографического анализа.

6.4.3 Подготовка жидкостного хроматографа к работе

Подготовка хроматографа осуществляется в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

Перед началом измерений хроматограф прогревают в течение 15 мин. Сначала проводят заполнение насоса элюентом. В качестве подвижной фазы используют смесь гексана с этанолом в соотношении 99,5:0,5 по объему. Устанавливают скорость элюирования, соответствующую эффективности колонки для конкретных премиксов, от 0,5 до 2,0 см3/мин. При определении содержания витаминов A, E устанавливают светофильтр длиной волны 289 нм, для определения содержания витамина D_{2} — светофильтр длиной волны 254 нм. Скорость движения диаграммной ленты регистратора устанавливают равной 0,3 — 0,6 см/мин.

После промывания колонки элюентом регистрирующий прибор должен показывать стабильную нулевую линию. С целью повышения чувствительности и точности измерений для каждого хроматографа подбирают оптимальные условия хроматографирования.

Для насыщения колонки в начале работы проводят по 7 — 10 загрузок стандартных растворов и отмечают высоты пиков. При достижении постоянной высоты можно приступить к испытаниям.

6.4.4 Проведение хроматографических измерений

Для хроматографических измерений используют метод сравнения со стандартом. Сравнивают высоты хроматографических пиков для анализируемой пробы и пробы стандарта.

6.5 Обработка результатов

6.5.1 Содержание витамина A, X_{A} , млн. МЕ/т, рассчитывают по формуле

X_{A} = \frac{C_{A} \cdot V_{1} \cdot V_{2} \cdot V_{3} \cdot h_{\times} \cdot 10^{- 6}}{V_{4} \cdot V_{5} \cdot h_{\text{ст}} \cdot m \cdot 10^{- 6}} , (11)

где C_{A} — концентрация витамина A в стандартном растворе, МЕ/см3, по 6.3.3;

V_{1} — объем стандартного раствора витамина A, взятый на омыление, см3, по 6.4.1;

V_{2} , V_{4} — объемы загрузок в колонку стандартного раствора витамина A и раствора пробы, полученных после омыления, соответственно, мм3, по 6.4.4;

V_{3} , V_{5} — объемы экстрактов пробы и стандартного раствора витамина A после проведения подготовки (омыление и т.д.) соответственно по 6.4.2 и 6.4.1, см3;

6.5.2 Содержание витамина D_{2} в премиксе, X_{D} , млн. МЕ/т, вычисляют по формуле

X_{D} = \frac{C_{D} \cdot V_{1} \cdot V_{2} \cdot V_{3} \cdot V_{4} \cdot h_{\times} \cdot 10^{- 6}}{V_{5} \cdot V_{6} \cdot V_{7} \cdot h_{\text{ст}} \cdot m \cdot 10^{- 6}} , (12)

где C_{D} — концентрация витамина D_{2} в стандартном растворе, МЕ/см3, по 6.3.4;

V_{1} — объем стандартного раствора витамина D_{2} , взятый для последующего разбавления, см3, по 6.3.4;

V_{2} — объем стандартного раствора витамина D_{2} , взятый на омыление, см3, по 6.4.1;

V_{3} , V_{6} — объемы загрузок в колонку стандартного раствора витамина D_{2} и раствора пробы, полученных после омыления, соответственно, мм3, по 6.4.4;

V_{4} , V_{7} — окончательные объемы раствора пробы и стандартного раствора D_{2} , подготовленного для хроматографии, соответственно по 6.4.2 и 6.4.1, см3;

h_{\times} , h_{\text{ст}} — высоты пиков витамина D_{2} на хроматограммах пробы и стандартного раствора витамина D_{2} соответственно, е.о.п. или мм;

V_{5} — объем колбы со стандартным раствором D_{2} после первого разведения, см3, по 6.4.1;

m — масса анализируемой пробы премикса, г, по 6.4.2;

6.5.3 Содержание витамина E, X_{E} , г/т, вычисляют по формуле

X_{E} = \frac{C_{E} \cdot V_{1} \cdot V_{2} \cdot V_{3} \cdot h_{\times} \cdot 10^{- 3}}{V_{4} \cdot V_{5} \cdot h_{\text{ст}} \cdot m \cdot 10^{- 6}} , (13)

где C_{E} — массовая концентрация стандартного образца витамина E, мг/см3, по 6.3.5;

V_{1} — объем стандартного раствора витамина E, взятый на омыление, см3, по 6.4.1.;

V_{2} , V_{4} — объемы загрузок в колонку стандартного раствора витамина E и раствора пробы соответственно, см3, по 6.4.4;

V_{3} , V_{5} — окончательные объемы раствора пробы и стандартного раствора витамина E, подготовленные для хроматографии, соответственно, см3, по 6.4.2 и 6.4.1;

h_{\times} , h_{\text{ст}} — высоты пиков витамина E на хроматограммах пробы и стандартного раствора соответственно, е.о.п., мм;

10^{- 3} — коэффициент пересчета миллиграммов в граммы;

m — масса анализируемой пробы премикса, г, по 6.4.2;

За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости и удовлетворяющих условию приемлемости (см. 7.1).

7. Контроль точности результатов измерений

7.1 Приемлемость результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости)

Абсолютное расхождение между результатами двух отдельных независимых испытаний, полученными одним и тем же методом на одной испытуемой пробе в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором на одном и том же экземпляре оборудования в течение короткого промежутка времени при доверительной вероятности P = 0,95, не должно превышать предела повторяемости (сходимости), r, приведенного в таблицах 2, 3.

содержания витаминов A, E методом обращенно-фазной

Наименование показателя	Предел повторяемости, r	Предел воспроизводимости, R
Витамин A, млн. МЕ/т	0,1 \cdot x_{A}	0,15 \cdot X_{A}
Витамин E, г/т	0,15 \cdot x_{E}	0,2 \cdot X_{E}
Примечание , - среднеарифметическое значение результатов испытаний содержания витамина A, млн. МЕ/т, в условиях повторяемости и воспроизводимости; , - среднеарифметическое значение результатов испытаний содержания витамина E, г/т, в условиях повторяемости и воспроизводимости.

Таблица 3

жидкостной хроматографии

Наименование показателя	Предел повторяемости, r	Предел воспроизводимости, R
Витамин A, млн. МЕ/т	0,1 \cdot x_{A}	0,2 \cdot X_{A}
Витамин D, млн. МЕ/т	0,1 \cdot x_{D}	0,2 \cdot X_{D}
Витамин E, г/т	0,1 \cdot x_{E}	0,2 \cdot X_{E}
Примечание , - среднеарифметическое значение результатов испытаний содержания витамина A, млн. МЕ/т, в условиях повторяемости и воспроизводимости; , - среднеарифметическое значение результатов испытаний содержания витамина D, млн. МЕ/т, в условиях повторяемости и воспроизводимости; , - среднеарифметическое значение результатов испытаний содержания витамина E, г/т, в условиях повторяемости и воспроизводимости.

7.2 Приемлемость результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Абсолютное расхождение между результатами двух отдельных испытаний, полученными одним и тем же методом на одной испытуемой пробе в разных лабораториях разными операторами на различных экземплярах оборудования при доверительной вероятности P = 0,95, не должно превышать предела воспроизводимости, R, приведенного в таблицах 2, 3.

Если расхождение между результатами параллельных определений превышает предел повторяемости, то анализ повторяют, начиная со взвешивания анализируемой пробы.

Если расхождение между результатами параллельных определений вновь превышает предел повторяемости, выясняют и устраняют причины плохой повторяемости результатов анализа.

8. Требования безопасности

8.1. Работы с концентрированными кислотами, щелочами и др. летучими веществами должны проводиться в вытяжном шкафу.

8.2. При проведении испытаний необходимо соблюдать требования электробезопасности по ГОСТ 12.2.007.0.

9. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица, имеющие высшее или среднее специальное химическое образование или опыт работы в химической лаборатории, владеющие техникой проведения анализа и изучившие инструкции по эксплуатации приборов.

из премикса и стандартного раствора