ФС.3.7.0001.18. Фармакопейная статья. Печени рыб масло жирное
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749)
(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том IV»)
Примечание
В соответствии с Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749 данный документ введен в действие с 01.12.2018. Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/femb/pharmacopea.php по состоянию на 15.03.2019. Взамен ГФ X, ст. 476.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
| Печени рыб масло жирное | ФС.3.7.0001.18 |
|---|---|
| Jecoris pisces oleum pingue | Взамен ГФ X, ст. 476 |
Жирное масло, получаемое из печени рыб: трески атлантической — Gadus morrhua Linne, трески балтийской — Gadus morrhua callarias Linne, пикши — Melanogrammus aeglefinus L., путассу северной — Micromesistius poutaussou (Risso) семейства тресковых — Gadidae или из печени макроруса тупорылого — Coryphaenoides rupestris G. семейства макрорусовые — Macrouride, содержащее ретинол, колекальциферол и омега-3 жирные кислоты (эйкозопентаеновой кислоты — не менее 13%; докозагексаеновой кислоты — не менее 9%; сумма полиненасыщенных жирных кислот — не менее 28%), и применяемое в качестве лекарственного средства. Подходящий антиоксидант может быть добавлен.
<*> В случае наличия в составе рыбьего жира антиоксидантов должна быть осуществлена их идентификация и количественное определение с использованием валидированных методик.
Описание. Прозрачная маслянистая жидкость от светло-желтого до желтого цвета со слабым характерным запахом.
Растворимость. Практически нерастворимо в воде, мало растворимо в спирте 96%, очень легко растворимо в хлороформе.
УФ-спектрофотометрия. УФ-спектр испытуемого раствора, полученного для количественного определения ретинола (раздел «Количественное определение. Ретинол»), в интервале длин волн от 240 нм до 360 нм должен иметь максимум поглощения при (325 +/- 2) нм.
Высокоэффективная жидкостная хроматография.
На хроматограмме испытуемого раствора, полученного для количественного определения колекальциферола (раздел «Количественное определение. Колекальциферол»), должен регистрироваться основной пик с временем удерживания, соответствующим времени удерживания пика на хроматограмме раствора сравнения.
На хроматограмме испытуемого раствора, полученного при испытании по разделу «Состав жирных кислот», должны регистрироваться основные пики с временами удерживания, соответствующие временам удерживания основных пиков на хроматограмме раствора стандартных образцов (эйкозопентаеновая кислота и докозагексаеновая кислота).
Плотность. От 0,917 до 0,927 г/см3 в соответствии с требованиями ОФС «Плотность».
Показатель преломления. От 1,477 до 1,484 в соответствии с требованиями ОФС «Рефрактометрия».
Цветность. Определение проводят в соответствии с ОФС «Определение окраски жидкостей», метод 1.
Субстанция должна выдерживать сравнение со стандартным раствором, приготовленным следующим образом: к 3,0 мл красного исходного раствора прибавляют 25,0 мл желтого исходного раствора, доводят хлористоводородной кислоты раствором 1% до 50,0 мл и перемешивают.
Перекисное число. Не более 10,0 в соответствии с ОФС «Перекисное число», метод 1.
Число омыления. От 180 до 196 в соответствии с требованиями ОФС «Число омыления».
Йодное число. От 140 до 175 в соответствии с требованиями ОФС «Йодное число».
Кислотное число. Не более 2,0 в соответствии с требованиями ОФС «Кислотное число».
Анизидиновое число. Не более 30,0 в соответствии с требованиями ОФС «Анизидиновое число».
Неомыляемые вещества. Не более 2,0%.
Испытание проводят весовым методом.
Около 3 г (точная навеска) субстанции помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл свежеприготовленного раствора калия гидроксида спиртового и кипятят на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч, периодически перемешивая круговыми движениями. Охлаждают до температуры ниже 25 °C и количественно переносят содержимое колбы в делительную воронку вместимостью 500 мл с помощью 100 мл воды. Полученный раствор осторожно встряхивают с эфиром, свободным от пероксидов, трижды по 100 мл. Все эфирные извлечения собирают в отдельную делительную воронку, в которую предварительно помещают 40 мл воды, осторожно встряхивают в течение нескольких минут, оставляют до полного расслоения смеси, затем отбрасывают водный слой. Эфирный слой промывают двумя порциями воды, по 40 мл каждая. Затем промывают поочередно 40 мл калия гидроксида раствором спиртовым 3% и 40 мл воды, повторяя данную процедуру три раза. Затем эфирный слой несколько раз промывают 40 мл воды до отсутствия щелочной реакции в водном слое по фенолфталеину. Эфирный слой количественно переносят в доведенную до постоянной массы колбу (m2) с помощью эфира, свободного от пероксидов.
Эфир отгоняют с соответствующими предосторожностями и к остатку прибавляют 6 мл ацетона. Затем аккуратно удаляют растворитель в потоке воздуха. Остаток в колбе сушат до постоянной массы при температуре от 100 до 105 °C, охлаждают в эксикаторе и взвешивают (m1).
Содержание неомыляемых веществ в процентах (X, %) вычисляют по формуле:
X = \frac{(m_{1} - m_{2}) \cdot 100}{a} ,
где m1 — масса колбы с сухим остатком, г;
Остаток растворяют в 20 мл спирта 96%, предварительно нейтрализованного по фенолфталеину, и титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида спиртовым. Если объем 0,1 М раствора натрия гидроксида спиртового, пошедшего на титрование, более 0,2 мл, расслоение слоев прошло не полностью; при этом взвешенный остаток не может рассматриваться как «Неомыляемые вещества». Испытание следует повторить.
Стеарин. 10 мл субстанции нагревают до 60 — 90 °C, затем охлаждают с помощью ледяной бани до 0 °C и выдерживают в течение 3 ч при этой температуре. Субстанция должна быть прозрачной.
При необходимости, отделяют нерастворимые вещества фильтрованием образца после нагревания.
Тяжелые металлы (медь, свинец, цинк) и мышьяк. Содержание меди — не более 0,0001%; свинца — не более 0,00005%; цинка — не более 0,0004%; мышьяка — не более 0,00005%.
Испытание проводят атомно-абсорбционным методом; расчет содержания кадмия, мышьяка, свинца осуществляют методом калибровочной кривой в соответствии с требованиями ОФС «Атомно-эмиссионная спектрометрия», используя метод микроволновой (при наличии соответствующего лабораторного оборудования) или сухой минерализации.
Магния нитрата раствор (2). 17,3 г магния нитрата растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 70 мл воды, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.
Аммония дигидрофосфата раствор. 10,0 г аммония дигидрофосфата растворяют в 80 мл воды в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.
Азотной кислоты раствор 1%. 8,0 мл азотной кислоты разведенной 12,5% помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Микроволновая минерализация. Около 0,5 г (точная навеска) субстанции помещают в воздухонепроницаемый реакционный сосуд, прибавляют 6 мл кислоты азотной, свободной от тяжелых металлов, 4 мл кислоты хлористоводородной, свободной от тяжелых металлов, и перемешивают. Реакционный сосуд помещают в микроволновое лабораторное оборудование с селективной мощностью от 0 до 630 Вт и программируют нагревание следующим образом:
По окончании программы сосуд охлаждают на воздухе, прибавляют 4 мл кислоты серной, свободной от тяжелых металлов, и повторяют программу нагрева. После охлаждения на воздухе полученный прозрачный и бесцветный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл с помощью воды дважды по 15 мл. Затем в мерную колбу прибавляют 1,0 мл раствора магния нитрата, 1,0 мл раствора аммония дигидрофосфата, перемешивают, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Одновременно проводят контрольный опыт с добавлением тех же реактивов и выполняют минерализацию в аналогичных с испытуемой субстанцией условиях.
Сухая минерализация. Около 3 г (точная навеска) субстанции помещают в фарфоровый тигель, осторожно обугливают на плитке до прекращения выделения дыма, затем озоляют в муфельной печи при температуре 550 °C. Остаток в тигле растворяют при нагревании в водном растворе азотной кислоты (1:1) из расчета 1 — 5 мл на навеску (в зависимости от зольности субстанции).
Раствор выпаривают до удаления свободной влаги, полученный осадок растворяют в 15 мл азотной кислоты раствора 1%, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем содержимого колбы тем же растворителем до метки и перемешивают.
Одновременно проводят контрольный опыт с добавлением тех же реактивов и выполняют минерализацию в аналогичных с испытуемой субстанцией условиях.
Рабочие стандартные растворы токсичных элементов для построения калибровочного графика готовят из исходных стандартных растворов с аттестованной концентрацией элементов (ГСО меди, мышьяка, свинца, цинка) последовательным разбавлением их 1% раствором азотной кислоты до требуемых значений рабочего диапазона измерений. Содержание элементов в растворе не должно выходить за пределы содержания рабочего диапазона измерений. В случае превышения пределов рабочего диапазона измерений разбавление проб производится 1% раствором азотной кислоты. В качестве нулевого стандарта применяется 1% раствор азотной кислоты.
Приготовление основных стандартных растворов.
1. Стандартные растворы меди готовят разбавлением стандартного раствора меди с концентрацией ионов меди 1 мг/мл (ГСО 7764-2000 или аналогичный).
Стандартный раствор А меди с концентрацией 1000 мкг/л. 1 мл раствора ГСО меди с концентрацией ионов меди 1 мг/мл помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, доводят объем азотной кислоты раствором 1% до метки и перемешивают.
Стандартный раствор Б меди с концентрацией 10 мкг/л. 1 мл раствора стандартного раствора А меди с концентрацией ионов меди 1000 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем азотной кислоты раствором 1% до метки и перемешивают.
Стандартный раствор В меди с концентрацией 20 мкг/л. 2 мл раствора стандартного раствора А меди с концентрацией ионов меди 1000 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем азотной кислоты раствором 1% до метки и перемешивают.
Стандартный раствор Г меди с концентрацией 30 мкг/л. 3 мл раствора стандартного раствора А меди с концентрацией ионов меди 1000 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем азотной кислоты раствором 1% до метки и перемешивают.
2. Стандартные растворы свинца готовят разбавлением ГСО свинца с концентрацией 1 мг/мл (ГСО 7877-2000 или аналогичный).
Стандартный раствор А свинца с концентрацией 1000 мкг/л. 1 мл ГСО свинца с концентрацией ионов свинца 1 мг/мл помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, доводят объем азотной кислоты раствором 1% до метки и перемешивают.
Стандартный раствор Б свинца с концентрацией 10 мкг/л. 1 мл стандартного раствора А свинца с концентрацией ионов свинца 1000 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем азотной кислоты раствором 1% до метки и перемешивают.
Стандартный раствор В свинца с концентрацией 20 мкг/л. 2 мл стандартного раствора А свинца с концентрацией ионов свинца 1000 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем азотной кислоты раствором 1% до метки и перемешивают.
Стандартный раствор Г свинца с концентрацией 30 мкг/л. 3 мл стандартного раствора А свинца с концентрацией ионов свинца 1000 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем азотной кислоты раствором 1% до метки и перемешивают.
3. Стандартные растворы цинка готовят разбавлением стандартного раствора цинка с известной концентрацией ионов цинка 1 мг/мл (ГСО 7770-2000 или аналогичный).
Стандартный раствор А цинка с концентрацией 1 мг/л. 0,5 мл ГСО цинка с концентрацией ионов цинка 1 мг/мл помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, доводят объем раствором азотной кислоты 1% до метки и перемешивают.
Стандартный раствор Б цинка с концентрацией 2 мг/л. 1 мл ГСО цинка с концентрацией ионов цинка 1 мг/мл помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, доводят объем раствором азотной кислоты 1% до метки и перемешивают.
Стандартный раствор В цинка с концентрацией 3 мг/л. 1,5 мл ГСО цинка с концентрацией ионов цинка 1 мг/мл помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствором азотной кислоты 1% до метки и перемешивают.
4. Стандартные растворы мышьяка готовят разбавлением ГСО мышьяка с концентрацией мышьяка 0,1 мг/мл (ГСО 7344-96 или аналогичный).
Стандартный раствор А мышьяка с концентрацией 1000 мкг/л. 1 мл ГСО мышьяка с концентрацией ионов мышьяка 0,1 мг/мл помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствором азотной кислоты 1% до метки и перемешивают.
Стандартный раствор Б мышьяка с концентрацией 10 мкг/мл. 1 мл стандартного раствора А мышьяка с концентрацией ионов мышьяка 1000 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствором азотной кислоты 1% до метки и перемешивают.
Стандартный раствор В мышьяка с концентрацией 20 мкг/мл. 2 мл стандартного раствора А мышьяка с концентрацией ионов мышьяка 1000 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствором азотной кислоты 1% до метки и перемешивают.
Стандартный раствор Г мышьяка с концентрацией 30 мкг/мл. 3 мл стандартного раствора А мышьяка с концентрацией ионов мышьяка 1000 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствором азотной кислоты 1% до метки и перемешивают.
При необходимости используют стандартные растворы других концентраций.
Построение калибровочного графика, измерение концентрации элемента в испытуемом растворе и растворе контрольного опыта проводят согласно инструкции по эксплуатации атомно-абсорбционного спектрометра.
Для проведения измерений используют наиболее чувствительные линии поглощения элементов со следующими длинами волн: медь — 324,8 нм; свинец — 283,3 нм; цинк — 307,6 нм; мышьяк — 193,7 нм. В качестве источника излучения используют лампы с полым катодом на медь, мышьяк, свинец, цинк.
Содержание определяемых элементов в субстанции в процентах (X, %) вычисляют по формуле:
X = \frac{(C_{\text{х}} - C_{\text{к}}) \cdot V \cdot N}{a \cdot 10^{4}} ,
где Cx — концентрация элемента в испытуемом растворе, мкг/л;
N — разведение испытуемого раствора;
Cк — концентрация элемента в растворе контрольного опыта, мкг/л;
V — исходный объем испытуемого раствора, л;
a — навеска испытуемой субстанции, г;
104 — коэффициент пересчета мкг/г в проценты.
Испытание проводят атомно-абсорбционным методом.
Основной раствора калия дихромата. 20 г калия дихромата растворяют в 50 мл воды в мерной колбе вместимостью 500 мл, прибавляют 50 мл азотной кислоты концентрированной, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Срок хранения раствора в темной склянке с притертой пробкой 6 месяцев.
Фоновый раствор калия дихромата. 5 мл основного раствора калия дихромата помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Фоновый раствор используется для разбавления рабочих и калибровочных растворов. Срок хранения раствора в темной склянке с притертой пробкой 1 месяц.
Стандартные растворы ртути готовят разведением ГСО ртути с концентрацией ионов ртути 1 мг/мл (ГСО 7343-96 или аналогичный).
Стандартный раствор А ртути с концентрацией 10000 мкг/л. 1 мл ГСО ртути с концентрацией ионов ртути 1 мг/мл помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем фоновым раствором до метки и перемешивают.
Стандартный раствор Б ртути с концентрацией 100 мкг/л. 1 мл стандартного раствора А ртути с концентрацией ртути 10000 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем фоновым раствором до метки и перемешивают.
Стандартный раствор В ртути с концентрацией 10 мкг/л. 10 мл стандартного раствора Б ртути с концентрацией ртути 100 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем фоновым раствором до метки и перемешивают.
Калибровочные растворы готовят в день проведения анализа.
Калибровочный раствор 1. 10 мл стандартного раствора В ртути с концентрацией ртути 10 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, содержимое колбы доводят фоновым раствором до метки и перемешивают (концентрация ртути в калибровочном растворе 1,0 мкг/л).
Калибровочный раствор 2. 5 мл стандартного раствора В ртути с концентрацией ртути 10 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, содержимое колбы доводят фоновым раствором до метки и перемешивают (концентрация ртути в калибровочном растворе 0,5 мкг/л).
Калибровочный раствор 3. 2 мл стандартного раствора В ртути с концентрацией ртути 10 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, содержимое колбы доводят фоновым раствором до метки и перемешивают (концентрация ртути в калибровочном растворе 0,2 мкг/л).
Калибровочный раствор 4. 1 мл стандартного раствора В ртути с концентрацией ртути 10 мкг/л помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, содержимое колбы доводят фоновым раствором до метки и перемешивают (концентрация ртути в калибровочном растворе 0,1 мкг/л).
Хлористоводородная кислота разведенная. 20 г хлористоводородной кислоты концентрированной, свободной от тяжелых металлов, растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 70 мл воды, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
Восстанавливающий реагент. 50 г олова (II) хлорида растворяют в мерной колбе вместимостью 500 мл в 100 мл хлористоводородной кислоты разведенной, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают (концентрация олова (II) хлорида 10 г/л). Раствор используют свежеприготовленным.
Испытуемый раствор. Около 1 г (точная навеска) субстанции помещают в круглодонную колбу для деструкции вместимостью 250 мл для проведения «мокрой» минерализации, прибавляют 20 мл смеси азотной кислоты концентрированной и серной кислоты концентрированной в соотношении (1:1) по объему. Колбу соединяют с обратным холодильником и выдерживают в водяной бане с температурой (60 — 70) °C в течение 15 мин. Затем колбу помещают в кипящую водяную баню на 5 мин. По истечении указанного срока в колбу через обратный холодильник осторожно по каплям прибавляют 30 мл воды, и оставляют на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Минерализацию проводят до осветления придонного слоя.
По окончании минерализации колбу удаляют из бани, охлаждают и промывают 10 мл горячей воды. Реакционную смесь фильтруют через фильтр, смоченный фоновым раствором, в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят содержимое колбы этим же раствором до метки и перемешивают. Одновременно проводят контрольный опыт, добавляя те же реактивы, в условиях, аналогичных проведению минерализации испытуемой субстанции.
Анализ проводят с помощью подходящего оборудования, например атомно-абсорбционного спектрометра с электротермическим атомизатором с использованием генератора ртутно-гидридного в качестве приставки по методу «холодного пара». Допускается использование альтернативного оборудования, обеспечивающего определение ртути в приведенном диапазоне концентраций калибровочных растворов с уточнением параметров выполняемого определения.
Построение калибровочного графика, измерение концентрации элемента в испытуемом растворе и растворе контрольного опыта проводят согласно инструкции по эксплуатации атомно-абсорбционного спектрометра.
Для проведения измерений используют линию поглощения ртути — 253,7 нм. В качестве источника излучения используют ртутную лампу с полым катодом. В емкости — стаканы ртутно-гидридного генератора перед измерением помещают по 10 мл фонового, испытуемого, стандартных растворов и по 1,5 мл раствора олова (II) хлорида.
Содержание ртути в субстанции в процентах (X, %) вычисляют по формуле:
X = \frac{(C_{\text{х}} - C_{\text{к}}) \cdot V}{a \cdot 10^{4}} ,
где Cx — концентрация ртути в испытуемом растворе, мкг/л;
Cк — концентрация ртути в растворе контрольного опыта, мкг/л;
a — навеска испытуемой субстанции, г;
V — исходный объем раствора, полученный после пробоподготовки, л;
104 — коэффициент пересчета из мкг/г в %.
Остаточные количества пестицидов. Определение проводят методом газожидкостной хроматографии в соответствии с требованиями ОФС «Определение остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».
Содержание хлорорганических пестицидов не должно превышать 0,05 мг/кг.
Стандартные растворы хлорорганических пестицидов. Около 5 — 10 мг (точная навеска) каждого из стандартных образцов: \alpha - \text{гексахлорциклогексана} , \beta - \text{гексахлорциклогексана} , \gamma - \text{гексахлорциклогексана} , 4,4'-дихлордифенилхлорэтилена, 4,4'-дихлордифенилдихлорметилметана; 4,4'-дихлордифенилтрихлорметилметана, помещают в отдельные мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяют в гексане, доводят объемы растворов тем же растворителем до метки и перемешивают. Концентрация каждого хлорорганического пестицида в основных растворах находится в интервале от 50 до 100 мкг/мл.
Промежуточный стандартный раствор смеси хлорорганических пестицидов. 5,0 мл основного стандартного раствора каждого хлорорганического пестицида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в гексане, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Концентрация каждого хлорорганического пестицида в промежуточном растворе находится в интервале от 2,50 до 5,0 мкг/мл.
Стандартный раствор. 2,0 мл промежуточного стандартного раствора смеси хлорорганических пестицидов помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в гексане, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Концентрация каждого хлорорганического пестицида в полученном растворе находится в интервале от 50,0 до 100,0 нг/мл.
Калибровка газового хроматографа. Для расчета коэффициента чувствительности детектора электронного захвата (ECD-детектора) и предела обнаружения хлорорганических пестицидов вводят в хроматограф 1 мкл стандартного раствора. Коэффициент чувствительности ECD-детектора для каждого из определяемых хлорорганических пестицидов вычисляют по формуле:
\text{К}_{i} = \frac{C_{i}}{S_{i}} ,
где Кi — коэффициент чувствительности для каждого определяемого пестицида;
Ci — содержание каждого определяемого хлорорганического пестицида, нг;
Si — площадь пика каждого определяемого хлорорганического пестицида на хроматограмме стандартного раствора.
Проверка пригодности хроматографической системы.
Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие требования:
- относительное стандартное отклонение площадей пиков хлорорганических пестицидов не должно превышать 3,0%;
- эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику \alpha - \text{гексахлорциклогексана} , должна быть не менее 2000 теоретических тарелок;
- фактор асимметрии пиков хлорорганических пестицидов должен составлять от 0,7 до 1,5;
- разрешение между пиками хлорорганических пестицидов должно быть не менее 1,5.
Пределом обнаружения пика пестицида считается высота пика, десятикратно превышающая уровень шума детектора.
Испытуемый раствор. Около 5 г (точная навеска) субстанции растворяют в 50 мл гексана, переносят в делительную воронку, прибавляют 30 мл серной кислоты концентрированной, осторожно перемешивают и после разделения слоев сливают отработанную серную кислоту. Очистку повторяют до получения бесцветного кислотного слоя. Полученный раствор промывают двумя порциями по 15 мл натрия карбоната раствора 1%, затем водой до нейтральной реакции, фильтруют через фильтр, содержащий натрия сульфат безводный, слой осушителя тщательно промывают гексаном и отжимают стеклянной пробкой. Объединенные гексановые растворы упаривают на роторном испарителе досуха, сухой остаток растворяют в 5 мл гексана (испытуемый раствор).
1 мкл испытуемого раствора вводят в газовый хроматограф и регистрируют хроматограмму в следующих условиях:
- газовый хроматограф, снабженный детектором электронного захвата (ECD-детектор);
- колонка кварцевая капиллярная длиной 25 м с внутренним диаметром 0,32 мм или аналогичная;
- неподвижная фаза SE-54 или аналогичная, толщина пленки 0,25 мкм;
- температура термостата колонки программируется в следующем режиме: от 0 до 2 мин при температуре 50 °C; от 2 до 7,5 мин программирование температуры от 50 °C до 160 °C; от 7,5 мин до 47,5 мин программирование температуры от 160 °C до 280 °C; от 47,5 мин до 62,5 мин при температуре 280 °C;
- температура инжектора — 290 °C;
- температура детектора — 320 °C;
- газ-носитель — азот особой чистоты;
- скорость расхода газа-носителя 2,0 мл/мин (через колонку), 4,0 мл/мин (через детектор);
- деление потока 1:20;
- объем вводимой пробы 1 мкл.
Порядок выхода хлорорганических пестицидов: \alpha - \text{гексахлорциклогексан} , \beta - \text{гексахлорциклогексан} , \gamma - \text{гексахлорциклогексан} , 4,4'-дихлордифенилхлорэтилен, 4,4'-дихлордифенилдихлорметилметан; 4,4'-дихлордифенилтрихлорметилметан.
Содержание каждого хлорорганического пестицида в субстанции в мг/кг вычисляют по формуле:
\text{Х } = \frac{\text{К}_{1} \cdot S_{1} \cdot 5}{1000 \cdot 1a} ,
где К1 — коэффициент чувствительности детектора для каждого определяемого хлорорганического пестицида;
S1 — площадь пика каждого определяемого хлорорганического пестицида на хроматограмме испытуемого раствора;
5 — объем испытуемого раствора;
1 — вводимый объем испытуемого раствора, мкл;
Полученные количества каждого определяемого хлорорганического пестицида суммируют.
Результаты определения считаются достоверными, если выполняется проверка пригодности хроматографической системы.
Радионуклиды. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».
Микробиологическая чистота. В соответствии с требованиями ОФС «Микробиологическая чистота».
Количественное определение. Ретинол. Колекальциферол.
Состав жирных кислот. Содержание ретинола должно быть от 350 МЕ до 1000 МЕ в 1 г; содержание колекальциферола должно быть от 50 МЕ до 100 МЕ в 1 г; содержание эйкозопентаеновой кислоты должно быть не менее 13%; докозагексаеновой кислоты — не менее 9%; сумма полиненасыщенных жирных кислот — не менее 28%.
Испытание проводят методом спектрофотометрии.
Натрия хлорида раствор 1%. 2,5 г натрия хлорида помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Раствор используют свежеприготовленным.
Испытуемый раствор. Около 1 г (точная навеска) субстанции помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 3 мл свежеприготовленного калия гидроксида 50%, 30 мл этанола безводного и кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин, быстро охлаждают и прибавляют 30 мл натрия хлорида раствор 1%. Экстрагируют эфиром три раза по 50 мл, и после полного разделения слоев отбрасывают нижний слой. Объединенные верхние слои промывают четыре раза по 50 мл натрия хлорида раствором 1%, фильтруют через бумажный фильтр с 5 г натрия сульфата безводного и отгоняют органический растворитель с помощью роторного испарителя при температуре не выше 30 °C при пониженном давлении досуха. Сухой остаток растворяют в 100 мл 2-пропанола.
Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора с помощью спектрофотометра при длинах волн 300 нм, 310 нм, 325 нм и 334 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения 2-пропанол.
Содержание ретинола (полностью перешедшего в транс-форму) в субстанции в МЕ/г вычисляют по формуле:
\text{Х } = \frac{\text{А}_{325} \cdot V \cdot 1821}{100 \cdot a} ,
где A325 — оптическая плотность при длине волны 325 нм;
V — общий объем испытуемого раствора, мл;
1821 — коэффициент пересчета удельного показателя поглощения ретинола, полностью перешедшего в транс-форму, МЕ;
Вышеприведенная формула может быть использована, только если A325 имеет значение, не превышающее A325скорр/0,970, где: A325скорр — скорректированная оптическая плотность при длине волны 325 нм.
Скорректированную оптическую плотность (A325скорр) вычисляют по формуле:
A325скорр = 6,815·A325 — 2,555·A310 — 4,260·A334,
где A325, A310, A334 — оптические плотности при длинах волн 310 нм, 325 нм, 334 нм соответственно.
Если A325 имеет значение, превышающее A325скорр/0,970, содержание ретинола (полностью перешедшего в транс-форму) в субстанции в МЕ/г вычисляют по формуле:
\text{Х } = \frac{\text{А}_{325\text{скорр}} \cdot V \cdot 1821}{100 \cdot a} .
Результаты количественного определения считаются достоверными, если:
- в УФ-спектре испытуемого раствора наблюдается максимум поглощения при длине волны (325 +/- 2) нм;
- отношение оптической плотности при длине волны 300 нм к оптической плотности при длине волны 325 нм менее 0,73.
Испытание проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, выполняя все операции быстро, избегая воздействия солнечного света и воздуха.
Раствор бутилгидрокситолуола в гексане. 1 г бутилгидрокситолуола помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 80 мл гексана, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.
Калия гидроксида раствор 80%. 80 г калия гидроксида растворяют в воде и доводят объем раствора водой до 100 мл.
Калия гидроксида раствор 3% в этаноле 10%. 6 г калия гидроксида помещают в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяют в 100 мл воды, прибавляют 20 мл этанола безводного, перемешивают, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
Аскорбиновой кислоты раствор 10%. 2,5 г аскорбиновой кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15 мл воды, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
Натрия хлорида раствор 1%. 10 г натрия хлорида помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
Раствор стандартного образца колекальциферола. Около 0,015 г (точная навеска) СО колекальциферола растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл в этаноле безводном, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. 1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора этанолом безводным до метки и перемешивают.
Исходный испытуемый раствор. Около 10 г (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл гексана, доводят объем раствора гексаном до метки и перемешивают.
Испытуемый раствор 1. 20,0 мл исходного испытуемого раствора помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 5 мл свежеприготовленного аскорбиновой кислоты раствора 10%, 10 мл свежеприготовленного калия гидроксида раствора 80%, 100 мл этанола безводного, перемешивают и кипятят на водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин в инертной атмосфере. К горячему раствору прибавляют 100 мл натрия хлорида раствора 1% и охлаждают под струей холодной воды до комнатной температуры. Полученный раствор количественно переносят в делительную воронку вместимостью 500 мл при помощи 75 мл натрия хлорида раствора 1%, а затем 150 мл смеси эфир — гексан (2:1). Содержимое воронки встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения нижний слой отделяют, а верхний осторожно, избегая сильного встряхивания, промывают сначала 50 мл калия гидроксида раствором 3% в этаноле 10%, а затем — натрия хлорида раствором 1% три раза по 50 мл. Верхний слой фильтруют через бумажный фильтр с натрия сульфата безводного в круглодонную колбу (для ротационного испарителя). Делительную воронку промывают 10 мл смеси эфир — гексан (2:1) и также фильтруют через бумажный фильтр с натрия сульфатом безводным в круглодонную колбу (для ротационного испарителя). Отгоняют растворитель с помощью ротационного испарителя при пониженном давлении в токе инертного газа и температуре не выше 30 °C досуха. Сухой остаток растворяют в 1,5 мл подвижной фазы (подраздел «Очистка»).
Испытуемый раствор 2. К 20,0 мл исходного испытуемого раствора прибавляют 20 мл гексана и далее поступают так, как указано в методике приготовления испытуемого раствора 1, начиная со слов «... помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл...».
Раствор сравнения. К 5 мл раствора стандартного образца колекальциферола прибавляют 20 мл гексана и далее поступают так, как указано в методике приготовления испытуемого раствора 1, начиная со слов «... помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл...».
- жидкостный хроматограф с УФ-детектором;
- аналитическая длина волны — 265 нм;
- хроматографическая колонка длиной 0,25 м, диаметр 4,6 мм, неподвижная фаза — силикагель нитрильный (10 мкм);
- подвижная фаза — изоамиловый спирт-гексан (1,69:98,4);
- скорость потока подвижной фазы 1,1 мл/мин;
- температура колонки — 25 °C.
350 мкл раствора сравнения вводят в инжектор хроматографа. Элюат начинают собирать за 2 мин до наступления и в течение 2 мин после наступления времени удерживания колекальциферола в пробирку с притертой пробкой, содержащую бутилгидрокситолуол в гексане. Процедуру повторяют с испытуемыми растворами 1 и 2. Из каждой пробирки удаляют растворитель током азота при температуре не выше 30 °C. Каждый из полученных остатков растворяют в 1,5 мл ацетонитрила.
- жидкостный хроматограф с УФ-детектором;
- аналитическая длина волны — 265 нм;
- хроматографическая колонка длиной 0,15 м, диаметр 4,6 мм, неподвижная фаза — силикагель октадецилсилильный для хроматографии (5 мкм);
- подвижная фаза — ацетонитрил (для ВЭЖХ) — фосфорная кислота концентрированная (99,8:0,2);
- скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин;
- температура колонки — 25 °C.
Проверка пригодности хроматографической системы.
Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия:
- относительное стандартное отклонение площади пика колекальциферола на хроматограмме раствора сравнения не должно превышать 5%;
- эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику колекальциферола, должна составлять не менее 1000 теоретических тарелок;
- фактор асимметрии пика колекальциферола должен составлять от 0,7 до 1,5.
В инжектор хроматографа вводят не более 50 мкл каждого из трех растворов, полученных в результате очистки, и хроматографируют в указанных выше условиях.
Содержание колекальциферола в субстанции в международных единицах (X, МЕ) вычисляют по формуле:
\text{Х } = \frac{S \cdot a_{0} \cdot 1 \cdot 5 \cdot 50 \cdot 40000}{S_{0} \cdot a \cdot 20 \cdot 50 \cdot 100} = \frac{S \cdot a_{0} \cdot 100}{S_{0} \cdot a} ,
где S — площадь пика колекальциферола на хроматограмме испытуемого раствора (1, 2);
S0 — площадь пика колекальциферола на хроматограмме раствора сравнения;
a0 — навеска стандартного образца колекальциферола, мг;
a — навеска субстанции, взятая для определения, мг;
40000 — коэффициент пересчета мг колекальциферола в МЕ.
Испытание проводят методом газовой хроматографии.
Натрия метилата раствор. 4,6 г натрия небольшими порциями растворяют в 100 мл метанола.
Испытуемый раствор. 100 мг субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15 мл гексана, прибавляют 1,25 мл метилата натрия раствора и подвергают полученный раствор воздействию ультразвука при 40 °C в течение 15 мин. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора гексаном до метки и тщательно перемешивают. Отделяют верхний гексановый слой и фильтруют через бумажный фильтр («белая лента»), отбрасывая первые 5 — 10 мл фильтрата. Полученный фильтрат помещают в делительную воронку объемом 100 мл, прибавляют 10 мл воды, тщательно перемешивают и после разделения слоев нижний водный слой сливают. Процедуру повторяют дважды. Промытый таким образом гексановый слой фильтруют через бумажный фильтр («белая лента»), содержания натрия сульфат безводный.
Раствор стандартных образцов. 25 мг метилового эфира эйкозопентаеновой кислоты и 20 мг метилового эфира докозагексаеновой кислоты растворяют в 10 мл гексана.
Проверка пригодности хроматографической системы. Для проверки пригодности хроматографической системы хроматографируют раствор стандартных образцов, получая не менее 5 хроматограмм в указанных ниже условиях.
Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия:
- относительное стандартное отклонение, рассчитанное для площадей пиков метиловых эфиров эйкозопентаеновой и докозагексаеновой кислот на хроматограммах раствора стандартных образцов должно быть не более 2%;
- эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику метилового эфира эйкозопентаеновой кислоты, должна быть не менее 50000 теоретических тарелок;
- разрешение между пиками эйкозопентаеновой и докозагексаеновой кислот должно быть не менее 20.
- газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором;
- колонка капиллярная с неподвижной фазой поли(диметил)(дифенил)-силоксан размером 30 м x 0,32 мм; толщина слоя 0,1 мкм;
- объем вводимой пробы 0,2 мкл;
- газ-носитель гелий для хроматографии;
- скорость газа-носителя 20 см/с;
- деление потока 1:50;
- температура инжектора 270 °C;
- температура детектора 300 °C;
- программа температуры: начальная температура 180 °C, выдержка при начальной температуре — 8 мин; подъем до 280 °C со скоростью 5 °C/мин, выдержка при конечной температуре — 5 мин.
Относительное время удерживания метилового эфира эйкозопентаеновой кислоты (относительно метилового эфира докозагексаеновой кислоты) составляет около 0,77 — 0,83.
По 0,2 мкл испытуемого раствора и раствора стандартных образцов хроматографируют попеременно в указанных выше условиях, получая не менее 3 хроматограмм.
Содержание эйкозопентаеновой кислоты или докозагексаеновой кислоты вычисляют методом внутренней нормализации.
Содержание суммы полиненасыщенных кислот вычисляют, учитывая пики метиловых эфиров жирных кислот с относительным временем удерживания от 0,7 до 1,2 (относительно метилового эфира докозагексаеновой кислоты).
Хранение. В защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.