ФС.2.1.0686. Фармакопейная статья. Фолиевая кислота

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 13.03.2024 № 120)

(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание»)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Фолиевая кислота	ФС.2.1.0686
Фолиевая кислота
Acidum folicum	Взамен ВФС 42-2479-95

C19H19N7O6 [59-30-3]	М.м. 441,40

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

(2S)-2-(4-{[(2-Амино-4-оксо-1,4-дигидроптеридин-6-ил)метил]амино} бензамидо)пентандиовая кислота.

Содержит не менее 96,0% и не более 102,0% фолиевой кислоты C19H19N7O6 в пересчете на безводное и свободное от остаточных органических растворителей вещество.

СВОЙСТВА

Описание. От желтого до оранжевого цвета кристаллический порошок. <*> На свету неустойчив.

Растворимость. Практически нерастворима в воде и спирте 96%.

<*> Растворима в хлористоводородной кислоты горячем растворе 8,3% и в натрия гидроксида растворе 10%.

---

<*> Приводится для информации.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Проводят определения 1 — 4 или 1 — 3, 5.

1. ИК-спектрометрия (ОФС «Спектрометрия в средней инфракрасной области»). Инфракрасный спектр субстанции по положению полос поглощения должен соответствовать спектру фармакопейного стандартного образца фолиевой кислоты.

2. ВЭЖХ. Время удерживания пика основного вещества на хроматограмме испытуемого раствора должно соответствовать времени удерживания пика фолиевой кислоты на хроматограмме раствора стандартного образца фолиевой кислоты (испытание «Количественное определение»).

3. Спектрофотометрия (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»). Спектр поглощения 0,001% раствора субстанции в 0,1 М растворе натрия гидроксида в области длин волн от 230 до 380 нм должен соответствовать спектру аналогичного раствора фармакопейного стандартного образца фолиевой кислоты и иметь максимумы при длинах волн 256 нм, 283 нм и 365 нм. Отношение оптических плотностей A256/A365 должно составлять от 2,80 до 3,00.

4. Тонкослойная хроматография (ОФС «Тонкослойная хроматография»).

Пластинка. ТСХ пластинка со слоем силикагеля.

Подвижная фаза (ПФ). Аммиака раствор 25% — пропанол — спирт 96% 20:20:60.

Растворитель. Аммиака раствор 25% — метанол 2:9.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 50 мг субстанции, растворяют в растворителе и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.

Раствор стандартного образца фолиевой кислоты. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 12,5 мг фармакопейного стандартного образца фолиевой кислоты, растворяют в растворителе и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.

На линию старта пластинки наносят по 2 мкл испытуемого раствора и раствора стандартного образца фолиевой кислоты. Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе в течение 5 мин, помещают в камеру с ПФ и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт ПФ пройдет около 80 — 90% длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 15 мин и просматривают в УФ-свете при длинах волн 254 нм и 365 нм.

Основная зона адсорбции на хроматограмме испытуемого раствора по положению, интенсивности поглощения при 254 нм, интенсивности флуоресценции при 365 нм и величине должна соответствовать основной зоне адсорбции на хроматограмме раствора стандартного образца фолиевой кислоты.

5. Качественная реакция. Растворяют 10 мг субстанции в 5,0 мл натрия гидроксида растворе 0,1 М, прибавляют 5,0 мл хлористоводородной кислоты раствора 0,1 М и 1 мл калия перманганата раствора 0,1%, нагревают на водяной бане при температуре 80 — 85 °C в течение 3 мин, охлаждают до комнатной температуры, прибавляют по каплям 0,2 мл водорода пероксида раствора разведенного и фильтруют. Фильтрат имеет голубую флуоресценцию в УФ-свете при длине волны 365 нм.

ИСПЫТАНИЯ

Удельное вращение. От +18 до +22 в пересчете на безводное вещество (1% раствор субстанции в натрия гидроксида растворе 0,1 М, ОФС «Оптическое вращение»).

Родственные примеси. Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).

Все растворы используют свежеприготовленными и защищают от света.

Буферный раствор. Растворяют 11,16 г калия дигидрофосфата и 5,50 г дикалия гидрофосфата в 800 мл воды и доводят значение pH фосфорной кислотой, разведенной 10% до 6,4, количественно переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 1000 мл и доводят объем раствора водой до метки.

Подвижная фаза (ПФ). Метанол — буферный раствор 120:880.

Растворитель. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 28,6 г натрия карбоната и доводят объем раствора водой до метки.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 50 мг (точная навеска) субстанции, растворяют в 2,5 мл растворителя и доводят объем раствора ПФ до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 2,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора ПФ до метки.

Раствор стандартного образца фолиевой кислоты. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 50 мг (точная навеска) фармакопейного стандартного образца фолиевой кислоты, растворяют в 2,5 мл растворителя и доводят объем раствора ПФ до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 2,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора ПФ до метки.

Раствор стандартного образца примеси A. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 10 мг фармакопейного стандартного образца примеси A, растворяют в 1 мл растворителя и доводят объем раствора ПФ до метки. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора ПФ до метки.

Раствор стандартного образца примеси D. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 4 мг (точная навеска) фармакопейного стандартного образца примеси D и доводят объем раствора растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора ПФ до метки.

Раствор стандартного образца фолиевой кислоты для идентификации примеси I. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 5 мг фармакопейного стандартного образца фолиевой кислоты для идентификации примеси I, растворяют в 1 мл растворителя и доводят объем раствора ПФ до метки.

Раствор сравнения. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл испытуемого раствора и доводят объем раствора ПФ до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 1,0 мл полученного раствора и доводят объем раствора ПФ до метки.

Раствор для проверки пригодности хроматографической системы. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 5 мг (точная навеска) фармакопейного стандартного образца фолиевой кислоты для проверки пригодности хроматографической системы, содержащего примеси C, E, G и H, растворяют в 1 мл растворителя и доводят объем раствора ПФ до метки.

Примечание

Примесь A (N-(4-аминобензоил)-L-глутаминовая кислота): (2S)-2-(4-аминобензамидо)пентандиовая кислота [4271-30-1].

Примесь B: 2,5,6-триаминопиримидин-4(1H)-он [1004-75-7].

Примесь C (изофолиевая кислота): (2S)-2-(4-{[(2-амино-4-оксо-1,4-дигидроптеридин-7-ил)метил]амино}бензамидо)пентандиовая кислота [47707-78-8].

Примесь D (птероевая кислота): 4-{[(2-амино-4-оксо-1,4-дигидроптеридин-6-ил)метил]амино}бензойная кислота [119-24-4].

Примесь E (6-птеринилфолиевая кислота): (2S)-2-(4-{бис[(2-амино-4-оксо-1,4-дигидроптеридин-6-ил)метил]амино}бензамидо)пентандиовая кислота [1391068-26-0].

Примесь F: 2-амино-7-(хлорметил)птеридин-4(1H)-он [1391194-56-1].

Примесь G: (2S)-2-{4-[(2-амино-7-метил-4-оксо-1,4-дигидроптеридин-6-ил)амино]бензамидо}пентандиовая кислота [2734707-85-6].

Примесь H: (2S)-2-{4-[(4S)-4-(4-{[(2-амино-4-оксо-1,4-дигидроптеридин-6-ил)метил]амино}бензамидо)-4-карбоксибутанамидо]бензамидо}пентандиовая кислота [2366274-27-1].

Примесь I: неизвестная структура.

Хроматографические условия

Колонка	250 x 40 мм, силикагель октилсилильный для хроматографии, 5 мкм;
Скорость потока	0,6 мл/мин;
Детектор	спектрофотометрический, 280 нм;
Объем пробы	5 мкл;
Время хроматографирования	3,3-кратное от времени удерживания основного пика.

Хроматографируют раствор для проверки пригодности хроматографической системы, раствор стандартного образца примеси A, раствор стандартного образца примеси D, раствор стандартного образца фолиевой кислоты для идентификации примеси I, раствор сравнения и испытуемый раствор.

Относительное время удерживания соединений. Фолиевая кислота — 1 (около 8,5 мин); примесь A — около 0,5; примесь C — около 0,9; примесь E — около 1,3; примесь D — около 1,5; примесь I — около 2,15; примесь G — около 2,4; примесь H — около 2,5.

Идентификация примесей. Для идентификации пиков примесей используют относительное время удерживания соединений; хроматограмму раствора стандартного образца примеси A (для идентификации примеси A); хроматограмму раствора стандартного образца примеси D (для идентификации примеси D); хроматограмму, прилагаемую к стандартному образцу фолиевой кислоты для проверки пригодности хроматографической системы и хроматограмму раствора для проверки пригодности хроматографической системы (для идентификации примесей C, E, G и H), хроматограмму, прилагаемую к стандартному образцу фолиевой кислоты для идентификации примеси I и хроматограмму раствора стандартного образца фолиевой кислоты для идентификации примеси I (для идентификации примеси I).

Пригодность хроматографической системы: на хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы:

• разрешение (Rs) между пиками фолиевой кислоты и примеси E должно быть не менее 2,0;
• отношение максимум/минимум (p/v) между высотой пика примеси C и высотой нижней точки линии перегиба между пиками примеси C и фолиевой кислотой относительно базовой линии должно быть не менее 1,5;
• отношение максимум/минимум (p/v) между высотой пика примеси G и высотой нижней точки линии перегиба между пиками примеси G и примеси H относительно базовой линии должно быть не менее 1,5.

Допустимое содержание примесей. На хроматограмме испытуемого раствора:

• площадь пика примеси A не должна превышать площади пика примеси A на хроматограмме раствора стандартного образца примеси A (не более 0,5%);
• площадь пика примеси D не должна более чем в 2 раза превышать площади пика примеси D на хроматограмме раствора стандартного образца примеси D (не более 0,4%);
• площадь пика каждой из примесей C, E и G не должна более чем в 3 раза превышать площади пика фолиевой кислоты на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,3%);
• площадь пика каждой из примесей H и I не должна более чем в 1,5 раза превышать площади пика фолиевой кислоты на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,15%);
• площадь пика любой другой примеси не должна превышать площади пика фолиевой кислоты на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,1%);
• сумма площадей пиков всех примесей (кроме примесей A и D) не должна более чем в 12 раз превышать площади пика фолиевой кислоты на хроматограмме раствора сравнения (не более 1,2%).

Не учитывают пики, площадь которых менее 0,5 площади пика фолиевой кислоты на хроматограмме раствора сравнения (менее 0,05%).

Вода. Не более 8,5% (ОФС «Определение воды», метод 1). Для определения используют 0,15 г (точная навеска) субстанции.

Сульфатная зола. Не более 0,2% (ОФС «Сульфатная зола»). Для определения используют 1 г (точная навеска) субстанции.

Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС «Остаточные органические растворители».

Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Определение проводят методом ВЭЖХ в условиях испытания «Родственные примеси» со следующими изменениями.

Хроматографируют испытуемый раствор и раствор стандартного образца фолиевой кислоты.

Содержание фолиевой кислоты C19H19N7O6 в субстанции в пересчете на безводное и свободное от остаточных органических растворителей вещество в процентах (X) вычисляют по формуле:

X = \frac{S_{1} \cdot a_{0} \cdot P \cdot 2 \cdot 50 \cdot 10 \cdot 100}{S_{0} \cdot a_{1} \cdot 50 \cdot 10 \cdot 2 \cdot (100 - W)} ,

где S1 — площадь пика фолиевой кислоты на хроматограмме испытуемого раствора;

S0 — площадь пика фолиевой кислоты на хроматограмме раствора стандартного образца фолиевой кислоты;

a1 — навеска субстанции, мг;

a0 — навеска фармакопейного стандартного образца фолиевой кислоты, мг;

W — суммарное содержание воды и остаточных органических растворителей в субстанции, %;

P — содержание фолиевой кислоты в фармакопейном стандартном образце фолиевой кислоты, %.

ХРАНЕНИЕ

В герметично укупоренной упаковке, в защищенном от света месте.

---