Методические указания по систематическому ходу анализа биологических сред на содержание пестицидов различной химической природы
(утв. Минздравом СССР 08.06.1987 № 4362-87)
Утверждены Минздравом СССР 8 июня 1987 г. № 4362-87
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО СИСТЕМАТИЧЕСКОМУ ХОДУ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД НА СОДЕРЖАНИЕ ПЕСТИЦИДОВ РАЗЛИЧНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ <*>
<*> Методические указания разработаны Л.Г. Александровой, (КНИИГТиПЗ); В.Ф. Демченко, Клисенко М.А. (ВНИИГИНТОКС).
Методические указания направлены на определение микроколичеств пестицидов различного химического строения (фосфорорганические, хлорорганические; производные карбаминовой, тиокарбаминовой кислоты; производные динитрофенолов, симм-триазина и др.) в биологических средах: кровь, моча, желчь, желудочный сок, слюна, грудное молоко.
Схема анализа биосред позволяет идентифицировать и определить количественно пестициды в одной пробе по методикам, утвержденным Минздравом СССР.
Методические указания могут быть использованы токсикологическими лабораториями санитарно-эпидемиологических станций, профпатологической службой, НИИ при изучении состояния здоровья сельскохозяйственных рабочих, контактирующих с пестицидами, населения, а также в случаях острой и хронической интоксикации пестицидами.
Принцип метода. В основе систематического определения пестицидов в биологическом материале лежит извлечение пестицидов из биологической пробы диэтиловым эфиром, разделение эфирного экстракта на 3 части, в одной из которых определяют фосфорорганические пестициды, в другой — хлорорганические, в третьей — производные карбаминовой, тиокарбаминовой кислоты и динитрофенолы (рис. 17). Из биологической пробы после экстракции диэтиловым эфиром извлекают производное симм-триазина смесью гексан — ацетон, в оставшейся биопробе после извлечения метазина определяют зоокумарин. Для аналитического определения используют методы ГЖХ, ТСХ, ТСХЭ и спектрофотометрический.
| Биологическая проба |
\/
| Высаливание 1%-ным NaCl |
\/
┌─────────────────┐
<pre class="legal-pre"> │ I экстракция ├──────────────┐
│диэтиловым эфиром│ │
└────────┬────────┘ \/
│ ┌────────────┐ ┌─────────────┐
┌──────────────┐ \/ │ Биопроба │ │II экстракция│
│Сухой остаток,│ ┌───────────┐ │ после ├─>│ смесью │
┌──────┤ добавить │<────────────┤ Эфирный │ │I экстракции│ │ гексан - │
│ │ 5 мл гексана │ ┌──┤ экстракт ├──┐ └────────────┘ │ ацетон │
│ └──────────────┘ │ └───────────┘ │ └┬─────┬──────┘
\/ \/ \/ ┌─────┘ \/
┌───────────┐ ___ ___ ┌──────────────┐ ┌─────────────┐ │ ┌─────────────┐
│Определение│ /ТСХ\ /ГЖХ\ │Сухой остаток,│ │ Определение │ │ │ Биопроба │
│ ХОП, ПХБ ├─>\___/ \___/ │ добавить │ │тиокарбаматов│ \/ │ после │
└─────┬─────┘ /\ /\ │ 5 мл ацетона │ └┬──┬───────┬─┘ ┌──────────┐│II экстракции│
\/ │ │ └──────┬───────┘ │ │ │ │Гексановый│└───────┬─────┘
┌───────────┐ │ ┌────┘ \/ \/ │ │ │ экстракт │ │
│ Очистка ├───┘ │ ┌────────┐ ┌──────────────┐ ___ │ │ └──────┬───┘ │
│конц. H SO ├─────┘ │Щелочной│ │ Определение │ /ГЖХ\│ │ │ \/
│ 2 4├──────>│гидролиз│ │ ФОП │ \___/│ \/ \/ ┌───────────┐
└─────┬─────┘ └┬───┬───┘ └─┬────┬────┬──┘ │┌───────────┐ ┌───────────┐ │ Обработка │
│ ┌──────┘ \/ │ │ │ ││Определение│ │Определение│ │ 1 н H SO │
┌─────┴────┐ │ ┌───────────┐ \/ │ \/ ││карбаматов │ │ метазина │ │ 2 4 │
│Окисление │<─┘ │Определение│ ___ │ ___ │└──┬───┬────┘ └─┬─────────┘ └─────┬─────┘
│ хромовым │ │ ХОП, ПХБ │ /ТСХ\ │ /ГЖХ\ \/ │ │ \/ \/
└─────┬────┘ └─┬───────┬─┘ \___/ │ \___/ ___ │ │ ___ ___ ┌───────────┐
│ \/ │ \/ /ТСХ\<┘ │ /ТСХ\ /ГЖХ\ │Экстракция │
│ ___ │ ___ \___/ │ \___/ \___/ │хлороформом│
│ /ГЖХ\ │ /ХЭМ\ /\ │ /\ /\ └┬──────────┘
│ ┌─────>\___/ \/ \___/ │ \/ │ │ │
┌─────┴────┴┐ ___ ┌───┴──────────┐ ┌─┴───────┴─┐ │ ___
│Определение│ /ТСХ\ │ Определение │ │Определение│<─┘ /СФ \
│ ПХБ ├───────────>\___/ │динитрофенолов│ │зоокумарина├───────>\___/
└───────────┘ └──────────────┘ └───────────┘</pre>
Рис. 17. Систематический ход определения пестицидов в биологических средах
Ход анализа. Экстракция. Пробу биологической жидкости (5 мл крови, слюны, желчи, желудочного сока; 25 — 50 мл мочи, грудного молока) смешивают с 1 мл 1-процентного раствора хлорида натрия. К полученному раствору приливают диэтиловый эфир (кровь, слюна, желудочный сок, желчь — по 5 мл, моча и грудное молоко — по 10 мл) и экстрагируют в делительной воронке, осторожно встряхивая, 30 — 40 мин. Экстракт сливают в мерный цилиндр. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют. Измеряют объем объединенного эфирного экстракта и делят на 3 части, каждую из которых анализируют в соответствии со схемой.
К оставшейся биопробе после экстракции диэтиловым эфиром приливают смесь гексан — ацетон 10 мл и оставляют на 1 ч, периодически встряхивая. Гексановый экстракт отделяют, экстракцию повторяют еще дважды. Объединенный гексановый раствор пропускают через безводный сульфат натрия (анализируют метазин).
К биологической пробе после экстракции смесью гексан — ацетон приливают 1 н раствор серной кислоты и перемешивают. Экстрагируют зоокумарин хлороформом.
Определение хлорорганических пестицидов и полихлорированных дифенилов. Экстракт (1/3 часть) упаривают досуха и к сухому остатку приливают 5 мл гексана. В гексановом растворе методом ТСХ можно определить хлорорганические пестициды ДДТ, ДДД, ДДЭ [1] и полихлорпинен, полихлоркамфен в присутствии ДДТ и его продуктов превращения [2, 3].
Если определению ХОП мешают коэкстрактивные вещества, экстракт очищают концентрированной серной кислотой. Таким способом определяют ХОП в крови [3, 4].
В случае если анализируют хлорорганические пестициды в присутствии полихлорированных дифенилов (ПХД), после очистки экстракта концентрированной серной кислотой (контроль очистки осуществляют методами ТСХ и ГЖХ) проводят щелочной гидролиз, после которого в гексановом экстракте определяют ХОП и ПХД методами ГЖХ и ТСХ. Если в этом случае анализ исследуемых соединений затруднен, проводят последующее окисление хромовым ангидридом и после этого анализируют экстракт на наличие ПХД методами ГЖХ и ТСХ [4, 5].
Определение фосфорорганических пестицидов. Эфирный экстракт (1/3 часть) осторожно упаривают досуха и к сухому остатку приливают 5 мл ацетона и анализируют хроматоферментным методом (ХЭМ). Для этого на одну из хроматографических пластинок наносят пробу объемом до 50 мкл и стандартные растворы метафоса и ДДВФ, на другую — пробу и стандартные растворы хлорофоса, на третью — пробу и стандартный раствор метафоса. Хроматографируют в подвижной фазе хлороформ 1-ю и 3-ю пластинку, в подвижной фазе гексан — ацетон (1:1) — 2-ю пластинку. Анализируют по методике без активации 1-ю пластинку (обнаружение диброма, ДДВФ, хлорофоса, циодрина, рицида, фенитрооксона, P-O фталофоса). На 2-й пластинке после активации в парах аммиака можно обнаружить ДДВФ и хлорофос, на 3-й пластинке после активации бромом и УФ-светом обнаруживают афуган, абат, антио, валексон, байтекс, фталофос, цидиал, фенкаптон, фозалон, метафос, метилнитрофос, карбофос, цианокс, фосфамид, корал [6].
После идентификации ТСХЭ можно провести анализ этой же пробы (ацетоновый раствор) методами ТСХ и ГЖХ на содержание фозалона и мильбекса [7], сайфоса [8], базудина, фосфамида [9, 10]. При анализе биологической пробы на содержание трихлорметафоса-3 ацетоновый раствор упаривают досуха, к сухому остатку приливают 1 мл гексана и анализируют методом ГЖХ [11].
Определение производных карбаминовой, тиокарбаминовой кислоты, динитрофенолов. Исследуемый эфирный экстракт анализируют на газовом хроматографе в интервале температур от 140 до 160 °C в режиме программирования на неподвижной фазе ДС-550, или в изотермическом режиме при 140 °C на фазе XE-60, или 160 °C на фазе SE-30 для идентификации тиокарбаминовых пестицидов: вернама, ронита, сутана, тиллама, эптама и ялана. Если определению мешают коэкстрактивные вещества, то эфир осторожно, при комнатной температуре упаривают досуха (тиокарбаминовые пестициды достаточно летучие вещества), приливают 1 мл гексана и далее анализируют гексановый раствор [12]. Ронит и триаллат можно определить методом ТСХ [13, 14].
Аликвотную часть исследуемого раствора наносят на хроматографическую пластинку и определяют производные N-фенилкарбаминовой кислоты — карбин, ИФК, хлор-ИФК [15], бетанал [16], севин [17], дикрезил — в присутствии севина, мезурола и их метаболитов [18].
Аликвотную часть экстракта анализируют на содержание производных динитрофенолов — акрекса, каратана и продуктов превращения акрекса — диносеба методом ТСХ [19].
Характерные реакции: для обнаружения производных карбаминовой кислоты — азосочетание; тиокарбаминовой — N-хлорирование и взаимодействие с о-толидином или взаимодействие с бромфеноловым реагентом; для производных динитрофенолов — реакция с нингидрином.
Определение производного симм-триазина и зоокумарина. К биологической пробе после экстракции диэтиловым эфиром приливают смесь гексан — ацетон (1:1) и трижды экстрагируют производное симм-триазина порциями по 10 мл, оставляя смесь на 1 ч. Гексановый раствор отделяют, объединяют 3 порции и далее анализируют по методике метазина [20].
После отделения гексанового экстракта, содержащего метазин, к оставшейся пробе приливают 1 мл 1 н раствора серной кислоты, содержимое перемешивают, приливают 75 мл хлороформа и далее по методике определяют зоокумарин методами ГЖХ, ТСХ или спектрофотометрическим [21].
Если известны пестициды, объем исследований сужается и используется та часть схемы, в которую они могут входить.
1. Определение ДДТ, ДДЭ, ДДД, альдрина, дильдрина, гептахлора, кельтана, метоксихлора, эфирсульфоната и других ядохимикатов в воде, продуктах питания, кормах и биологических средах хроматографией в тонком слое // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1977. С. 9 — 15.
2. Определение альдрина, гексахлорана, гептахлора, ДДТ, ДДД, ДДЭ в воде, овощах, фруктах и биологическом материале газожидкостной хроматографией // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1977. С. 17 — 20.
3. Определение полихлорпинена и полихлоркамфена в воздухе, воде, почве, картофеле и свекле, мясе, молоке, тканях внутренних органов животных, крови, моче тонкослойной хроматографией // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1977. С. 62 — 69.
4. Методические указания по избирательному газохроматографическому определению хлорорганических пестицидов в биологических средах. № 3151-84 от 27.11.84 (см. с. 19 — 25).
5. Методические указания по определению хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов при их совместном присутствии в объектах внешней среды и биоматериале // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1983. С. 10 — 18.
6. Методические указания по определению фосфорорганических пестицидов в растительных продуктах и биологических субстратах энзимохроматографическим методом. М.: Колос, 1983. С. 122 — 127.
7. Методические указания по определению фозалона и мильбекса в биологическом материале методом газожидкостной хроматографии. М.: Колос, 1983. С. 105 — 106.
8. Определение сейфоса в воде, продуктах питания растительного происхождения, почве, биологическом материале и воздухе тонкослойной хроматографией // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1977. С. 133 — 137.
9. Методические указания по определению диазинона в биологических средах тонкослойной и газожидкостной хроматографией. № 4324-87 от 08.06.87 (см. с. 117 — 122).
10. Методические указания по определению фосфамида в биологических средах методами тонкослойной и газожидкостной хроматографии. № 4323-87 от 08.06.87 (см. с. 117 — 122).
11. Методические указания по определению трихлорметафоса-3 и его метаболитов в биоматериале методом газожидкостной хроматографии // Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. № 2647-82 от 28.12.82 (см. с. 148 — 150).
12. Методические указания по определению гербицидов производных тиокарбаминовой кислоты (вернам, ронит, сутан, тиллам, эптам, ялан) в воде, почве, растительном материале, биосубстратах и воздухе газохроматографическим методом. № 1877-78 от 05.06.78 (см. с. 388 — 393).
13. Определение триаллата в крови, моче, тканях внутренних органов животных тонкослойной хроматографией // Методы определения микроколичеств пестицидов. М.: Колос, 1977. С. 296 — 297.
14. Определение карбина, ИФК и хлор-ИФК в растительном материале и воде хроматографией в тонком слое. М.: Колос, 1977. С. 233 — 235.
15. Методические указания по определению ронита в биологических средах методами тонкослойной и газожидкостной хроматографии. № 4668-88 от 07.07.88 (см. с. 383 — 388).
16. Методические указания по определению бетанала в биологических средах методом хроматографии в тонком слое // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1983. С. 148 — 150.
17. Методические указания по определению севина в биологических субстратах и воде методом тонкослойной хроматографии. М.: Колос, 1983. С. 162 — 163.
18. Определение дикрезила в биологических средах тонкослойной хроматографией // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1977. С. 197 — 199.
19. Определение каратана, акрекса в воздухе, воде, огурцах, яблоках, биологическом материале и диносеба в биологическом материале тонкослойной хроматографией. М.: Колос, 1977. С. 225 — 230.
20. Методические указания по определению метазина в воде, почве, овощах и биологическом материале методом хроматографии в тонком слое сорбента // Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Ч. XI. М.: МСХ СССР, 1981. С. 181 — 187.
21. Методические указания по определению зоокумарина в тканях и крови животных, в приманках и препарата (пенокумарин) хроматографическим и спектрофотометрическими методами // Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос, 1983. С. 227 — 231.