Методические указания по определению диазинона и фосфамида в биологических средах методами тонкослойной и газожидкостной хроматографии

(утв. Минздравом СССР 08.06.1987 № 4323-87, № 4324-87)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ДИАЗИНОНА И ФОСФАМИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ МЕТОДАМИ ТОНКОСЛОЙНОЙ И ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

---

<*> Разработаны Л.Г. Александровой (КНИИГТиПЗ).

Краткая характеристика препаратов диазинон и фосфамид приведена в Унифицированной методике.

Принцип метода. Метод основан на экстракции диазинона и фосфамида из биологических сред органическими растворителями (хлороформ, ацетон), очистке полученных экстрактов и последующем определении методами ТСХ и ГЖХ.

Метод ТСХ предусматривает использование подвижной фазы на основе гексана, проявляющих реагентов — бромфенолового синего, хлорида палладия, 2,6-дибром-N-хлорхинонимина, нитрата серебра.

Метод ГЖХ предусматривает применение ТИД и ДЭЗ, неподвижных фаз SE-30 или XE-60.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 34.

Таблица 34

И ФОСФАМИДА В БИОСРЕДАХ (N = 5 И P = 0,95)

Анализируемый объект	Нижний предел определения, мкг/мл, мкг/г, мкг/кв. см	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, %	Доверительный интервал, %	Метод
Диазинон
Желудочный сок,	0,05	85,4	+/- 3,9	+/- 4,9	ГЖХ
слюна	0,25	78,5	+/- 6,3	+/- 7,8	ТСХ
Желчь	0,05 0,25	87,2 80,0	+/- 4,1 +/- 6,3	+/- 5,1 +/- 7,8	ГЖХ ТСХ
Моча	0,002 0,05	95,3 89,5	+/- 4,7 +/- 6,8	+/- 5,8 +/- 8,5	ГЖХ ТСХ
Кровь	0,05 0,25	90,3 82,4	+/- 3,5 +/- 7,3	+/- 4,3 +/- 9,1	ГЖХ ТСХ
Ткани внутренних	0,02	91,7	+/- 4,7	+/- 5,8	ГЖХ
органов, кожа	0,5	88,5	+/- 7,6	+/- 9,5	ТСХ
Смывы с поверхности	0,002	95,6	+/- 3,7	+/- 4,6	ГЖХ
кожи	0,31	90,0	+/- 8,4	+/- 10,5	ТСХ
Фосфамид
Желудочный сок,	0,02	88,6	+/- 3,85	+/- 4,8	ГЖХ
слюна	0,25	78,6	+/- 6,3	+/- 7,8	ТСХ
Желчь	0,02 0,25	92,0 82,0	+/- 3,4 +/- 7,4	+/- 4,2 +/- 9,2	ГЖХ ТСХ
Кровь	0,02 0,25	95,2 85,2	+/- 2,8 +/- 6,8	+/- 6,0 +/- 8,5	ГЖХ ТСХ
Моча	0,0008 0,01	95,1 89,1	+/- 3,7 +/- 6,7	+/- 4,6 +/- 8,3	ГЖХ ТСХ
Кожа	0,04 0,5	91,1 87,9	+/- 4,5 +/- 7,6	+/- 5,6 +/- 9,4	ГЖХ ТСХ
Ткани внутренних	0,04	90,3	+/- 4,9	+/- 6,1	ГЖХ
органов	0,5	80,3	+/- 7,2	+/- 8,9	ТСХ
Смывы с поверхности	0,006	95,2	+/- 3,5	+/- 4,3	ГЖХ
кожи	0,03	90,0	+/- 7,2	+/- 8,9	ТСХ

Избирательность метода. Определению диазинона и фосфамида не мешают пестициды, которые могут присутствовать в пробе: циклоат, эптам, метоксихлор, линдан.

Реактивы и растворы. Диазинон х.ч. или препаративная форма. Фосфамид х.ч. или 40(38)-процентный к.э. Ацетон х.ч. Гексан ч. Хлороформ х.ч. Натрия цитрат ч. Натрия сульфат безводный ч.д.а. Серебра нитрат х.ч., 0,5-процентный водно-ацетоновый раствор (1:3). Гидроксид натрия х.ч., 20-процентный раствор. Бромфеноловый синий ч.д.а. Кислота лимонная х.ч., 2-процентный раствор. Кислота хлороводородная х.ч., концентрированная и 0,1 н раствор. Хлорид палладия ч. Кальция сульфат безводный х.ч.

Проявляющие реагенты: № 1 — бромфеноловый синий (взвешивают 50 мг бромфенолового синего, растворяют в 10 мл ацетона и далее разбавляют до 100 мл раствором нитрата серебра. Срок хранения в холодильнике 1 мес.); № 2 — хлорид палладия (взвешивают 0,2 г хлорида палладия, вносят в колбу вместимостью 100 мл, приливают 2 капли концентрированной хлороводородной кислоты, помещают колбу в водяную баню при 60 — 70 °C на 10 — 15 мин. Периодически встряхивают до полного растворения содержимого колбы. Доводят объем раствора до 100 мл водой. Срок хранения реактива в холодильнике 1 мес.); № 3 — 2,6-дибром-N-хлорхинонимин х.ч., 0,5-процентный раствор в гексане; № 4 — нитрат серебра (взвешивают 1 г нитрата серебра и растворяют в 99 мл воды. Опрыскивают пластинки проявляющим реагентом № 4 после гидролиза 20-процентным раствором гидроксида натрия. Хранят реактив в холодильнике до 2 недель).

Для определения фосфамида подвижная фаза: хлороформ — ацетон — гексан (3:1:1) или гексан — ацетон (3:2), для определения диазинона — гексан — ацетон (2:1 или 3:1).

Стандартный раствор фосфамида, диазинона с содержанием 100; 10; 2 и 0,2 мкг/мл в гексане или ацетоне для ГЖХ, 100 мкг/мл в хлороформе — для ТСХ. Если стандартный раствор готовят из препаративной формы пестицида, то учитывают содержание действующего вещества, при необходимости фильтруют. Срок хранения стандартных растворов, содержащих 100 мкг/мл, до 1 мес. в холодильнике.

Азот, водород в баллонах с редукторами. Азот особой чистоты (содержание кислорода не более 0,003%).

Насадка хроматографической колонки: при использовании ТИД — хроматон N-AW-DMCS + 5% SE-30 (анализ фосфамида), хроматон N-AW-DMCS + 5% XE-60 (анализ диазинона); при использовании ДЭЗ или ДПР — хроматон N-AW-DMCS + 5% XE-60 (0,16 — 0,20 мм).

Оксид алюминия II степени активности для хроматографии. Сульфат кальция безводный ч.д.а.

Хроматографические пластинки «Силуфол» размером 15 x 15 см. Для приготовления хроматографических пластинок с оксидом алюминия 50 г оксида алюминия, просеянного через сито 100 меш, смешивают с 5 г безводного сульфата кальция и 75 мл воды, встряхивают до образования однородной массы; наносят тонким слоем на 10 стеклянных пластинок размером 9 x 12 см; сушат на воздухе 12 ч; хранят в эксикаторе.

Приборы и посуда. Газовый хроматограф с ТИД, ДЭЗ или ДПР. Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М с набором колб или аналогичный аппарат для отгонки растворителей. Аппарат для встряхивания. Термостат. Колбы мерные, цилиндры. Пипетки, микропипетки. Воронки химические и делительные. Хроматографическая камера. Камера для опрыскивания пластинок. Пульверизатор стеклянный. Баня водяная. Стеклянные капилляры для нанесения проб на хроматографические пластинки. Стеклянные пластинки размером 9 x 12 см. Микрошприц МШ-10. Колонки стеклянные хроматографические длиной 1 м с внутренним диаметром 3 мм. Секундомер. Линейка измерительная. Лупа измерительная.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов. К 2 мл пробы слюны, желчи, желудочного сока приливают 0,5 мл воды, 3 мл хлороформа и осторожно встряхивают на холоде 30 мин. Отделяют органический слой. Экстракцию проводят еще дважды порциями растворителя по 3 мл. Экстракты объединяют, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), фильтруют. Отгоняют растворитель примерно до объема 0,2 — 0,5 мл.

К 50 мл мочи приливают 5 мл воды, 10 мл хлороформа и экстрагируют, осторожно встряхивая в течение 30 мин. Экстракцию проводят трижды порциями хлороформа по 10 — 20 мл. Органический слой отделяют, объединяют и далее поступают так же, как с пробами слюны.

Пробу крови (2 мл) отбирают в пробирку, смоченную 5-процентным раствором цитрата натрия. Приливают 4 мл хлороформа и осторожно встряхивают на холоде 20 мин. Органический слой отделяют, фильтруют, пропускают через безводный сульфат натрия. Экстракцию проводят дважды порциями растворителя по 4 мл. Далее поступают так же, как с пробами слюны.

Пробу кожи, тканей внутренних органов предварительно выдерживают в морозильнике 1 — 2 ч. Пробу массой 1 г тщательно измельчают, растирают в фарфоровой ступке, приливают 4 мл охлажденного ацетона и содержимое переносят в склянку с притертой пробкой. Встряхивают на холоде в течение 30 — 40 мин. Органический слой сливают, фильтруя через безводный сульфат натрия. Экстракцию повторяют еще дважды свежими порциями ацетона. Объединенный экстракт переносят в колбу для отгонки растворителей и отгоняют ацетон примерно до объема 0,2 — 0,5 мл. Остаток раствора подсушивают безводным сульфатом натрия.

Анализ методом ТСХ. Пробу 0,2 — 0,5 мл количественно наносят на хроматографическую пластинку, параллельно на эту же пластинку наносят стандартные растворы пестицида, содержащие 0,5 — 10 мкг. Помещают пластинку в хроматографическую камеру, куда предварительно (за 20 — 30 мин.) наливают подвижную фазу. После поднятия фронта растворителя на высоту 10 — 12 см пластинку извлекают из камеры и дают улетучиться следам растворителя. Затем применяют один из проявляющих реагентов. Если хроматографирование проводят на пластинках «Силуфол», то используют проявляющие реагенты № 1, 2, 3 (диазинон, фосфамид).

Через 15 — 20 мин. после опрыскивания пластинки проявляющим реагентом № 1 ее опрыскивают 5-процентным раствором лимонной кислоты. Пестициды и некоторые метаболиты окрашиваются в синий, темно-голубой, сине-зеленый цвет на светло-желтом фоне пластинки. Если применяют проявляющий реагент № 2, то сразу после опрыскивания фосфамид окрашивается в светло-коричневый цвет, иногда с желтоватым оттенком, а диазинон — в желтый цвет.

После опрыскивания проявляющим реагентом № 3 пластинку следует поместить в сушильный шкаф при 110 — 115 °C на 2 — 3 мин. На светлом фоне пластинки зоны локализации пестицидов и их фосфорорганических аналогов окрашиваются в ярко-красный и рубиново-желтый цвета соответственно, а других метаболитов — в розово-красный цвет.

Величина R фосфамида 0,55 — 0,6; кислородного аналога (P-O) f фосфамида — 0,2 — 0,25. Величина R диазинона — 0,45; его f

метаболитов:  диазоксона  (P-O-диазинона)  -  0,3;  2-изопропил-N-
метил-6-гидроксипиримидина       -       0,1;       2-изопропил-6-

меркаптопиримидина — 0,6; тетраэтилпирофосфата — 0,7.

    Если  хроматографирование  проб, содержащих фосфамид, проводят
на  пластинках  с  оксидом  алюминия  с  использованием в качестве
подвижного   растворителя  хлороформа,  то  применяют  проявляющий
реагент  N  4.  После  улетучивания  следов  хлороформа  пластинку
обрабатывают 20-процентным раствором гидроксида  натрия,  а  после
подсушивания  слоя - проявляющим реагентом N 4. Пластинку помещают
в  сушильный шкаф при 105 °C на 5 мин.; фосфамид и его кислородный
аналог  проявляют  в виде серо-черных пятен. Величина R  фосфамида

                                                   f

0,4; кислородного аналога — 0,1 — 0,15.

Анализ методом ГЖХ. Экстракцию диазинона и фосфамида из биологических проб (желчь, желудочный сок, кровь, моча, кожа, ткани внутренних органов) проводят так же, как для определения методом ТСХ. Полученные экстракты при комнатной температуре упаривают до сухого остатка. К сухому остатку приливают 1 мл гексана или ацетона и аликвотную часть пробы (2 — 5 мкл) вводят в хроматограф (табл. 35).

Таблица 35

УСЛОВИЯ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Характеристики	ТИД	ДЭЗ
Насадка	Хроматон + 5% SE-30 (фосфамид) Хроматон + 5% XE-60 (диазинон)	Хроматон + 5% XE-60
Температура, °C:
колонки	180	180
испарителя	230	220 — 230
детектора	-	190
Расход, мл/мин. азота	20 — 25	40 — 60 (азот особой чистоты)
водорода воздуха	20 200 — 240 -12	- 240 (для ДПР) -12
Чувствительность шкалы электрометра, А	50 x 10	(20...50) x 10
Минимально детектируемое	0,2	0,5 (фосфамид),
количество, нг		2 (диазинон)

Примечание. Режим работы изотермический. Длина колонки 1 м, диаметр 3 мм. Время выхода, мин.: фосфамида 2,1 — 4,8; фосфорорганического аналога фосфамида 1,5 — 5,6; диазинона 1,5 — 2,8; диазоксона — 3,1.

Обработка результатов анализа. Анализ методом ТСХ. С помощью промасленной миллиметровой бумаги измеряют площадь пятен пестицида на хроматограмме пробы и стандартных растворов. Можно построить градуировочный график зависимости площади пятна от концентрации и по графику найти концентрацию фосфамида в хроматографируемой пробе. Для расчета можно использовать формулу. Измеряют площадь того пятна на хроматограмме стандарта, которое по размерам наиболее близко к пятну на хроматограмме пробы.

Анализ методом ГЖХ. Количественную обработку результатов анализа проводят методом абсолютной калибровки. Для этого строят градуировочный график зависимости площади от концентрации, вводя в хроматограф по 2 — 5 мкл стандартных растворов фосфамида и диазинона, содержащих 0,2 — 20 мкг/мл. По градуировочному графику находят концентрацию пестицидов в хроматографируемой пробе. При анализе проб параллельное определение проводят не менее трех раз. Для расчета можно воспользоваться формулой, измерив площадь пика на хроматограмме стандарта, наиболее близкого по размерам к пику на хроматограмме пробы, и полученные величины подставить в формулу.

Расчет количества пестицидов в пробе (X, мкг/г, мкг/мл) проводят по формуле:

                           CS  V
                             пр

X = ------, S V P ст 1

где:

C — количество пестицида на хроматограмме стандарта, мкг;

S — площадь пятна (ТСХ) или пика (ГЖХ) на хроматограмме ст стандарта, кв. мм;

S — площадь пика (ГЖХ) или пятна (ТСХ) на хроматограмме пр пробы, кв. мм;

V — общий объем экстракта пробы, мл;

V — хроматографируемый объем экстракта пробы, мл; 1

P — навеска или объем пробы, г или мл.

Требования безопасности. Необходимо соблюдать правила безопасности при работе в химической лаборатории с ядовитыми веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

---