Методические указания по определению трихлорметафоса-3 и его метаболитов в биологическом материале методом газожидкостной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 28.12.1982 № 2647-82)
28 декабря 1982 г. № 2647-82
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ТРИХЛОРМЕТАФОСА-3 И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
<*> Разработаны С.В. Пиотровским, К.И. Корольковой, Р.А. Чингисовой, Ш.А. Бакановым (Казахский филиал Института питания АМН СССР), М.И. Горяевым (Институт химии АН Казахской ССР).
Краткая характеристика трихлорметафоса-3 (ТХМ-3) приведена в Унифицированной методике. ДСД трихлорметафоса-3 — 0,01 мг/кг. Содержание в продуктах животноводства не допускается. При метаболизме ТХМ-3 в организме теплокровных образуются хлорфенолы различной степени хлорирования (моно-, ди-, трихлорфенолы). Главным метаболитом является 2,4,5-трихлорфенол (2,4,5-ТХФ), который токсичнее ТХМ-3 в 2 — 3 раза. Кроме того, образуются 2,4-дихлорфенол (2,4-ДХФ) и орто-хлорфенол (о-ХФ). Т. пл. 2,4,5-ТХФ 68 °C, т. кип. 246 °C, т. пл. 2,4-ДХФ 45 °C, т. кип. 210 °C, т. пл. о-ХФ 7 °C (альфа) и 0 °C (бета), т. кип. 175,6 °C. 2,4,5-ТХФ и 2,4-ДХФ — белые кристаллические вещества, о-ХФ — жидкость. Хлорфенолы, особенно о-ХФ, обладают неприятным запахом. Хорошо растворимы в спирте, эфире, бензоле, растворимость в воде при 20 °C составляет для 2,4,5-ТХФ до 0,1%, для о-ХФ — до 3%.
Принцип метода. Метод основан на извлечении остатков ТХМ-3 и хлорфенолов из проб биоматериала (печень, почки, головной мозг, мышцы, кровь, кал, моча) смесью органических растворителей — хлористого метилена и гексана (2:1) с добавлением этилового спирта; концентрировании экстракта и последующем определении на газовом хроматографе с ДЭЗ или ДПР. Высокая селективность детектора и малые навески проб позволяют избежать при анализе стадии очистки экстрактов без ухудшения работы колонки в течение длительного времени (около 3000 анализов).
Метрологическая характеристика метода. Нижний предел определения ТХМ-3 0,3 мг/кг, хлорфенолов 0,1 мг/кг, минимально детектируемое количество ТХМ-3 0,2 нг, хлорфенолов 0,1 нг. Среднее значение определения 85,0 +/- 2,8 (при p = 0,95).
Избирательность метода. Определению не мешают другие ХОП и ФОП. На колонке с полиэтиленгликольадипинатом определению ТХМ-3 мешает трихлорметафос. Метод применим для анализа гомогената крови, гомогенатов печени, головного мозга, почек, мышц, а также кала и мочи.
Реактивы и растворы. Хлористый метилен х.ч. н-Гексан х.ч. Натрия сульфат безводный х.ч. или ч.д.а. Твердый носитель для ГЖХ — хезасорб AW или хезасорб W, хроматон N-AW (0,16 — 0,20 мм). Жидкая фаза — SE-30 или XE-60, OV-17, DC-200, ПФМС-4 и другие аналогичные, полиэтиленгликольадипинат (ПЭГА). Газ-носитель — аргон (чистый) или азот особой чистоты. Стекловата. Сахароза. Стандартные растворы ТХМ-3 и хлорфенолов в н-гексане: 10 мг вещества растворяют в мерной колбе на 100 мл в небольшом количестве гексана, раствор доводят до метки, хорошо перемешивают, плотно закрывают и хранят в холодильнике.
Приборы и посуда. Хроматограф с ДЭЗ или ДПР. Гомогенизатор стеклянный или микроизмельчитель тканей. Пипетки на 1; 2 и 10 мл. Колбы мерные на 100 мл. Стакан мерный на 200 или 300 мл. Воронки делительные на 50 или 100 мл. Пробирки химические. Ротационный испаритель ИР-1. Пробирки центрифужные с делениями для приготовления разбавленных стандартных растворов. Колбы круглодонные на 50 мл.
Подготовка к определению. Заполнение и подготовка к анализу газохроматографической колонки. Если отсутствует набивка колонки заводского приготовления, жидкую фазу на сорбент можно нанести самостоятельно. Для этого взвешивают необходимые количества твердого носителя и жидкой фазы. Сорбент (20 г) помещают в круглодонную колбу, заливают 100 мл хлороформа. Жидкую фазу смывают в ту же колбу микроколичеством хлороформа. Растворитель отгоняют под вакуумом при нагревании на водяной бане и непрерывном помешивании. Подготовленный носитель высушивают на фильтровальной бумаге в течение 12 ч и хранят в склянке с притертой пробкой.
Ход анализа. Экстракция и концентрирование экстрактов. Готовят 10-процентный гомогенат ткани (печени, почек, головного мозга, мышц, крови) в 0,25 М растворе сахарозы. Для анализа берут 1 мл гомогената.
Мочу берут в количестве 0,2 — 5 мл, кал 1 — 5 г; 1 мл гомогената, мочу или кал переносят в делительную воронку на 50 или 100 мл, прибавляют 1 мл этилового спирта и экстрагируют 4 мл смеси растворителей — хлористого метилена с гексаном (2:1) трижды, каждый раз отстаивая смесь в течение 10 — 15 мин. Перед экстрагированием твердые кусочки кала разбивают стеклянной палочкой, экстрагирование кала можно проводить непосредственно в пробирке. Экстракты объединяют, сушат в течение 1 ч безводным сульфатом натрия. Экстракты сливают в чистые пробирки, а отработанный сульфат натрия три раза ополаскивают свежими порциями растворителя по 3 — 5 мл и присоединяют растворитель к основному экстракту.
Экстракт упаривают при комнатной температуре досуха, на что уходит обычно 3 — 4 дня, или отгоняют на ротационном испарителе. Остаток в колбе смывают 1 мл гексана в пробирку. При естественном упаривании к сухому остатку в пробирке прибавляют 1 мл гексана, обмывая стенки пробирки, и количественно определяют на хроматографе.
Условия хроматографирования. Хроматограф "Цвет-106" или любой другой с ДЭЗ или ДПР. Колонка стеклянная длиной 1 м с внутренним
диаметром 3 мм. Наполнение колонки: хроматон N-AW (0,16 — 0,20 мм)
- 5% SE-30. Температура колонки 180 °C, испарителя — 210 °C. Расход газа-носителя через колонку 35 мл/мин., скорость потока -12
продувочного газа - 150 мл/мин. Шкала электрометра 20 x 10 А. Скорость протяжки ленты 600 мм/ч. Объем вводимой пробы 1 мкл. Время удерживания: ТХМ-3 - 3 мин. 39 с, 2,4,5-ТХФ - 1 мин. 12 с,
2,4-ДХФ — 34 с, о-ХФ — 20 с.
При использовании колонки с ПЭГА применяют ДЭЗ или ДПР. Колонка стеклянная длиной 1 м с внутренним диаметром 3 мм, наполненная хроматоном N-AW (0,16 - 0,20 мм) с 10% ПЭГА. Температура колонки 190 °C, испарителя и детектора - 220 °C. Расход газа-носителя (аргона) через колонку 43 мл/мин. Шкала
-12
электрометра 20 x 10 А. Скорость протяжки ленты 600 мм/ч. Объем вводимой пробы 1 мкл.
Время удерживания на колонке с ПЭГА в этих условиях составляет: ТХМ-3 — 9 мин. 12 с, 2,4,5-ТХФ — 3 мин. 25 с, 2,4-ДХФ — 1 мин. 25 с, о-ХФ — 42 с.
Идентификация ТХМ-3 и хлорфенолов. Идентификацию проводят по времени выхода веществ в сравнении со стандартными растворами или путем добавок метчиков к экстрактам проб и повторного хроматографирования. Для повышения надежности идентификации используют колонку с фазой противоположной полярности, например с ПЭГА. Такая колонка особенно полезна для подтверждения идентификации хлорфенолов, имеющих на колонке с SE-30 короткое время выхода, особенно о-ХФ.
Обработка результатов анализа. Количественную обработку результатов проводят методом абсолютной калибровки по заранее построенным градуировочным графикам. Для этого вводят в хроматограф по 1 мкл стандартных растворов ТХМ-3 и хлорфенолов в гексане, содержащих 0,5; 1; 5 и 10 мкг/мл (каждого 3 — 5 раз) или 1; 2; 3; 5 и 10 мкл растворов определенной концентрации. По полученным данным строят график зависимости высот (или площадей) пиков от количества введенного пестицида.
Во время проведения анализов калибровку проверяют 1 — 2 раза в день. Измерив высоту пика (или площадь) определяемого вещества, по графику находят количество его в пробе. Расчет количества пестицидов в пробе (X, мг/кг или мг/л) проводят по формуле:
CVV
1
C — количество пестицида, найденное по калибровочному графику, нг;
V — объем экстракта, из которого отбирают аликвоту для дозирования в хроматограф, мл;
V — объем аликвоты, вводимой в хроматограф, мкл; 0
P — навеска пробы, г (для мочи мл);
V — общий объем гомогената, мл; 1
V — объем гомогената, взятый для анализа, мл. 2
При анализе мочи и кала выражение V / V в расчетах не 1 2
используется.
Требования безопасности. Соблюдают правила безопасности, обычно рекомендуемые для химических лабораторий при работе с легковоспламеняющимися жидкостями, горючими и огнеопасными веществами, а также сосудами высокого давления (сжатыми газами).