ОСТ 9388-022-00008064-2000. Стандарт отрасли. Методы лабораторной диагностики нематодозов свиней

(утв. Минсельхозом РФ 08.08.2000)

Утвержден Департаментом ветеринарии Минсельхоза Российской Федерации 8 августа 2000 года

СТАНДАРТ ОТРАСЛИ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ НЕМАТОДОЗОВ СВИНЕЙ

ОСТ 9388-022-00008064-2000

Дата введения 2000 год

Предисловие

1. РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом гельминтологии им. К.И. Скрябина (исполнитель Р.Т. Сафиуллин)

2. ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Департаментом ветеринарии Минсельхоза Российской Федерации 2000 года.

3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

ВВЕДЕНИЕ

Настоящий стандарт разработан в связи с изменением требований Госстандарта России к нормативным документам и необходимостью унификации применяемых в ветеринарной практике методов исследований для повышения их информативности и достоверности получаемых в разных условиях результатов.

Целесообразность разработки стандарта отрасли обусловлена также требованиями обязательной стандартизации методов лабораторной диагностики паразитозов животных и в частности нематодозов свиней.

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящий стандарт распространяется на методы лабораторной диагностики нематодозов свиней, предназначенный для ветеринарных лабораторий, научно-исследовательских и учебных ветеринарных учреждений.

1.1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

Диагностические обследования свиней проводят в порядке плановых мероприятий в рациональные сроки или вынужденно, для определения благополучия стада, фермы, хозяйства, а также с целью контроля проведения оздоровительной работы.

1.1. Для проведения диагностических исследований отбирают пробы фекалий от животных, пробы патологического материала, соскобы объектов внешней среды, а также пробы промежуточных и дополнительных хозяев нематод.

1.2 Пробы фекалий берут от живых и павших животных.

1.2.1. От живых животных пробы фекалий (3 г) берут из прямой кишки животного или только что выделившиеся испражнения. В последнем случае берут верхнюю часть фекалий, не соприкасающуюся с полом или почвой. Чтобы не занести яйца или личинок гельминтов из фекалий инвазированного животного, руку после взятия пробы тщательно моют.

Пробы берут от 10% поголовья группы, но не менее чем от 30 животных каждой возрастной группы. От основных свиноматок и хряков-производителей пробы берут от каждого животного.

1.2.2. От павших животных фекалии берут из прямой кишки в количестве, указанном в п. 1.2.1.

1.2.3. Отобранные пробы фекалий упаковывают в полиэтиленовый пакет или пергаментную бумагу, на краю которых ставят номер пробы, или в хорошо закрывающийся сосуд.

В лабораторию доставляют пробы не более суточной давности со времени взятия. До проведения исследований пробы хранят в холодильнике при температуре 2 — 4 °C для задержки развития личинок нематод, а для консервирования добавляют 2,5%-ный раствор бихромата калия.

1.3. Пробы патологического материала отбирают при вскрытии павших или вынужденно убитых животных.

При отборе проб необходимо учитывать характерные патологоанатомические изменения и брать части кишечника, паренхиматозных органов, которые консервируют бихроматом калия. Для гистологических исследований пробы хранят в 10%-ном растворе формальдегида.

1.4. Для определения загрязненности объектов внешней среды яйцами и личинками нематод необходимо брать из разных мест от 3 до 10 соскобов (по 3 г) с пола станков, проходов, стен станков, кормушек и смывы с предметов ухода за животными (скребки, метла). Отобранные соскобы объектов внешней среды упаковывают для отправления в лабораторию как указано в п. 1.2.3.

1.5. Для определения зараженности промежуточных и дополнительных хозяев личинками нематод необходимо в летние месяцы в местностях, неблагополучных по метастронгилезу и аскаридатозам из разных мест отобрать 10 — 20 экз. дождевых червей (олигохет). Отобранные пробы помещают в пробирки, закрывают пробками и доставляют в лабораторию в день отбора.

1.6 Отправляемым в лабораторию отобранным пробам прилагают сопроводительный документ, в котором указывают:

хозяйство (отделение, ферму, цех, участок);

количество животных в отделении, цехе, участке;

систему содержания;

возраст и пол животного;

категорию упитанности;

заболеваемость и смертность;

продолжительность заболевания;

на какой гельминтоз исследовать;

дату отбора проб и отправления для исследования.

При индивидуальном обследовании основных свиноматок и хрякопроизводителей номера или клички их на упаковке и в описи должны строго соответствовать.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Методы определения наличия яиц нематод в фекалиях

Метод основан на определении с помощью микроскопа наличия яиц нематод аскарисов, трихоцефал, эзофагостом, стронгилоид и метастронгил, всплывающих на поверхность флотационного раствора с исследуемым материалом.

2.1.1 Аппаратура, посуда, материалы и реактивы

2.1.1.1 При проведении исследования используют:

микроскоп с окулярным микрометром марки МБИ-3 по ГОСТ 8284-78 или других марок;

центрифугу лабораторную с пробирками ТУ 10-23-07-99 или других марок с частотой вращения 2000 об/мин;

весы лабораторные по ГОСТ 24104-80;

набор ареометров АОН-1 по ГОСТ 18481-81;

сита с ячейками размером 0,5 — 1 мм2;

стаканы пластмассовые вместимостью 30 см3 по ГОСТ;

стаканы стеклянные вместимостью 50 — 150 см3 по ГОСТ 10394-75;

чашки стеклянные лабораторные по ГОСТ 10973-75;

стекла предметные по ГОСТ 9284-75;

стекла покровные по ГОСТ 6672-75;

пипетки градуированные вместимостью 50 см3 по ГОСТ 20292-75;

посуду лабораторную фарфоровую по ГОСТ 91-9147-73;

воронки стеклянные по ГОСТ 8613-75;

вату гигроскопическую медицинскую по ГОСТ 5556-81;

марлю медицинскую по ГОСТ 9412-93;

перчатки хирургические резиновые по ГОСТ 3-88;

штатив для пробирок;

петли металлические с диаметром 8 — 9 мм;

кюветы;

спиртовки СЛ-1 по ГОСТ 25336-82;

пипетки глазные;

натрий хлористый по ГОСТ 4333-77;

нитрат аммония (гранулированный или обычный) по ГОСТ 14702-79;

магний сернокислый по ГОСТ 4523-77;

глицерин по ГОСТ 6259-75;

формалин технический по ГОСТ 1625-75;

формальдегид по ГОСТ 1625-89

2.1.2 Подготовка к исследованию

2.1.2.1 Приготовление флотационных растворов.

По методу Фюллеборна в качестве флотационной жидкости применяют насыщенный раствор натрия хлористого, который добавляют из расчета 420 г на 1 л кипящей дистиллированной воды. Раствору дают остыть, затем фильтруют через воронку с ватой или двухслойной марли в чистую склянку. Плотность определяют с помощью ареометров и она должна быть 1,18 — 1,19 г/см3.

По методу Котельникова-Хренова в качестве флотационной жидкости используют насыщенный раствор аммиачной селитры (гранулированной или обычной), приготовленный путем добавления 1500 г селитры на 1 л кипящей дистиллированной воды. После остывания раствор фильтруют в чистую посуду, а его плотность должна быть 1,28 — 1,29 г/см3.

При использовании комбинированного флотационного раствора применяют смесь натрия хлористого и нитрата аммония, которые добавляют на 1 л кипящей дистиллированной воды в количестве 250 и 550 г соответственно. Остывший раствор фильтруют в чистую посуду, проверяют плотность, которая должна быть 1,27 — 1,28 г/см3.

По методу Щербовича в качестве флотационной жидкости используют раствор магния сульфата, который добавляют на 1 л дистиллированной воды в количестве 920 г. Плотность приготовленного раствора после остывания должна быть 1,28 — 1,29 г/см3.

2.1.3 Проведение исследования

Из доставленных в лабораторию проб фекалий для исследования стандартизированным методом овоскопии отбирают пробы массой 1 г. Вначале для отбора проб необходимо взвесить их, чтобы натренироваться в определении массы по величине пробы, а в дальнейшем можно использовать стандартный объем.

2.1.3.1. При исследовании по методу Фюллеборна пробу массой 1 г заливают в ступке 3 — 5 см3 насыщенного раствора натрия хлористого, тщательно размешивают пестиком или стеклянной палочкой и по мере размешивания добавляют раствор, доводя объем до 15 см3.

Затем процеживают через сито в чистый стакан и отстаивают в течение 40 мин. За время флотации яйца нематод, удельный вес которых меньше веса насыщенного раствора натрия хлористого, всплывают на поверхность и концентрируются на поверхностной пленке. В дальнейшем, прикосновением металлической петли к разным местам поверхностной взвеси снимают три капли раствора и наносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом. Для недопущения быстрого высыхания и кристаллизации капель на предметных стеклах, к ним необходимо добавлять по небольшой капле 50%-ного водного раствора глицерина. Накрывать исследуемую каплю при массовых исследованиях покровным стеклом необязательно, как и не обжигать петлю после каждого переноса раствора на предметное стекло, достаточно лишь промыть ее несколькими резкими движениями в стаканчике с водой, но в начале и конце исследования следует обжигать над пламенем спиртовки.

При определении наличия яиц нематод под микроскопом пользуются соответствующим атласом яиц гельминтов.

Данный метод в лабораторной практике применяется для диагностики аскариоза, эзофагостомоза и стронгилоидоза свиней.

2.1.3.2. По методу Котельникова-Хренова техника выполнения такая же, что и предыдущего метода (флотация по методу Фюллеборна), но отличается временем отстаивания после фильтрования жидкости и оно составляет 10 — 15 мин.

Применяют для выявления возбудителей аскариоза, трихоцефалеза, эзофагостомоза, стронгилоидоза и метастронгилеза свиней.

2.1.3.3. При использовании комбинированного флотационного раствора натрия хлористого и нитрата аммония техника выполнения исследования схожа с предыдущими методами (Фюллеборна, Котельникова-Хренова), но отличается временем отстаивания. При использовании данного метода профильтрованную взвесь оставляют для флотации на 10 — 15 мин.

Используют для диагностики возбудителей аскариоза, эзофагостомоза, трихоцефалеза и стронгилоидоза.

2.1.3.4. При исследовании по методу Щербовича пробу массой 1 г заливают в ступке 5 см3 воды, тщательно размешивают, добавляя воду до 15 см3. Затем полученную взвесь процеживают через сито в стакан и отстаивают в течение 5 мин. После отстаивания верхний слой жидкости сливают, а на дне оставляют осадок с водой и переносят в центрифужную пробирку. Наполненные до одинакового уровня пробирки центрифугируют с частотой вращения 2000 об/мин в течение 2 мин. После чего жидкость из пробирок сливают, а к осадку добавляют 10 см3 флотационного раствора магния сульфата, тщательно перемешивают до получения взвеси и опять центрифугируют в течение 2 мин. Затем металлической петлей снимают из каждой пробирки по три капли поверхностной взвеси, переносят на предметное стекло и препарат исследуют под микроскопом.

Метод наиболее эффективен для диагностики метастронгилеза и трихоцефалеза. С успехом можно использовать и для диагностики других нематодозов свиней.

2.2. Метод определения количества яиц нематод в фекалиях

2.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы

2.2.1.1. При проведении исследования применяют аппаратуру, материалы и реактивы, отмеченные в п. 2.1.1, и дополнительно одну из счетных камер: Горяева, или ВИГИСа.

2.2.2 Проведение исследования

2.2.2.1. Взвешивают 1 г фекалий и размешивают в ступке с 15 см3 воды и тщательно гомогенизируют. Полученную суспензию фильтруют через сито, 10 см3 фильтрата помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют с частотой вращения 2000 об/мин в течение 2 мин. Затем жидкость из пробирки сливают, а к осадку добавляют 10 см3 флотационного раствора, тщательно перемешивают и используют для заполнения счетной камеры Горяева. При отсутствии счетной камеры допускается использование предметного стекла, на которое наносят 0,15 см3 суспензии и накрывают покровным стеклом. В дальнейшем заполненную камеру или предметное стекло с 0,15 см3 суспензии выдерживают в течение 2 мин, чтобы яйца нематод могли подняться к поверхности, и под микроскопом подсчитывают количество яиц нематод. Полученное число, умноженное на 100, будет показывать содержание яиц нематод в 1 г фекалий. Допускается, для более точного определения количества яиц, использование нескольких камер (2 — 3).

2.2.1.1. При использовании счетной камеры ВИГИСа 1 г фекалий размешивают в ступке с небольшим количеством флотационного раствора аммиачной селитры (5 см3) и тщательно перемешивают пестиком. По мере размешивания добавляют раствор и доводят до объема 15 см3. Взвесь фильтруют через ситечко в чистый стакан с последующим отжимом содержимого в ситечко и тщательным размешиванием взвеси. Затем пастеровской пипеткой быстро переносят 0,5 см3 взвеси в одну из ячеек счетной камеры и оставляют на 2 мин, после чего подсчитывают количество яиц нематод. При необходимости заполняют и другие ячейки взвесью пробы из того же стаканчика, но при этом каждый раз перед заполнением ячейки смесь перемешивают.

Подсчет яиц нематод в ячейке проводят с помощью микроскопа МБИ при увеличении 7 x 8, МБС — 8 x 4 и лучше при искусственном освещении. Для установления количества яиц в 1 г фекалий делают расчет по числу обнаруженных яиц в одной, или двух или же во всех четырех ячейках. Для подсчета яиц в 1 г фекалий необходимо число яиц, выявленных в ячейке, умножить на 30, в двух ячейках — на 15, а в четырех — на 7,5.

2.2.3 Обработка результатов

2.2.3.1. У домашней свиньи обнаружение единичных яиц нематод до (100 яиц) в 1 г фекалий свидетельствует о субклиническом течении гельминтозов и об их постоянном выделении в окружающую среду.

Наличие 101 — 500 яиц нематод в 1 г фекалий свидетельствует:

для аскариоза поросят — о заражении низкой степени, а для взрослых свиней — о заражении средней степени;

для трихоцефалеза, стронгилоидоза и метастронгилеза — о заражении средней степени;

для эзофагостомоза поросят — о заражении средней степени, а для взрослых свиней о низкой степени инвазии.

Наличие 501 — 1000 яиц нематод в 1 г фекалий свидетельствует:

для аскариоза поросят — о заражении средней степени, а для взрослых свиней — признак сильного заражения;

для трихоцефалеза, стронгилоидоза и метастронгилеза — о сильном заражении;

для эзофагостомоза молодняка свиней — о сильном заражении, а для взрослых свиней — о средней степени инвазии.

Наличие 1001 — 2000 яиц нематод в 1 г фекалии свиней свидетельствует:

для аскариоза поросят и эзофагостомоза взрослых свиней — признак сильного заражения, а для других нематодозов — признак очень сильного заражения.

Наличие 2001 — 4000 и более яиц нематод в 1 г фекалий свидетельствует:

для аскариоза поросят и эзофагостомоза взрослых свиней — признак очень сильного заражения.

2.3. Метод определения мигрирующих личинок аскарисов из легких и печени

Метод основан на выявлении мигрирующих личинок аскарисов из печени и легких вынужденно убитых или павших поросят аппаратом Бермана с последующим просмотром под микроскопом.

2.3.1 Аппаратура и материалы

2.3.1.1 Для проведения исследования применяют:

ножницы по ГОСТ 21239-77;

пинцеты по ГОСТ 21241-77;

чашки лабораторные стеклянные по ГОСТ 10973-75;

марлю медицинскую по ГОСТ 9412-93;

стекла предметные по ГОСТ 9224-75;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72;

аппарат Бермана.

2.3.2 Проведение исследования

2.3.2.1. Легкие и печень поросят разрезают на мелкие кусочки, завертывают в марлевые салфетки и закладывают в аппарат Бермана по отдельности. Заливают водой температурой 38 — 40 °C и отстаивают в течение 3 — 6 часов. После чего из пробирок надосадочную жидкость сливают, а осадок исследуют под микроскопом с целью обнаружения личинок аскарисов.

2.3.3 Обработка результатов

2.3.3.1. При обнаружении единичных личинок аскарисов (до 10) заболевание миграционной стадией аскариоза рассматривается как вторичный фактор, который не играет главную роль в падеже поросят. При обнаружении 10 и более личинок аскарисов в легких и печени и исключении других инфекционных заболеваний, аскариоз, вызванный миграционной стадией инвазии, считают причиной падежа поросят.

2.4. Метод исследования павших животных

Сущность метода заключается в установлении характерных патологоанатомических изменений и самих нематод в органах свиней при патологоанатомическом вскрытии животных. При этом у животных исследуют паренхиматозные органы и желудочно-кишечный тракт, обращая внимание на характер изменений, локализацию, количество и размер нематод.

2.4.1 Аппаратура, материалы и реактивы

2.4.1.1 Для проведения исследования применяют:

ножницы по ГОСТ 21239-77;

пинцеты по ГОСТ 21241-77;

чашки лабораторные стеклянные по ГОСТ 10973-75;

пипетки глазные;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72;

лупу бинокулярную или микроскоп.

2.4.2 Проведение исследования

2.4.2.1. АСКАРИОЗ. При разрезе слизистая тонкого отдела кишечника воспалена. Аскарисов обнаруживают в тонком отделе кишечника, иногда в протоках печени и поджелудочной железы. В случае большого скопления аскарисов обнаруживают закупорку или разрыв кишечника, протоков печени и поджелудочной железы. Аскарисы — крупные нематоды белого цвета, длиной 10 — 50 см. В легких и печени находят точечные и пятнистые кровоизлияния, в легких отмечают пневмонию, а печень покрыта множественными беловатыми очагами величиной 1 — 5 мм и на разрезе полнокровная.

ТРИХОЦЕФАЛЕЗ. При продольном разрезе толстого отдела кишечника у поросят отмечают катарально-дистрофический колит, проктит. Иногда наблюдают дистрофию паренхиматозных органов, отек легких и катаральный лимфаденит. Трихоцефалы — белого цвета, длиной 20 — 53 мм, имеют тонкий длинный головной конец, задний конец тела толстый и короткий. Трихоцефал находят в просвете толстого отдела кишечника, чаще в слепой кишке, внедрившихся головным концом в слизистую оболочку кишок.

ЭЗОФАГОСТОМОЗ. На слизистой слепой и ободочной кишок характерно появление мелких, плотных на ощупь узелков величиной 0,2 — 0,5 мм с желтоватым пятнышком в центре. Слизистая в этих местах утолщена, гиперемирована. Нередко узелки наполнены зеленовато-серой гнойной массой. В поздние сроки на месте узелков остается рубцовая ткань в виде белых плотных пятнышек. Кроме того, наблюдают отек кишечной стенки, отложения густого вязкого экссудата или гнойно-некротических масс. Взрослые эзофагостомы — серо-белого цвета, длиной 7 — 14 мм. Взрослых особей при вскрытии находят в просвете толстого отдела кишечника, а эзофагостомозные узелки на слизистой оболочке.

СТРОНГИЛОИДОЗ. Трупы павших поросят ниже средней упитанности или истощены. Кожа складчатая, местами уплотнена, гиперемирована, нередко экзематозна и пронизана кровоизлияниями. Легкие в период миграции личинок несколько увеличены, полнокровны. Местами отмечают лобулярные пневматические очаги, катаральный бронхит. В кишечнике острое катаральное воспаление, пятнистые кровоизлияния, эрозии и язвы. Брыжеечные лимфоузлы набухшие, покрасневшие, иногда с точечными кровоизлияниями. В печени и почках при остром течении нередко зернистая дистрофия. Стронгилоиды — мелкие нематоды, серо-белого цвета, длиной 2,1 — 6 мм. Половозрелых стронгилоид находят в просвете тонкого отдела кишечника.

МЕТАСТРОНГИЛЕЗ. Легкие увеличены, отмечают бронхит, альвеолярную эмфизему, ателектазы, фокусы, характерные для пневмонии. При вскрытии бронхов метастронгил часто находят в задних и средних долях легких. Слизистая оболочка бронхов набухшая и покрасневшая. Отмечают узелковые поражения легких величиной до конопляного зерна серого цвета и плотной консистенции. Взрослые метастронгилы белого цвета, длиной до 5 см.

Обнаруженных при вскрытии нематод собирают с помощью пинцета в чашки Петри, промывают физиологическим раствором, подсчитывают и идентифицируют, используя соответствующий определитель.

2.4.3 Обработка результатов

2.4.3.1. При обнаружении единичных нематод заболевание аскариозом, эзофагостомозом, трихоцефалезом, стронгилоидозом и метастронгилезом рассматривается как вторичный фактор, который не играет основную роль в падеже животных. При установлении большого количества отмеченных нематод (10 и более) и исключении других инфекционных заболеваний эти гельминтозы считают причиной падежа животных.

2.5. Метод исследования соскобов из объектов внешней среды на наличие яиц нематод

Сущность метода заключается в обнаружении и подсчете количества яиц нематод в 1 г обследуемой пробы, определении степени загрязнения объектов внешней среды инвазионными элементами и тяжести течения гельминтоза.

2.5.1 Аппаратура, материалы и реактивы

2.5.1.1. При проведении исследования используют аппаратуру, материалы и реактивы, указанные в п. 2.1.1, и дополнительно одну из счетных камер: Горяева, или ВИГИСа;

гомогенизатор электрический.

2.5.2 Проведение исследования

2.5.2.1. Взятую для исследования пробу (соскоб) тщательно перемешивают и взвешивают 3 г пробы с погрешностью не более 0,02 г. Затем перекладывают в стакан с 30 см3 воды, ставят в холодильник, выдерживают в течение 12 ч и гомогенизируют 2 мин в электрическом гомогенизаторе с частотой вращения 2000 об/мин. Полученную суспензию фильтруют в течение 5 мин. После чего жидкую часть сливают, к осадку добавляют 10 см3 флотационного раствора и тщательно перемешивают путем встряхивания. После чего готовой взвесью наполняют счетную камеру или помещают 0,15 см3 суспензии на предметное стекло, накрывают ее покровным стеклом, выдерживают в течение 2 мин и подсчитывают количество яиц нематод. Полученное число умножают на коэффициент 67, что представляет собой количество яиц нематод в 1 г обследуемого соскоба.

2.5.3 Обработка результатов

2.5.3.1. При определении видов нематод под микроскопом пользуются соответствующим атласом яиц гельминтов.

При установлении до 500 яиц нематод в 1 г обследуемого соскоба отмечают низкую загрязненность объектов внешней среды, что свидетельствует о низкой и средней зараженности свиней аскарисами, эзофагостомами, трихоцефалами, стронгилоидами и метастронгилами.

Наличие до 1000 яиц нематод в 1 г соскоба свидетельствует о средней загрязненности объектов внешней среды и о средней и высокой инвазированности свиней отмеченными нематодами.

Обнаружение свыше 1000 яиц нематод в 1 г соскоба показывает высокую загрязненность объектов внешней среды инвазионными элементами, достаточно высокую инвазированность свиней нематодами и недостаточную эффективность противогельминтозных мероприятий.

2.6. Метод установления интенсивности инвазии

2.6.1 Проведение исследования

2.6.1.1. Интенсивность инвазии яйцами нематод у свиней устанавливают подсчетом их количества в трех каплях обследуемой стандартной пробы (1 г) при микроскопии и делением полученного числа на 3.

2.6.2 Обработка результатов

2.6.2.1. Подсчитанное число яиц нематод свиней делят на 3. Полученное число будет показывать ориентировочную интенсивность нематодозной инвазии в 1 капле исследуемой пробы. Исходя из отмеченного, для нематод свиней устанавливают следующую ориентировочную интенсивность инвазии:

для аскариоза и эзофагостомоза:

низкая инвазия — 1 - 10 яиц (+);

средняя инвазия — 11 — 30 яиц (++);

высокая инвазия — 31 — 100 яиц (+++);

очень высокая инвазия — свыше 100 яиц (++++);

для трихоцефалеза, стронгилоидоза и метастронгилеза:

низкая инвазия — 1 - 10 яиц (+);

средняя инвазия — 11 — 20 яиц (++);

высокая инвазия — 21 — 30 яиц (+++);

очень высокая инвазия — 31 — 100 и выше яиц (++++).

При установлении интенсивности инвазии необходимо учитывать одновременное присутствие разных видов нематод и паразитических простейших.

2.7. Метод исследования почвы на наличие яиц нематод

Сущность метода заключается в выявлении степени загрязнения яйцами нематод почвы на разном удалении от животноводческих помещений, на пастбище и других местах с поверхности и различной глубине.

2.7.1 Аппаратура, материалы и реактивы

2.7.1.1. Для проведения исследования используют аппаратуру, материалы и реактивы, указанные в п. 2.1.1, и дополнительно:

шпатель или лопаточку; электромешалку;

центрифугу с пробирками;

формалин технический по ГОСТ 1625-75;

натрий азотнокислый по ГОСТ 4168-79;

натрий едкий по ГОСТ 4328-77;

калий едкий по ГОСТ 24363-80.

2.7.2 Подготовка к исследованию

Пробы с поверхности почвы (с глубины 1 — 3 см) берут из затененных и освещенных солнцем участков шпателем, а с глубины до 20 см — лопаточкой или буром. С каждого обследуемого участка берут одновременно несколько проб (3 — 5) по 10 — 20 г каждая по диагонали. Взятые пробы помещают в банки с крышкой или целлофановые пакеты. Каждая проба должна иметь этикетку с указанием места отбора, даты, глубины, характера исследуемого участка (в тени или под солнцем, состав почвы, наличие растительности и другие). В лаборатории пробы помещают в холодильник или каждую из них пересыпают в кристаллизатор, заливают 3%-ным раствором формалина на изотоническом растворе натрия хлорида (жидкость Барбагалло). В холодильнике почву можно хранить не более месяца, время от времени аэрируя и увлажняя ее.

2.7.3 Проведение исследования

При исследовании по методам Романенко и Гуджабидзе пробы почвы 25 г помещают в центрифужные пробирки на 80 — 100 см3 и заливают 3%-ным раствором едкого натрия или калия в соотношении 1:1. Содержимое пробирок тщательно размешивают при помощи электромешалки или стеклянных палочек, отстаивают в течение 20 — 30 мин, затем центрифугируют 5 мин при 800 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а почву промывают водой от 1 до 5 раз в зависимости от типа почвы (для песчаных и супесчаных почв достаточно одной промывки, а для глинистых, суглинистых, черноземных — от 2 до 5 раз) до получения прозрачной надосадочной жидкости. После промывки к почве добавляют 45 см3 насыщенного раствора натрия нитрата, тщательно размешивают и центрифугируют 3 мин. При отсутствии натрия нитрата можно использовать раствор магния сульфата. После центрифугирования пробирки со смесью ставят в штатив и осторожно доливают раствор натрия нитрата до образования выпуклого мениска, а затем покрывают предметными стеклами размером 10 x 6 см, предварительно обезжиренными смесью спирта с эфиром (в соотношении 1:2) или прокипяченными в воде со щелочью или с одним из имеющихся стиральных порошков. Смесь в пробирках отстаивают 30 мин. Во время отстаивания яйца нематод всплывают на поверхность и прилипают к стеклу. Затем стекла снимают, а на их место ставят чистые. На снятые стекла наносят несколько капель 50%-ного водного раствора глицерина, капли накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Затем просматривают вторые стекла.

2.7.4 Обработка результатов

Для обнаружения яиц нематод предметные стекла просматривают при увеличении 80 раз (окуляр 10 x объектив 8), а для определения степени развития, жизнеспособности и степени деформации — при увеличении в 400 раз (10 x 40). Подсчитанное в двух предметных стеклах количество яиц нематод по видам дает характеристику степени загрязнения или обсемененности разных проб почвы яйцами нематод свиней.

2.8. Метод исследования промежуточных и дополнительных хозяев нематод на зараженность

Сущность метода заключается в выявлении и определении с помощью микроскопа или бинокулярной лупы инвазированных личинок метастронгил и аскарид у дождевых червей, которые являются соответственно промежуточными хозяевами метастронгил и резервуарными — аскаридат.

2.8.1 Аппаратура, материалы и реактивы

2.8.1.1 Для проведения исследования применяют:

ножницы по ГОСТ 21239-77;

пинцеты по ГОСТ 21241-77;

чашки лабораторные стеклянные по ГОСТ 10973-75;

стекла предметные по ГОСТ 9224-75;

марлю медицинскую по ГОСТ 9412-93;

пробирки лабораторные;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77;

кислоту соляную по ГОСТ 3118-75;

пепсин по ТУ 10.02.01.111.89;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72;

формалин технический по ГОСТ 1625-75;

аппарат Бермана;

термостат лабораторный;

лупу бинокулярную или микроскоп.

2.8.2 Проведение исследования

2.8.2.1. Собранных дождевых червей промывают водой и убивают, добавляя в пробирку несколько капель 1%-ного раствора формалина. Затем дождевого червя кладут на предметное стекло, разрезают ножницами кутикулу в передней четверти тела, отделяют пищевод, зоб, мускулистый желудок с окружающими кровеносными сосудами и помещают на предметное стекло, затем накрывают другим предметным стеклом, их сжимают и исследуют в раздавленном препарате под бинокулярной лупой или микроскопом.

Органы червей можно исследовать и биохимическим методом — путем переваривания в искусственном желудочном соке (пепсин — 5 г, соляная кислота концентрированная — 10 см3, теплый физиологический раствор (43 °C) — 1000 см3. Органы червей размельчают на предметном стекле, заворачивают в марлевую салфетку, кладут в воронку аппарата Бермана, заливают теплым искусственным желудочным соком в соотношении 1:15 и ставят в термостат при 43 °C на 1,5 — 2 часа. Затем пробирку аппарата Бермана отсоединяют, отстаивают в течение 5 — 10 мин, надосадочную жидкость отстаивают, а каплю осадка помещают на предметное или часовое стекло и исследуют под микроскопом или лупой.

При микроскопии необходимо учитывать, что у инвазионной личинки метастронгил задний конец острый, передний — тупой, недалеко от хвостового конца имеется маленький кутикулярный шип; личинка аскариды — белого цвета, имеет пищевод, кишечник в виде трубки.

2.8.3 Обработка результатов

2.8.3.1. Результаты исследования считают положительными при обнаружении в обследуемых препаратах личинок нематод. Наличие в одной обследуемой пробе 10 и более личинок свидетельствует о высокой интенсивности инвазии у промежуточных и дополнительных хозяев нематод, обусловленной высокой зараженностью свиней метастронгилами и аскарисами.

---