ГОСТ 33808-2016. Межгосударственный стандарт. Мясо и мясные продукты. Определение лимонной кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(введен в действие Приказом Росстандарта от 03.10.2016 № 1300-ст)
(ред. от 03.09.2019)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» (ТР ТС 029/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 07.02.2018 № 21). Изменение № 1 введено в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст с 1 января 2020 года.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 3 октября 2016 г. № 1300-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Meat and meat products. Determination of citric acid usinghigh performance liquid chromatography
Дата введения 1 января 2018 года
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности имени В.М. Горбатова» (ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июля 2016 г. № 89-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 3 октября 2016 г. № 1300-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33808-2016 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2018 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
Настоящий стандарт распространяется на мясо, включая мясо птицы, субпродукты, мясную продукцию, и устанавливает метод определения массовой доли лимонной кислоты и цитратов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в ультрафиолетовой (УФ) области спектра.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст)
Диапазон измерений массовой доли лимонной кислоты и ее солей составляет от 0,1 г/100 см3 до 3,0 г/100 см3.
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-2017 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст)
<*> Сноска исключена с 1 января 2020 года. - Изменение № 1, введенное в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст.
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ ISO 3696-2013 <**> Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля
<**> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
ГОСТ 4025-95 Мясорубки бытовые. Технические условия
ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия
ГОСТ ИСО 5725-2-2003 <*> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений».
ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <**> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
<**> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
Ссылка исключена с 1 января 2020 года. - Изменение № 1, введенное в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст.
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 7269-2015 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст)
ГОСТ 31467-2012 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст)
ГОСТ 9792-73 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 20469-95 Электромясорубки бытовые. Технические условия
Ссылка исключена с 1 января 2020 года. - Изменение № 1, введенное в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст.
ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия
(ссылка введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст)
ГОСТ 26272-98 Часы электронно-механические кварцевые наручные и карманные. Общие технические условия
ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 супернатант: Жидкость, располагающаяся над твердым слоем (осадком, седиментом) после центрифугирования пробы.
3.2 гомогенат: Однородная (гомогенная) смесь пробы с экстрагирующим раствором, полученная после механического измельчения пробы на гомогенизаторе.
Метод основан на экстракции лимонной кислоты и ее солей из гомогенизированной пробы раствором трихлоруксусной кислоты, центрифугировании с осаждением белков и последующем ВЭЖХ анализе в ультрафиолетовой (УФ) области спектра. Идентификацию лимонной кислоты и ее солей осуществляют по абсолютному времени удерживания, а массовую долю определяют по площади хроматографического пика анализируемого образца, сопоставляя с пиком образца сравнения заведомо известной концентрации.
5.1 При подготовке и проведении испытаний необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
5.2 Помещение, в котором проводятся испытания, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004, и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
5.3 При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.
6 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и реактивы
Хроматограф высокоэффективный жидкостный, укомплектованный:
- детектором УФ, обеспечивающим измерения при длине волны 210 нм, с относительной погрешностью спектрофотометрического определения не более +/- 2% с пределом определения не менее 0,1 г/100 см3 по пику лимонной кислоты;
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст)
- изократическим насосом;
- анионообменной хроматографической колонкой для ВЭЖХ длиной 50 — 150 мм и диаметром 2,1 — 4,6 мм размером частиц 1,8 — 5,0 мкм, имеющей эффективность не менее 5000 теоретических тарелок по пику лимонной кислоты;
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст)
- блоком термостатирования колонок с поддержанием температуры 30 °C с точностью +/- 0,1 °C;
- записывающим устройством с компьютерным управлением и автоматической программой обработки хроматографических данных.
Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 специального или высокого класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,001 г.
Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025 или электромясорубка бытовая по ГОСТ 20469.
pH-метр со стеклянным и хлорсеребряным электродами (или комбинированным стеклянным электродом) с диапазоном измерений от 0 до 14 ед. pH с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,01 ед. pH.
Гомогенизатор лабораторный с частотой вращения ротора не менее 10000 об/мин.
Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.
Баня ультразвуковая лабораторная с регулятором времени.
Часы электронно-механические по ГОСТ 26272.
Центрифуга лабораторная с центробежным ускорением 4000 g.
Банки стеклянные вместимостью 250 — 500 см3 с крышкой.
Пипетки градуированные 1-2-1-5, 1-2-1-10 по ГОСТ 29227 или дозаторы автоматические с переменным объемом дозирования 5 см3 и 10 см3 и относительной погрешностью дозирования не более +/- 1%.
Пробирки центрифужные из полипропилена вместимостью 50 см3.
Фильтр мембранный из политетрафторэтилена с диаметром пор 0,45 мкм.
Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.
Флаконы — виалы хроматографические из темного стекла вместимостью 2,0 см3.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода для лабораторного анализа по ГОСТ ISO 3696.
Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, х.ч.
Абзац исключен с 1 января 2020 года. - Изменение № 1, введенное в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст.
Кислота трихлоруксусная с содержанием основного вещества не менее 99,0%.
Кислота лимонная с содержанием основного вещества не менее 99,5%.
Калия гидроокись по ГОСТ 24363, х.ч.
(абзац введен Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст)
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и вспомогательного оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.
7.1 Отбор проб проводят по ГОСТ 7269, ГОСТ 31467, ГОСТ 9792.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст)
7.2 Пробу измельчают, дважды пропуская через мясорубку с диаметром отверстий решетки 2 — 4 мм, и тщательно перемешивают.
7.3 Подготовленную пробу помещают в стеклянную банку вместимостью 250 — 500 см3, закрывают крышкой и хранят при температуре (4 +/- 2) °C до окончания анализа.
Допускается хранить подготовленную пробу в замороженном состоянии при температуре не выше минус 18 °C не более 7 сут.
8.1 Приготовление растворов
8.1.1 Приготовление градуировочных растворов
Для определения лимонной кислоты и ее солей готовят градуировочные растворы лимонной кислоты массовой долей: 1,0 г/100 см3 (раствор 1); 0,5 г/100 см3 (раствор 2); 0,2 г/100 см3 (раствор 3); 0,1 г/100 см3 (раствор 4); 0,05 г/100 см3 (раствор 5).
Для приготовления раствора 1 взвешивают 1,00 г лимонной кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 99 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают до полного растворения.
Для приготовления раствора 2 градуированной пипеткой отбирают 10 см3 раствора 1, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 и разбавляют 10 см3 дистиллированной воды.
Для приготовления раствора 3 градуированной пипеткой отбирают 10 см3 раствора 1, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 и доводят объем до метки дистиллированной водой.
Для приготовления раствора 4 градуированной пипеткой отбирают 5 см3 раствора 1, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 и доводят объем до метки дистиллированной водой.
Для приготовления раствора 5 градуированной пипеткой отбирают 10 см3 раствора 4, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 и разбавляют 10 см3 дистиллированной воды.
Растворы готовят перед использованием.
8.1.2 Приготовление 2%-ного раствора трихлоруксусной кислоты
Взвешивают 2,0 г трихлоруксусной кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде, доводят объем водой до метки и перемешивают.
Раствор хранят в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре не более 1 мес.
8.1.3 Приготовление подвижной фазы хроматографической системы
В качестве подвижной фазы используют фосфатный буферный раствор с pH = 6,0 ед. pH (фосфатный буфер).
Для приготовления фосфатного буфера взвешивают 13,6 г фосфорнокислого калия однозамещенного, растворяют в дистиллированной воде, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. С помощью градуированной пипетки добавляют по каплям раствор гидроокиси калия молярной концентрации 10 моль/дм3, доводя pH до 6,0 ед. pH.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст)
Перед использованием раствор дегазируют на ультразвуковой бане в течение 10 — 15 мин.
Готовый раствор хранят в колбах с притертыми пробками при комнатной температуре не более 7 сут.
8.1.4 Приготовление раствора гидроокиси калия молярной концентрации c(KOH) = 10 моль/дм3
56,1 г гидроокиси калия растворяют в дистиллированной воде, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, охлаждают и доводят до метки дистиллированной водой.
Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 мес.
(п. 8.1.4 введен Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст)
8.2 Приготовление экстракта пробы
Пробу массой 10 г взвешивают с записью результата до второго десятичного знака, помещают в центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, добавляют 30 см3 2%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и гомогенизируют. Гомогенат выдерживают на ультразвуковой бане при температуре 20 °C в течение 15 мин, а затем центрифугируют 5 мин с центробежным ускорением 4000 g. Полученный супернатант пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу вместимостью 2 см3.
9.1 Условия проведения и выполнение анализа
9.1.1 Условия проведения анализа
Условия проведения анализа подбирают в зависимости от вида применяемого жидкостного хроматографа и хроматографической колонки.
Например, для жидкостного хроматографа с обращенно-фазной хроматографической колонкой C18 4,6 x 150 мм, 5 мкм применяют следующие хроматографические условия:
элюирование проводят в изократических условиях в течение 15 мин;
состав элюента: фосфатный буфер (pH = 6,0 ед. pH);
скорость подачи элюента — 0,8 см3/мин;
длина волны детектирования — 210 нм.
(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 03.09.2019 № 612-ст)
9.1.2 Выполнение анализа
0,02 см3 экстракта анализируемой пробы вводят в подготовленный к работе жидкостный хроматограф.
9.2 Идентификацию пиков хроматограммы анализируемой пробы проводят сравнением с хроматограммой градуировочного раствора по двум параметрам: времени удерживания и спектральному отношению R (отношение высот хроматографического пика на разных длинах волн — 210, 254, 280, 320, 365 нм).
9.3 Если время удерживания и спектральные отношения пиков хроматограммы анализируемой пробы совпадают в пределах допускаемых отклонений ( \Delta R \leq 0,05 , \Delta tR \leq 3\% ) с временем удерживания и спектральными отношениями соответствующих им пиков хроматограммы градуировочного раствора, результат идентификации считают положительным.
9.4 Если спектральные отношения совпадают в пределах допускаемого отклонения, а разница времени удерживания пиков хроматограммы анализируемой пробы и хроматограммы градуировочного раствора больше допускаемого отклонения, проводят хроматографический анализ соответствующего градуировочного раствора по 9.1 и сравнивают время удерживания. В случае совпадения в качестве образца используют новую хроматограмму.
В случае повторного несовпадения времени удерживания используют метод добавок, для чего к анализируемой пробе добавляют лимонную кислоту с массовой долей, сравнимой с массовой долей «сомнительных» пиков, и анализируют по 9.1.
Если на хроматограмме пробы с добавкой площади «сомнительных» пиков увеличились на величину, соответствующую величине добавки, то эти пики относятся к определяемым компонентам.
Если на хроматограмме пробы с добавкой наряду с «сомнительными» пиками присутствуют пики, время удерживания и спектральные отношения которых совпадают с соответствующими параметрами добавленных веществ, то сомнительные пики не относятся к определяемым компонентам.
9.5 Если время удерживания соответствующих пиков хроматограммы анализируемого раствора и хроматограммы градуировочного раствора совпадают в пределах допускаемого отклонения, а разница спектральных отношений больше допускаемого отклонения, настоящий метод не применим к данной пробе.
9.6 Массовая доля лимонной кислоты и ее солей в анализируемой пробе не должна превышать предельных значений массовой доли градуировочных растворов.
В случае превышения анализируемую пробу, содержащую лимонную кислоту и ее соли, с помощью автоматического дозатора разбавляют дистиллированной водой и проводят хроматографический анализ разбавленных растворов.
Если массовая концентрация лимонной кислоты и ее солей в анализируемой пробе ниже предельного значения градуировочного раствора, необходимо увеличить массу пробы, но не более чем в два раза.
10.1 В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, создают таблицу пиков с использованием программного обеспечения хроматографа. Расчеты площади пиков и массовой доли лимонной кислоты выполняются системой обработки данных в автоматическом режиме.
10.2 Массовую долю лимонной кислоты X1, г/100 см3, вычисляют по формуле
X_{1} = \frac{C_{\text{ст}} \cdot S_{x} \cdot V_{\text{р}}}{S_{\text{ст}} \cdot m} , (1)
где Cст — массовая доля лимонной кислоты в градуировочном растворе, г/100 см3;
Sx — площадь пика лимонной кислоты в анализируемой пробе, усл. ед.;
Vр — объем экстрагирующего раствора, см3;
Sст — площадь пика лимонной кислоты в градуировочном растворе, усл. ед.;
m — масса анализируемой пробы, г.
10.3 Массовую долю цитратов X2, г/100 см3, вычисляют по формуле
где X1 — массовая доля лимонной кислоты, г/100 см3;
K — коэффициент пересчета содержания лимонной кислоты на цитраты (для цитрата натрия K = 1,343; для цитрата калия K = 1,594; для цитрата кальция K = 1,239).
10.4 За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, если удовлетворяются условия повторяемости (сходимости). Числовое значение результата измерений должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение абсолютной погрешности, содержащее не более двух значащих цифр.
11 Метрологические характеристики
11.1 Метрологические характеристики метода при доверительной вероятности P = 0,95 приведены в таблице 1.
11.2 Расхождение между результатами двух параллельных измерений, выполненных одним оператором при испытании одной и той же пробы с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) rотн, значения которого приведены в таблице 1.
где x1 и x2 — результаты двух параллельных измерений, %;
rотн — предел повторяемости, %.
11.3 Расхождение между результатами двух измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости Rотн, значения которого приведены в таблице 1.
где X1 и X2 — результаты двух измерений, выполненных в разных лабораториях, %;
Rотн — предел воспроизводимости, %.
11.4 Границы относительной погрешности результатов измерений ( \pm \delta) , находящиеся с доверительной вероятностью P = 0,95, при соблюдении условий настоящего стандарта, не должны превышать значений, приведенных в таблице 1.
12 Контроль точности результатов измерений
12.1 Контроль стабильности результатов измерений (повторяемости, промежуточной прецизионности и погрешности) проводят в соответствии с порядком, установленным в лаборатории, по ГОСТ ИСО 5725-6 (подраздел 6.2) с периодичностью 1 мес.
12.2 Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости), осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-2. Расхождение между результатами измерений не должно превышать предела повторяемости (rотн). Значения rотн приведены в таблице 1.
12.3 Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-2. Расхождение между результатами измерений, полученными двумя лабораториями, не должно превышать предела воспроизводимости (Rотн). Значения Rотн приведены в таблице 1.