ГОСТ 26968-86. Межгосударственный стандарт. Сахар. Методы микробиологического анализа

(введен Постановлением Госстандарта СССР от 01.08.1986 № 2321)

(ред. от 01.04.1995)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

САХАР

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Sugar. Methods of microbiological analysis

Постановлением Государственного комитета по стандартам от 1 августа 1986 г. № 2321 дата введения установлена

Ограничение срока действия снято по протоколу № 2-92 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 2-93).

Переиздание с Изменением № 1, утвержденным в апреле 1995 г. (ИУС 7-95).

Настоящий стандарт распространяется на сахар-песок, сахар-рафинад, рафинированный сахар-песок и жидкий сахар и устанавливает методы определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, количества дрожжей и плесневых грибов.

Методы основаны на высеве определенного количества раствора сахара в агаризованную питательную среду, выращивании посевов, подсчете всех выросших видимых колоний, а для дрожжей и плесневых грибов — колоний, типичных по макро- или микроскопической морфологии, и определении микроорганизмов в 1 г сахара.

(Измененная редакция, Изм. № 1)

1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

1.1. Отбор проб сахара для микробиологического анализа проводят по ГОСТ 12569-85 и ГОСТ 26668-85.

Пробы от продуктов отбирают асептическим способом, исключающим микробное загрязнение продукта из окружающей среды.

При отборе проб жидкого сахара из резервуара, оснащенного краном, кран сначала промывают, вытирают ватой, пропитанной этиловым спиртом, и обжигают в пламени. Затем выпускают до 500 куб. см жидкого сахара (в зависимости от вместимости резервуара и диаметра крана) и только после этого отбирают пробы в посуду, заполняя 3/4 ее объема.

Широкогорлую посуду закрывают ватными пробками, сверху пробки накладывают чистую бумагу и плотно прижимают ее к горлу посуды. Банки закрывают крышками, предварительно обработанными этиловым спиртом, маркируют этикетками с указанием номера резервуара и крана, даты отбора проб и доставляют на анализ.

1.2. Пробы отбирают стерильным пробоотборником в стерильную посуду (банки, полиэтиленовые пакеты).

Посуду, инструменты и материалы, соприкасающиеся с продуктами во время отбора проб, предварительно стерилизуют одним из следующих способов:

насыщенным паром в стерилизаторе при температуре (121 +/- 2) °C 30 мин.;

горячим воздухом в стерилизаторе: с принудительной циркуляцией воздуха при температуре 170 — 175 °C в течение 60 мин.;

без принудительной циркуляции воздуха при температуре 180 — 185 °C в течение 15 мин., при температуре 165 — 170 °C в течение 120 мин.

Допускается инструменты обрабатывать погружением в этиловый спирт с последующим обжиганием.

1.3. Отобранные пробы, предназначенные для анализа вне предприятия-изготовителя, пломбируют и опечатывают печатью организации, отвечающей за контролируемую продукцию, и транспортируют в лабораторию. Пробы снабжают актом отбора проб, в котором указывают наименования продукта, предприятия-изготовителя, номер партии, дату отбора проб, цель микробиологического анализа, подписи лиц, отбиравших пробу. Время перевозки до 12 ч с момента отбора проб.

Отбор, транспортирование в лабораторию и вскрытие проб проводят в условиях, исключающих вторичную микробиальную обсемененность сахара, в соответствии с методами, утвержденными в установленном порядке.

(1.1 — 1.3. Измененная редакция, Изм. № 1)

1.4 Анализ проводят сразу же после доставки сахара в лабораторию.

1.5. Перед вскрытием полиэтиленового пакета с сахаром его перемешивают 10-кратным переворачиванием или круговым движением.

Пробы сахара в полиэтиленовых пакетах вскрывают на столе, предварительно обработанном раствором этилового спирта.

Полиэтиленовые пакеты вскрывают стерильными ножницами, скальпелем или другим инструментом в месте, предварительно обработанном тампоном, смоченным раствором этилового спирта, горлышко банки до и после вскрытия обжигают в пламени спиртовой горелки.

1.6. После вскрытия пакета или банки с сахаром содержимое перемешивают, стерильными ложкой или шпателем отбирают навеску и переносят ее в предварительно взвешенную стерильную посуду.

Навески сахара отбирают немедленно после вскрытия упаковки, в непосредственной близости от огня.

(1.5, 1.6. Измененная редакция, Изм. № 1)

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

2.1 Для проведения анализа используют следующие аппаратуру, материалы и реактивы:

микроскоп;

термостат;

шкаф сушильный с терморегулятором, обеспечивающим нагрев до 190 °C;

баню водяную;

весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-88;

рефрактометр;

pH-метр;

колбы 2-100-2 по ГОСТ 1770-74 и колбы Кн-2-250-34 ТС и Кн-2-1000-42 ТС по ГОСТ 25336-82;

палочки стеклянные;

пипетки вместимостью 1, 2 или 5 куб. см;

пробирки П1-16-150 ХС по ГОСТ 25336-82;

стекла покровные по ГОСТ 6672-75;

стекла предметные по ГОСТ 9284-75;

термометры стеклянные ртутные от 0 до 50 °C и от 50 до 100 °C по ГОСТ 28498-90 и нормативным документам;

цилиндры 1(3)-100 по ГОСТ 1770-74;

чашки ЦБН-2 (Петри) по ГОСТ 25336-82;

бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026-76;

вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556-81;

марлю медицинскую по ГОСТ 9412-93;

лупу складную карманную по ГОСТ 25706-83;

ножи и скальпели медицинские по ГОСТ 21240-89;

пинцеты по ГОСТ 21241-89;

спиртовку по ГОСТ 25336-82 или газовую горелку;

мясо-пептонный бульон (МПБ);

агар микробиологический по ГОСТ 17206-96;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67;

спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300-87;

сусло солодовое неохмеленное;

кислоту лимонную по ГОСТ 908-79, раствор с массовой долей 20%; готовят следующим образом: 20 г лимонной кислоты переносят в мерную колбу, доводят объем водой до 100 куб. см, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.;

пробоотборник или щуп из нержавеющей стали;

чашка нейзильберовая вместимостью 150 куб. см.

Допускается применение другой аппаратуры, лабораторной посуды с метрологическими и техническими характеристиками не ниже установленных в настоящем стандарте.

(Измененная редакция, Изм. № 1)

3. ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ

3.1 Подготовка посуды и материалов

3.1.1. Посуду, предназначенную для микробиологического анализа, моют, а новую — дополнительно кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты массовой долей 1 — 2%) в течение 15 мин., затем ополаскивают дистиллированной водой и стерилизуют.

Посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 170 °C в течение 2 ч или в стерилизаторе при температуре (121 +/- 2) °C в течение 30 мин. с последующим подсушиванием.

Чашки Петри, пипетки стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В конец пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты. Резиновые пробки стерилизуют в стерилизаторе, завернутыми в бумагу.

Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах.

(3.1, 3.1.1. Измененная редакция, Изм. № 1)

3.2 Приготовление питательных сред

3.2.1 Приготовление мясо-пептонного агара

К 1000 куб. см мясо-пептонного бульона прибавляют 20 г агара, нагревают на водяной бане до растворения, фильтруют через вату, разливают в колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

3.2.2 Приготовление солодового сусло-агара

1000 куб. см неохмеленного солодового сусла, разбавленного питьевой водой до массовой доли сухих веществ 8 — 10%, фильтруют через вату, прибавляют 20 г агара, нагревают на водяной бане до расплавления агара, затем разливают в стерильные колбочки и стерилизуют 15 мин. при температуре (115 +/- 1) °C.

Среду охлаждают до (45 — 55) °C и устанавливают pH 3,6 +/- 0,1, добавляя 2 — 3 куб. см раствора лимонной кислоты с массовой долей 20%. Готовую среду хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 1) °C не более 7 сут. Если по истечении 7 сут. среда остается стерильной, то допускается хранение ее в течение 1 мес.

3.3 Проведение серии десятикратных разведений

В нейзильберовой чашке, предварительно обработанной этиловым спиртом и обожженной над спиртовкой, взвешивают 10 г сахара, записывая результат взвешивания до второго десятичного знака.

Навеску переносят в плоскодонную колбу с 90 куб. см стерильной воды, взбалтывают до полного растворения и получают первое (исходное) разведение.

Второе разведение готовят из одной части первого разведения и девяти частей стерильной воды путем смешивания в стерильной колбе или пробирке.

Разведения готовят до такой степени, чтобы можно было определить предполагаемое количество микроорганизмов в 1 г сахара.

При приготовлении разведений растворы перемешивают стерильной пипеткой путем десятикратного насасывания и выдувания из нее содержимого.

Интервал между приготовлением навесок или их разбавлений и высевом в питательные среды не должен превышать 30 мин.

(Измененная редакция, Изм. № 1)

4. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

4.1 Метод определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

4.1.1. Из разведений, приготовленных по п. 3.3, стерильной пипеткой отбирают по 1 или 2 куб. см исследуемого раствора сахара и высевают параллельно в две чашки Петри для каждого разведения. При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывают и посевной материал вносят на дно чашки.

В каждую чашку Петри не позднее чем через 15 мин. добавляют 15 — 20 куб. см питательной среды (мясо-пептонного агара). Чашки осторожно вращают круговыми движениями, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей питательной среде, и оставляют в горизонтальном положении до полного застывания. После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном на (72 +/- 3) ч при температуре (30 +/- 1) °C.

4.2 Метод определения количества дрожжей и плесневых грибов

Из разведений, приготовленных по п. 3.3, стерильной пипеткой отбирают по 1 или 2 куб. см исследуемого раствора сахара и высевают параллельно в две чашки Петри для каждого разведения. При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывают и посевной материал вносят на дно чашки. Пробу заливают 15 — 20 куб. см питательной среды (солодовое сусло-агар). Чашки осторожно вращают круговыми движениями, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей питательной среде, и оставляют в горизонтальном положении до полного застывания. После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном на 120 ч при температуре 24 — 30 °C.

4.3. Бактерии группы кишечных палочек и патогенных микроорганизмов определяют по методам, утвержденным органами государственного санитарно-эпидемиологического надзора.

(4.2, 4.3. Измененная редакция, Изм. № 1)

5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. После термостатирования через 24 ч для мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов и через 72 ч для дрожжей и плесневых грибов проводят предварительный подсчет колоний.

5.2. Окончательный подсчет колоний проводят через (72 +/- 3) ч для мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов и через 120 ч для дрожжей и плесневых грибов.

При окончательном подсчете дрожжевых колоний допускается их микроскопировать.

Если колоний немного, количество определяют визуально; если много, то подсчет ведут на 1/4 или 1/8 площади чашки при помощи лупы, делая затем пересчет на всю чашку и на количество засеянного сахара.

Колонии микроорганизмов подсчитывают в каждом из параллельных посевов одного разведения. По результатам подсчета вычисляют среднее арифметическое значение количества колоний во всех посевах одного разведения.

Если имеются колонии, выросшие не из одного, а из следующих друг за другом разведений, то подсчитывают количество микроорганизмов в сахаре по результатам подсчета колоний в каждом из этих разведений раздельно и вычисляют среднее арифметическое значение.

Количество микроорганизмов в 1 г сахара (X) вычисляют по формуле:

                                 n
                           a x 10

X = -------, V

где: a — среднее арифметическое значение количества микроорганизмов в одном разведении;

n — степень разведения продукта;

V — объем посевного материала, внесенного в чашку, куб. см.

Полученные результаты округляют:

до числа, кратного 5 — если среднее арифметическое значение количества микроорганизмов менее 100 (например, 71 до 75; 83 до 85);

до числа, кратного 20 — если среднее арифметическое значение количества микроорганизмов более 100 и оканчивается цифрой 5 (например, 115 до 120; 125 до 140);

до числа, кратного 10 — если среднее арифметическое значение количества микроорганизмов более 100 и не оканчивается цифрой 5 (например, 116 до 110; 111 до 110; 121 до 120).

Результат вычислений выражают числом от 1,0 до 9,9, n умноженным на 10 , где n — соответствующая степень разведения продукта. 2 3

Пример: 75 — 0,75 x 10 ; 1110 — 1,11 x 10 .

---