CAC/GL 90-2017. Кодекс Алиментариус. Руководство по критериям эффективности методов анализа для определения остатков пестицидов в пищевых продуктах и кормах
Актуально на 06.11.2026.
Как цитировать: "CAC/GL 90-2017. Кодекс Алиментариус. Руководство по критериям эффективности методов анализа для определения остатков пестицидов в пищевых продуктах и кормах". CAC/GL 90-2017. https://bukva.ai/docs/rukovodstvo-cacgl-90-2017
(Вместе с «Определениями»)
(Принят в 2017 году)
РУКОВОДСТВО ПО КРИТЕРИЯМ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТКОВ ПЕСТИЦИДОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И КОРМАХ (CAC/GL 90-2017) <>**
<**> Guidelines on Performance Criteria for Methods of Analysis for the Determination of Pesticide Residues in Food and Feed (CAC/GL 90-2017). Принят в 2017 году.
ЦЕЛЬ
1. Целью настоящего руководства является определение и описание критериев эффективности, которым должны соответствовать методы анализа остатков пестицидов в пищевых продуктах и кормах (в дальнейшем именуемые «пищевые продукты»). В руководстве рассматриваются характеристики/параметры, которые обеспечивают уверенность в том, что аналитический метод пригоден для предполагаемого применения и может быть использован для точной оценки остатков пестицидов в целях национального мониторинга и/или международной торговли.
2. Настоящий документ применяется в отношении методов анализа единичного остатка пестицида и в отношении методов анализа множественных остатков пестицидов (MRMs), которые анализируют целевые соединения во всех продовольственных товарах согласно определению остатка.
3. Указанное руководство охватывает количественный и качественный типы анализа, каждый из которых обладает своими собственными критериями эффективности метода. Также рассматриваются критерии эффективности методов для идентификации и утверждения анализируемого вещества (аналита).
ПРИНЦИПЫ ВЫБОРА И ВАЛИДАЦИИ МЕТОДОВ
A. Определение цели метода и сферы применения
4. Целевое назначение метода обычно описывается в положении о сфере применения, в котором определяются анализируемые вещества (остатки), матрицы и интервалы концентрации. В нем также устанавливается, предназначен ли метод для скрининговой проверки, количественного анализа, идентификации и/или утверждения результатов.
5. При нормативном применении максимально допустимый уровень остатков (MRL) выражается через определение остатка. Аналитические методы должны позволять измерять все компоненты определения остатка.
6. Соответствие метода целевому назначению означает то, в какой мере эффективность метода отвечает потребностям конечного пользователя и соответствует критериям (целям в области качества данных), согласованным между лабораторией и конечным пользователем данных (или клиентом) с учетом технических и ресурсных ограничений. Критерии соответствия метода целевому назначению могут основываться на некоторых характеристиках, описанных в настоящем документе, но в конечном счете они будут выражаться посредством допустимой суммарной неопределенности <*>.
<*> Гармонизированное руководство Международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC) для валидации однолабораторных методов анализа, журнал «Теоретическая и прикладная химия» (Pure & Appl. Chem.), 74(5), 2002 г.; стр. 835 — 855.
7. Выбор методов основывается на анализируемых веществах и целевом назначении анализа <*>.
<*> Руководящий документ OECD в отношении методов анализа остатков пестицидов, ENV/JM/MONO (2007)17.
B. Дополнение к другим руководствам Комиссии Кодекса Алиментариус
8. Комиссия Кодекса Алиментариус (CAC) приняла руководство <*> для лабораторий, участвующих в исследовании пищевых продуктов для импорта/экспорта, в котором указанным лабораториям рекомендуется:
<*> Руководство для оценки компетенции испытательных лабораторий, участвующих в контроле импорта и экспорта пищевых продуктов (CAC/GL 27-1997).
(a) использовать процедуры внутреннего контроля качества, такие как, например, процедуры, описанные в «Гармонизированном руководстве для внутреннего контроля качества в аналитических химических лабораториях»;
(b) участвовать в соответствующих программах аттестации для анализа пищевых продуктов, которые соответствуют требованию, установленному в «Международном гармонизированном протоколе для подтверждения квалификации (химических) аналитических лабораторий (журнал „Теоретическая и прикладная химия“ (Pure Appl. Chem.), том 78, № 1, стр. 145 — 186, 2006 г.)»;
(c) при необходимости использовать методы, которые прошли валидацию в соответствии с принципами, установленными Комиссией Кодекса Алиментариус (CAC).
9. Аналитические методы должны использоваться в рамках международно-признанной и утвержденной системы контроля качества в лабораториях <*> согласно принципам обеспечения качества (QA) и контроля качества (QC), изложенным в вышеуказанном документе.
<*> Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий, ISO/IEC 17025 (2005).
C. Валидация метода
10. Процесс валидации метода должен подтвердить, что метод соответствует целевому назначению. Это означает, что, когда испытание проводит соответствующим образом подготовленный аналитик, который использует определенное оборудование и материалы и точно следует протоколу метода, могут быть получены точные, достоверные и непротиворечивые результаты в рамках особых статистических пределов, установленных для анализа образца. Валидация должна показать идентичность и концентрацию анализируемого вещества с учетом матричного эффекта, а также должна представить статистическую характеристику результатов извлечения и указать, является ли допустимой частота ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Если метод сопровождается использованием надлежащих аналитических стандартов, результаты в пределах установленных критериев эффективности должны быть получены на одном и том же или эквивалентном образце подготовленным аналитиком в любой квалифицированной испытательной лаборатории. Для того чтобы гарантировать, что эффективность метода остается на соответствующем уровне в течение продолжительного периода времени, валидацию метода необходимо оценивать на постоянной основе (например, степени извлечения).
ПАРАМЕТРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЛЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
11. Общие требования к отдельным критериям эффективности метода изложены ниже <*>.
<*> Руководящий документ OECD для валидации количественного аналитического метода в одной лаборатории, применяемого для обеспечения выполнения требований о предварительных регистрационных и пострегистрационных данных в отношении защиты растений и в отношении биоцидных средств ENV/JM/MONO(2014)20.
A. Документальная база метода
12. После валидации документальная база метода в дополнение к критериям эффективности (целям в области качества данных) должна обеспечить наличие следующей информации:
(a) идентичность анализируемых веществ, включенных в определение остатка;
(b) интервал концентрации, подпадающий под валидацию;
(c) матрицы, используемые при валидации (категории репрезентативных товаров, например, сходные сельскохозяйственные продукты, основанные на характеристиках, включая содержание влаги, жира и сахара, pH);
(d) протокол, описывающий оборудование, реагенты, подробную пошаговую процедуру, включая допустимые отклонения (например, «нагревать при температуре 100 +/- 5 °C в течение 30 +/- 5 мин»), процедуры калибровки и обеспечения качества, требуемые особые меры предосторожности, предполагаемое применение и требования к существенной неопределенности;
(e) количественный результат расширенной неопределенности измерения (MU) для метода должен рассчитываться в ходе процедуры валидации, в соответствующих случаях необходимо представить отчет.
B. Селективность
13. В идеале селективность должна оцениваться для того, чтобы показать отсутствие интерференций, которые существенным образом влияют на анализ. Нецелесообразно тестировать метод в отношении каждого потенциального интерферента, но необходимо, чтобы общие интерференции проверялись путем проведения анализа холостого реагента (процесса) для каждой партии реагентов. Если реагенты и/или растворители заменяются между партиями образцов, может проводиться дополнительная оценка холостого реагента. Фоновые уровни пластификаторов, просачивающихся через септу, чистящих средств, загрязняющих примесей реагентов, а также лабораторных загрязнений, загрязнений анализируемой пробы остатками предыдущей пробы и т.д. обнаруживаются в холостых реагентах и должны учитываться аналитиком. Также интерференции одного анализируемого вещества с другим должны выявляться посредством проверки отдельных анализируемых веществ в смешанных стандартных растворах. Интерференции матриц оцениваются путем проведения анализа образцов, которые не содержат анализируемого вещества; холостая матрица требуется с каждой партией образцов, или применяется стандартный метод добавок для определения количественных значений (см. Раздел E).
14. Как правило, селективность должна быть такой, чтобы интерференции не влияли на эффективность метода. Основной критерий селективности включает в себя доли ложноположительных и ложноотрицательных результатов в анализируемых веществах. Для того чтобы оценить доли ложноположительных и ложноотрицательных результатов в ходе валидации метода, необходимо проанализировать адекватное количество холостых проб на матрицу [взятых из разных источников] совместно с обогащенными матрицами на нижней границе определяемых концентраций анализируемого вещества.
C. Калибровка
15. За исключением погрешностей при подготовке калибровочных материалов, погрешности калибровки обычно являются второстепенным компонентом общей неопределенности и с уверенностью могут быть отнесены к другим категориям. Например, случайные погрешности, возникающие в результате калибровки, являются частью неопределенности, в то время как систематические погрешности приводят к аналитическим отклонениям, обе оцениваются в целом в ходе валидации и текущего контроля качества. Однако имеются некоторые характеристики калибровки, которые полезно знать на начальной стадии валидации метода, так как они влияют на оптимизацию окончательного протокола. Например, необходимо заранее знать, является ли калибровочная кривая прямолинейной или квадратичной, проходит ли она через начало системы координат и влияет ли на нее матрица пробы. Описываемое в настоящем документе руководство в большей степени относится к валидации, которая может быть более детальной, чем калибровка, выполненная в ходе стандартного анализа.
16. Для того чтобы обеспечить эмпирическую оценку неопределенности, необходимы параллельные измерения. Для первоначальной валидации метода рекомендуются следующие процедуры калибровки:
(a) следует провести определения на пяти или более концентрациях (рекомендуется многократный ввод проб на концентрацию);
(b) эталонные стандарты должны быть равномерно распределены по исследуемому диапазону концентрации, и диапазон концентрации должен охватывать весь вероятный диапазон концентрации;
(c) эталонные стандарты должны распределяться над всей последовательностью или должны охватывать начало и окончание цикла, для того чтобы показать, что целостность калибровки сохраняется по всей последовательности; согласованность калибровочной функции необходимо указать на графике и проверить визуально и/или путем исчисления остатков (разницы между фактической или рассчитанной концентрациями стандартов), избегая чрезмерного доверия к коэффициентам корреляции. Если остатки калибровочной кривой отклоняются более чем на +/- 20 — 30% (30% для концентраций калибровки вблизи предела количественного определения инструмента), необходимо рассмотреть статистические аспекты выбросов, что может привести к повторному анализу последовательности при несоблюдении критериев контроля качества.
D. Линейность
17. Линейность можно проверить путем изучения графика остатков, полученного посредством линейной регрессии откликов на концентрации в соответствующем наборе для калибровки. Любая криволинейная диаграмма предполагает несогласованность, возникшую в результате нелинейной калибровочной функции. В данном случае следует испытать и применять другую функцию, например, квадратичную, используя как минимум пять уровней концентрации. Несмотря на свое текущее широкое применение в качестве показателя качества согласованности, коэффициент детерминации (R2) может ввести в заблуждение, так как он придает существенное значение стандартам с более высокими концентрациями. В этом случае необходимо рассмотреть соответствующий весовой коэффициент, например, 1/x или 1/x2, для того чтобы минимизировать возможное воздействие относительного диапазона концентрации.
18. Как правило, для определения низких концентраций (миллиардная доля, мкг/кг) вместо использования линейной регрессии рекомендуется использовать взвешенную линейную регрессию или взвешенную квадратичную функцию. В идеале значение отрезка, отсекаемого на оси координат, должно быть близким к нулю для уменьшения погрешности при расчете концентраций остатка на низких уровнях, хотя калибровочная кривая не должна без обоснования проходить через начало системы координат.
E. Эффекты матрицы
19. Для компенсации эффектов матрицы обычно применяется калибровка с согласованной матрицей. Для калибровки следует использовать экстракты холостой матрицы, желательно того же самого или аналогичного образца. Альтернативным практическим подходом к компенсации эффектов матрицы в газохроматографическом (GC) анализе является использование химических компонентов (протектанты для аналита), которые добавляются в экстракты образца и калибровочные растворы, для того чтобы максимизировать (в идеале) в равной степени отклик пестицидов в калибрующих веществах в растворе и экстрактах образца. Альтернативные способы компенсации эффектов матрицы включают в себя использование стандартных добавок, изотопно-меченых внутренних стандартов (IS) или химических аналогов. Однако использование указанных подходов в MRMs часто является затруднительным, так как в различных матрицах на разных уровнях имеется слишком много остатков для разработки общепринятых процедур, также для многих анализируемых веществ отсутствуют изотопно-меченые стандарты. В идеале при наличии изотопно-меченых стандартов они должны представлять диапазон целевых соединений, извлечения должны соответствовать критериям для образцов, к которым добавили не изотопно-меченые стандарты. Если применяется калибровка только по растворителю, измерение эффектов матрицы должно быть проведено для подтверждения эквивалентности результатов путем сравнения откликов стандартов с согласованной матрицей и стандартов только по растворителю.
F. Правильность и степень извлечения
20. Правильность является степенью соответствия между результатом анализа и принятым эталонным значением измеряемого свойства. Правильность выражается количественно через «систематическое отклонение», чем меньше отклонение, тем выше правильность. Отклонение главным образом определяется путем сравнения отклика метода с сертифицированным стандартным образцом (при его наличии) с известным значением, присвоенным материалу. В идеале рекомендуется многолабораторное исследование. Если неопределенность в эталонном значении не является несущественной, при оценке результатов необходимо учитывать неопределенность стандартного образца, а также статистическую вариативность на основании анализа стандартного образца. При отсутствии сертифицированных стандартных образцов <*>, <**> руководство рекомендует использование доступного стандартного образца, точно охарактеризованного в целях валидационного исследования.
<*> Гармонизированное руководство Международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC) для валидации однолабораторных методов анализа, журнал «Теоретическая и прикладная химия» (Pure & Appl. Chem.), 74(5), 2002 г.; стр. 835 — 855.
<**> Руководящий документ OECD для валидации количественного аналитического метода в одной лаборатории, применяемого для обеспечения выполнения требований о предварительных регистрационных и пострегистрационных данных в отношении защиты растений и в отношении биоцидных средств ENV/JM/MONO(2014)20.
21. Степень извлечения относится к доле анализируемого вещества, определенной в окончательном результате по сравнению с количеством, добавленным в образец (обычно холостой) до извлечения, как правило, выражаемой в процентах. Погрешности в измерении приведут к необъективным показателям степени извлечения, которые будут отклоняться от фактической степени извлечения в конечном экстракте. Стандартное извлечение относится к определению(-ям), выполненному(-ым) на пиках контроля качества при анализе каждой партии образцов.
G. Точность
22. Точность является степенью соответствия между результатами независимого (параллельного) анализа, полученными в предусмотренных условиях. Точность обычно определяется через стандартное отклонение (SD) или относительное стандартное отклонение (RSD), также известное как коэффициент вариаций (CV). Различие между точностью и систематическим отклонением зависит от уровня, на котором рассматривается аналитическая система. Так, с точки зрения отдельного определения любое отклонение, влияющее на калибровку, применяемую при анализе, должно рассматриваться как систематическое отклонение. С точки зрения аналитика, пересматривающего работу, проделанную за год, аналитическое отклонение должно различаться каждый день и должно быть случайной величиной с соответствующей точностью, включая любые предусмотренные условия для оценки указанной точности.
23. Что касается валидации в одной лаборатории, два типа комбинаций условий точности имеют значение: (a) повторяемость, вариативность измерений в пределах одной и той же аналитической последовательности; и (b) внутрилабораторная воспроизводимость, вариативность результатов среди множества измерений одного и того же образца. Важно, чтобы значения точности соответствовали возможным условиям испытания. Во-первых, вариативность условий среди множества циклов должна представлять собой то, что обычно происходит в лаборатории при стандартном использовании метода. Этого можно добиться путем текущей валидации/проверки эффективности метода. Например, различия в партиях реагентов, аналитиках и инструментальных средствах должны измеряться в рамках текущего контроля качества. Во-вторых, исследуемый материал с учетом матрицы и (в идеале) состояния измельчения должен быть характерным для материалов, которые могут встретиться при реальном применении метода.
24. При проведении валидации в одной лаборатории точность часто варьируется в зависимости от концентрации анализируемого вещества. Характерными допущениями являются допущения того, что (a) в точности с уровнем анализируемого вещества изменений нет или (b) что стандартное отклонение пропорционально уровню анализируемого вещества или линейно зависит от него. В обоих случаях допущение требует проверки, если ожидается, что уровень анализируемого вещества будет существенно отличаться (т.е. если уровень анализируемого вещества приближается к пределу количественного определения (LOQ)).
25. Данные о точности могут быть получены в отношении широкого спектра различных комбинаций условий в дополнение к минимуму повторяемости и внутрисерийным условиям, указанным здесь, и было бы целесообразным получение дополнительной информации. Например, для оценки результатов или совершенствования измерения было бы полезно давать информацию об отдельных операторах, а также об эффектах цикла в течение дня или в разные дни или указывать точность, достигаемую при использовании одного или нескольких инструментов. Существует ряд различных проектов и техник статистического анализа, и для всех таких исследований настоятельно рекомендуется использование тщательно разработанного плана эксперимента. Первоначальная валидация должна проводиться на целевом пределе количественного определения (LOQ) или на пределе отчетности метода и как минимум еще на одном, более высоком, уровне, например, 2 — 10 x целевого LOQ или MRL.
H. Предел количественного определения (LOQ)
26. В соответствии с принятым среди химиков-аналитиков определением LOQ является концентрацией, при которой среднее соотношение сигнал/шум (S/N) в анализе составляет 10. На практике LOQ можно оценить только приблизительно, потому что точное определение фактического LOQ требует многочисленных анализов проб с добавлением стандартного раствора и холостых матриц, но LOQ может изменяться ежедневно вследствие состояния функционирования инструментальных средств, в числе многих других факторов. Некоторые руководства по валидации требуют проверки LOQ на соответствие критериям эффективности метода посредством проведения экспериментов с добавками на LOQ, однако ежедневные колебания в LOQ могут заставить аналитика дать завышенную оценку действительному LOQ метода, которая может быть затруднительна для выполнения точного определения LOQ (S/N = 10). Таким образом, метод добавок на минимальном валидированном уровне (LVL) является более описательным и правильным подходом. Помимо этого, количественное определение анализируемых веществ не следует проводить ниже минимального валидированного уровня (LVL) в той же самой аналитической последовательности. Соотношение сигнал/шум (S/N) на минимальном уровне калибровки (LCL) должно составлять >= 10 (концентрация >= LOQ), которое может быть установлено в качестве проверки пригодности системы, требуемой для каждой аналитической последовательности. Матрица с известной добавкой контроля качества также может быть включена в каждую последовательность для проверки того, что в каждом анализе достигнут предел отчетности (предел регулирования, который, как правило, > LCL). По существу смысл валидации заключается не в определении LOQ, а в подтверждении того, что наименьшая подтвержденная концентрация отвечает потребности в анализе. Несмотря на то, что для количественного определения это нецелесообразно, некоторые аналитики могут пожелать высчитать предел обнаружения (LOD) (S/N = 3), чтобы предположить наличие анализируемого вещества в концентрациях слишком низких для того, чтобы разрешить оценку концентрации анализируемого вещества.
I. Аналитический диапазон
27. Валидированный диапазон — интервал концентрации анализируемого вещества, в пределах которого метод может считаться прошедшим валидацию. LVL является наименьшей концентрацией, оцененной в процессе валидации и соответствующей критериям эффективности метода. Важно понимать, что валидированный диапазон не должен обязательно совпадать с полезным диапазоном инструментальной калибровки. В то время как калибровка может охватывать широкий диапазон концентрации, валидированный диапазон (который обычно более важен в отношении неопределенности) будет охватывать, как правило, более ограниченную область. На практике, большинство методов будут проходить валидацию в отношении как минимум двух уровней концентрации. Валидированный диапазон может восприниматься как обоснованная экстраполяция между указанными уровнями концентрации, но многие лаборатории выбирают валидацию на третьем уровне для того, чтобы продемонстрировать линейность. В целях мониторинга концентраций остатков с учетом стандартов аналитический метод должен быть достаточно чувствительным для того, чтобы LVL для каждого анализируемого вещества находился на максимально допустимом уровне остаточного количества (CXL) Кодекса или был ниже его. Диапазон валидации должен охватывать существующий CXL. В случае если CXL не существует, самый низкий уровень может быть MRLs, установленными национальным регулятивным органом. В случае если для заданной пары анализируемое вещество/матрица CXL или MRL не существует, тогда, как правило, в качестве подходящего LVL выступает 0,01 мг/кг или LOQ (в зависимости от того, какое значение больше). В MRMs типичной аналитической целью является установление LVL (и нижней границы определяемых концентраций) в 0,01 мг/кг в разных, но репрезентативных товарах.
J. Устойчивость
28. Устойчивость (часто синонимом выступает слово «выносливость») аналитического метода представляет собой неизменность результатов, полученных при использовании аналитического метода, когда имеются отклонения от экспериментальных условий, описанных в процедуре. Пределы экспериментальных параметров должны быть указаны в протоколе метода (хотя в прошлом это не всегда осуществлялось), и указанные допустимые отклонения, отдельно или в любом сочетании, не должны вносить значимых изменений в полученные результаты. В рамках настоящего документа «значимое изменение» подразумевает, что метод не отвечает целям в отношении качества данных, определяемых соответствием метода целевому назначению. Следует идентифицировать аспекты метода, которые могут повлиять на результаты, а также их воздействие на эффективность метода, оцененную посредством проведения испытания на устойчивость.
29. Примерами факторов, которые могут рассматриваться в испытании на устойчивость, являются: незначительные изменения в инструментальных средствах, марка/партия реагента или смена оператора; концентрация реагента, pH раствора, температура реакции, время, необходимое для завершения процесса, и/или другие соответствующие факторы.
K. Неопределенность измерения (MU)
30. Формальный подход к оценке неопределенности измерения является оценкой, рассчитанной исходя из результатов уравнения или математической модели, относительно которой можно предположить, что истинное значение находится в пределах определенной степени вероятности. Процедуры, описанные в валидации метода, разработаны в целях обеспечения того, что уравнение, используемое для оценки результата, с должной допустимостью случайных погрешностей всех видов является истинным выражением, содержащим в себе все признанные и существенные воздействия на результат. Дальнейшие аспекты и описание неопределенности измерения предусмотрены в «Руководстве по оценке неопределенности результатов» <*>.
<*> Руководство по оценке неопределенности результатов (CAC/GL 59-2006).
31. Предпочтительно выражать неопределенность измерения в виде функции концентрации и сравнивать указанную функцию с критерием соответствия метода целевому назначению, согласованным между лабораторией и клиентом или конечным пользователем данных. Одной из возможностей является расчет MU исходя из данных, полученных по результатам проверки квалификации <*>.
<*> Руководство по оценке неопределенности результатов (CAC/GL 59-2006).
КРИТЕРИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ СКРИНИНГОВЫХ МЕТОДОВ
32. Как правило, скрининговые методы по своему характеру являются качественными или приближенно-количественными, их целью является отделение образцов, которые не содержат остатков выше порогового значения («отрицательные»), от образцов, которые могут содержать остатки выше указанного значения («номинально положительные»). Следовательно, стратегия валидации уделяет основное внимание установлению пороговой концентрации, при превышении которой результаты являются «потенциально положительными», определению основанного на статистических данных уровня для обнаружения ложных результатов (положительных или отрицательных), проверке в отношении интерференций и установлению соответствующих условий использования. Концепция скрининга предлагает лабораториям эффективные средства для распространения их аналитической области действия на анализируемые вещества, которые потенциально имеют низкую вероятность присутствия в образцах. Анализируемые вещества, которые чаще всего встречаются в пробах, необходимо контролировать посредством применения валидированных количественных MRMs. Как и количественные методы, скрининговые методы также должны проверяться на селективность и чувствительность. В некоторых случаях могут быть полезны наборы оборудования для коммерческих исследований, но на практике современные технические приемы редко отвечали потребностям в многоостаточном скрининге с экономической точки зрения. Селективность и аналитическая область действия часто улучшаются, если до обнаружения остатков используется хроматография или иная форма разделения. Другим подходом является использование скрининговых методов, которые включают в себя основанное на масс-спектрометрии (MS) обнаружение, которое способно отличать определенные химические вещества друг от друга.
33. Селективность скрининговых методов должна быть в состоянии отличать присутствие целевого соединения или группы соединений от других субстанций, которые могут присутствовать в материале образца. Селективность скрининговых методов обычно меньше, чем селективность количественного метода. Скрининговые методы могут использовать структурное свойство, общее для группы или класса соединений, и могут основываться на иммунохимических или спектрофотометрических откликах, которые не могут однозначно идентифицировать соединение.
34. Валидация скринингового метода на основе скринингового предела обнаружения (SDL) может быть сфокусирована на способности к обнаружению. Для каждого репрезентативного типа матрицы (группа товаров) <*> минимальная валидация должна включать в себя анализ как минимум 5 образцов, обогащенных на планируемом SDL, и по меньшей мере 5 холостых матриц из других источников (например, полученных с разных рынков или разных сельскохозяйственных угодий). Лучшую валидацию обеспечивает большее количество параллельных анализов для большего разнообразия. Как минимум два различных образца для каждого типа матрицы должны подходить для намеченного объема деятельности лаборатории. Дополнительные данные для валидации могут быть взяты из данных относительно текущего контроля качества (QC) и проверки эффективности метода в ходе рутинного анализа. SDL качественного скринингового метода является самым низким уровнем, на котором было обнаружено анализируемое вещество (необязательно отвечающее критериям идентификации MS) как минимум в 95% образцов (например, допустимый уровень ложноотрицательных результатов в 5%).
<*> Таблица 5, Руководство по надлежащей лабораторной практике по определению остатков пестицидов (CAC/GL 40-1993).
КРИТЕРИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ МЕТОДОВ
35. Селективность имеет особое значение в вопросе определения критериев эффективности количественных методов, используемых в программах нормативного регулирования остатков пестицидов в пищевых продуктах. В идеале метод должен обеспечивать ответный сигнал, который не подвержен интерференции других анализируемых веществ и матричных соединений, которые могут присутствовать в образце или экстракте образца. Хроматографические анализы, основанные на пиках, которые разрешены не в полной мере, обеспечивают менее достоверные количественные результаты. Использование детекторов конкретных элементов, разных длин волны детектора или детекторов на основе MS, которые лучше могут различать определенное соединение или структуру, в сочетании с хроматографическим разделением улучшает селективность количественных методов.
36. Требование об извлечении остатков различных пестицидов в одной экстракции увеличивает вероятность сниженной селективности в MRMs по сравнению с методами обнаружения единичных остатков. Использование менее селективной экстракции и процедур очистки может привести к большему содержанию совместно экстрагированного материала матрицы в конечном экстракте. Характер и количества указанного совместно экстрагированного материала могут значительно различаться в зависимости от матрицы, метода и соответствующих анализируемых веществ. Следовательно, требуется особая тщательность при установлении критериев точности и правильности MRMs с тем, чтобы химические интерференции не повлияли на количественное определение.
37. В дополнение к селективности метода следует продемонстрировать его способность обеспечивать достаточный количественный результат (например, правильность — см. раздел F и точность — см. раздел G). В идеале относительное стандартное отклонение между оригинальным образцом и параллельными анализами будет менее 20%.
38. На начальном и на осуществляемых в дальнейшем этапах валидации необходимо продемонстрировать критерии приемлемости для количественного аналитического метода, а именно, его способность обеспечить приемлемые средние значения степени извлечения на каждом уровне метода добавок. Для валидации рекомендуется провести как минимум 5 параллельных анализов (для проверки степени извлечения и точности) на целевом LVL, LOQ или пределе отчетности метода и как минимум на одном дополнительном, более высоком, уровне, например, 2 — 10 x LVL или MRL. Если метод используется для проверки соответствия (например, соответствия продукта установленному MRL), MRL (или CXL) должен находиться в пределах валидированного интервала концентраций. Если определение остатков включает в себя два анализируемых вещества или более, метод должен проходить валидацию в отношении всех анализируемых веществ.
39. Правильность метода можно определить посредством анализа сертифицированного стандартного образца путем сравнения результатов с результатами, полученными при использовании иного метода, для которого ранее были установлены критерии эффективности (как правило, совместного метода исследования), или путем определения степени извлечения анализируемого вещества, обогащенного известной холостой пробой. Допустимые средние значения степени извлечения в целях обеспечения соблюдения должны, как правило, находиться в диапазоне от 70 — 120% с RSD <= 20%. Для очень низких концентраций (например, < 0,01 мг/кг) некоторые лаборатории могут утвердить критерии эффективности метода, которые не входят в число указанных параметров (например, 60 — 120% с RSD < 30%). В определенных случаях (обычно с MRMs) допустимыми могут являться степени извлечения, не входящие в указанный диапазон, например, если степень извлечения ниже, но единообразна (например, демонстрирует хорошую точность). Это более оправдано, если причина для систематически низкого отклонения точно установлена в химии (например, известное распределение анализируемого вещества между фазами на этапе фракционирования). Однако при наличии соответствующей возможности следует использовать более точный метод. Степени извлечения > 120% могут объясняться положительной интерференцией или систематическим отклонением, причины которых должны исследоваться.
40. В целях содействия валидации метода рекомендуется анализ исследуемой матрицы. Для интерпретации степеней извлечения необходимо признать, что анализируемое вещество, добавленное к исследуемому образцу, не может вести себя так же, как и биологически исследуемое анализируемое вещество (остаток пестицида). Во многих случаях количество экстрагированного остатка будет меньше, чем общее количество остатков, фактически присутствующих в образце. Это можно объяснить потерями во время экстракции, внутриклеточным связыванием остатков, присутствием конъюгатов или другими факторами, которые представлены не в полной мере в экспериментах по извлечению с использованием холостых матриц, обогащенных анализируемым веществом. Часто для оценки степеней извлечения остатков требуются меченные радиоактивным изотопом остатки или стандартные эталонные материалы.
41. При относительно высоких концентрациях ожидается, что степени извлечения для анализа будут приближаться к ста процентам. При более низких концентрациях, особенно при использовании методов, включающих обширную экстракцию, выделение и концентрацию, степени извлечения могут быть ниже, чем при более высоких концентрациях. Несмотря на то, какие средние степени извлечения наблюдаются, желательно извлечение с низкой изменчивостью, чтобы при необходимости можно было сделать достоверную поправку для извлечения в окончательном результате.
42. В общем и целом данные по остаткам не должны корректироваться в отношении степени извлечения, если средняя степень извлечения находится в диапазоне 70 — 120%. Поправки на извлечение должны быть сделаны в соответствии с руководством, предусмотренным CAC/GL 37-2001 <*>. Это обеспечит прямое сравнение групп данных. Корректирующие функции должны быть установлены на основании надлежащих статистических аспектов, они должны быть документированы, архивированы и доступны для клиентов и проверяющих лиц. Данные должны (a) быть четко идентифицированы относительно того, применялась ли поправка на степень извлечения; и (b) при необходимости должны включать сведения о размере поправки и методе, которым она была получена. Это посодействует прямой сопоставимости групп данных. Корректирующие функции должны быть установлены на основании надлежащих статистических аспектов, они должны быть документированы, архивированы и доступны клиенту.
<*> Гармонизированное руководство IUPAC для использования информации о степени извлечения в аналитическом измерении. «Теоретическая и прикладная химия» (Pure & Appl. Chem.), 71, 1999; 337 — 348. CAC/GL 37-2001.
43. В соответствии с ISO IEC 170255 необходимо участие в программе проверки квалификации. Для лабораторий, осуществляющих мониторинг остатков пестицидов, по всему миру доступны программы проверки квалификации. Также могут проводиться межлабораторные исследования.
КРИТЕРИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ПОДТВЕРЖДЕНИЯ АНАЛИЗИРУЕМОГО ВЕЩЕСТВА
44. Несомненно, грубые погрешности (нетипичные ошибки, допущенные в процессе подготовки образца) являются главным источником ошибочной идентификации в методах, основанных на MS. По этой причине вся правоприменительная практика (превышение MRL или отсутствие MRL в товаре) требует подтверждения результата посредством повторной экстракции анализируемого образца исходной пробы и повторного анализа, в идеале с применением другой подготовки образца и/или анализа.
45. Селективность является основным фактором для методов идентификации. Для обеспечения однозначной идентификации метод должен быть в достаточной степени селективным. MS в сочетании с методом хроматографического разделения является очень мощной комбинацией для идентификации анализируемого вещества в экстракте образца. Указанный метод обеспечивает информацию о структуре анализируемого вещества, которую нельзя получить только посредством хроматографии. Инструменты GC-MS и LC-MS (полное сканирование, режим селективного ионного детектирования, высокое разрешение, последовательная MS/MS, гибридные системы и иные современные методы) обеспечивают наличие многих измеряемых параметров, например, время удерживания, формы хроматографических пиков, интенсивность ионов и их относительное содержание/показатели, точность массы и другие важные характеристики, которые помогают провести идентификацию анализируемого вещества. Однако успешные методы могут быть разработаны или могут применяться с использованием методик, отличных от методик, основанных на MS (например, высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) с фотодиодной матрицей, газовая хроматография (GC) с селективным детектированием элемента), особенно, если подтверждение результатов исследования сделано с альтернативными колонками <*>.
<*> Руководство по надлежащей лабораторной практике по определению остатков пестицидов (CAC/GL 40-1993).
A. Идентификация на основе MS
46. Общепризнанных критериев идентификации не существует. В Таблице 1 приведены примеры критериев.
47. Существующие практики качественного и количественного анализов остатков пестицидов обычно включают в себя хроматографию в сочетании с выборочным мониторингом ионов (SIM) или методом тандемной масс-спектрометрии (MS/MS). Приемлемым методом также является полноспектральная масс-спектрометрия (MS), которая использует коэффициенты согласования спектральной библиотеки и/или относительные содержания главных ионов в полных спектрах. Последний случай может рассматриваться как отношения ионов в указанных ниже критериях, использующих как минимум 3 иона. В первом случае коэффициенты согласования следует использовать в целях обязательной идентификации; референтные спектры из библиотеки должны быть получены из эталонов высокой чистоты с вычитаемым фоном, полученных на том же оборудовании и в тех же условиях, что в анализе образцов. Необходимо соблюдать следующие критерии идентификации:
(a) Эталонные значения времени удерживания анализируемого вещества должны определяться из одновременно анализируемых (в одной и той же партии) калибровочных стандартов высокой концентрации с согласованной матрицей. В противном случае, если известно, что интерференции отсутствуют, можно использовать стандартизированные растворы на неводной основе.
(b) Эталонные значения отношения ионов должны устанавливаться способом, описанным в пункте 47a. Разные ионы, используемые для идентификации, должны быть совместно элюируемыми и должны иметь сходные формы пиков. Ион из калибровочного стандарта с более высокой средней интенсивностью должен использоваться в качестве знаменателя в ионном отношении, выраженном в процентах (из-за флуктуаций сигнала, эффектов матрицы и т.д. допускаются отклонения до 30% ионных отношений).
(c) Отношения сигнала к шуму для измеренных пиков должны быть больше 3, и/или сигнал должен превышать уровень пороговой интенсивности по сравнению с сигналом подходящего калибровочного стандарта или контроля, охватывающего соответствующий уровень.
(d) Выбор ионных переходов для целей идентификации должен быть логичным с химической/структурной точки зрения (следует удостовериться, что выбранные ионы не являются производными от деграданта, загрязнения или смешения с химическим веществом, отличным от анализируемого вещества).
(e) Все исследуемые образцы реагента и холостой матрицы должны быть свободны от переносов веществ из предыдущей пробы, загрязнения и/или интерференций, с откликом > 20% LOQ. Для холостых проб матрицы допускается 30% LOQ.
(f) В том, что касается анализов MS, предпочтителен мониторинг ионов с отношением масса/заряд более 100.
48. Минимально допустимое время удерживания для анализируемого вещества (анализируемых веществ) должно быть как минимум вдвое больше времени удерживания, соответствующего исключенному (мертвому) объему колонки. Время удерживания для анализируемого вещества в экстракте должно соответствовать эталонному значению (47a) в пределах +/- 0,2 мин или 0,2% относительного времени удерживания для газовой и для жидкостной хроматографии (по возможности предпочтительно в пределах +/- 0,1 мин).
49. Считается, что методы, основанные на масс-спектрометрии с высоким разрешением, обеспечивают повышенную надежность путем точного измерения массы/заряда иона, которую нельзя получить, используя методики масс-спектрометрии с единичным разрешением. Различные типы и модели масс-спектрометрических детекторов обеспечивают разные уровни селективности, которая относится к степени достоверности идентификации. Примерные критерии идентификации, предусмотренные в Таблице 1, должны рассматриваться только в качестве руководства для идентификации, а не в качестве абсолютных критериев, которые подтверждают присутствие или отсутствие вещества.
B. Подтверждение
50. Если первоначальный анализ не обеспечивает однозначной идентификации или не соответствует требованиям, предъявляемым к количественному анализу, требуется подтверждающий анализ. Он может включать повторный анализ экстракта или образца. Если CXL/MRL превышены, требуется проведение подтверждающего анализа другой части образца. Также подтверждающий анализ рекомендуется в отношении необычных комбинаций пестицид/матрица.
51. Если первоначальный подтверждающий метод не основывается на методе MS, подтверждающие методы должны включать в себя идентификацию анализируемого вещества на основе MS. Кроме этого, подтверждающие методы должны использовать независимый подход, основанный на иных механизмах химических реакций (например, разделение LC и GC). В некоторых случаях уместным может быть подтверждение независимыми лабораториями. Примеры аналитических методов, которые могут соответствовать критериям подтверждающих аналитических методов, приведены в Таблице 2.
Критерии идентификации для различных методов MS
| Детектор MS/характеристики | Типичные системы (примеры) | Получение | Требования для идентификации | |
| минимальное число ионов | другие требования | |||
| Разрешение единицы массы | квадруполь, ионная ловушка, TOF | полное сканирование, ограниченный диапазон масса/заряд, выборочный мониторинг ионов (SIM) | 3 иона | S/N >= 3 e Пики аналита в экстрагированных ионных хроматограммах должны полностью перекрываться. Отношение ионов в +/- 30% (относительно) среднее значение калибровочных стандартов той же последовательности f |
| MS/MS | тройной квадруполь, ионная ловушка, Q-trap, Q-TOF, Q-Orbitrap | мониторинг селективных или множественных реакций, разрешение по массам для выделения иона-предшественника, равное разрешению единицы массы или лучше | 2 иона-продукта | |
| Определение точно измеренной массы | MS высокого разрешения: TOF или Q-TOF Orbitrap или Q-Orbitrap FT-ICR-MS секторальная MS | полное сканирование, ограниченный диапазон масса/заряд, выборочный мониторинг ионов (SIM), фрагментация с селекцией иона-предшественника или без нее, или сочетание всего вышеуказанного | 2 иона с точностью массы <= 5 м.д. a, b, c | |
| объединенная однофазная MS и MS/MS с разрешением по массам для выделения иона-предшественника, равным разрешению единицы массы или лучше | 2 иона: 1 молекулярный ион, (де)протонированная молекула или ион-аддукт с точностью массы <= 5 м.д. a, c плюс 1 ион-продукт MS/MS d | |||
a в том числе по возможности молекулярный ион, (де)протонированная молекула или ион-аддукт.
b в том числе как минимум один осколочный ион.
c < 1 mDa для массы/заряда < 200.
e При отсутствии шума сигнал должен присутствовать как минимум в 5 последующих сканах.
f Если точность массы предшественника и его иона-продукта < 5 м.д., допустимое отклонение по отношению ионов является необязательным.
Примеры методов обнаружения, подходящих для подтверждающего анализа веществ
Анализируемое вещество (аналит): химическое вещество, искомое или определяемое в образце. Руководство по аналитической терминологии (CAC/GL 72-2009).
Протектант для аналита: соединения, которые активно взаимодействуют в целях заполнения активных участков в газохроматографической системе, тем самым снижая взаимодействие анализируемого вещества с указанными активными участками и обеспечивая меньшее размывание границ пика или потерь и таким образом более высокий отклик аналита.
Применимость: анализируемые вещества, матрицы и концентрации, в отношении которых удовлетворительным образом может применяться аналитический метод. Руководство по аналитической терминологии (CAC/GL 72-2009).
Коэффициент вариаций (CV): часто обозначается как Относительное стандартное отклонение (RSD). Это мера точности в количественных исследованиях, сопоставляющая вариативность данных измерений с различными средствами.
Подтверждение: совокупность двух или более анализов, которые соответствуют друг другу, как минимум один из которых отвечает критериям идентификации.
Подтверждающий метод: метод, который способен обеспечить наличие дополнительной информации в соответствии с предыдущим результатом. В идеале другая часть образца анализируется при помощи метода, включающего в себя химический механизм, отличного от того, который использовался при первом анализе, и один из методов соответствует критериям идентификации анализируемого вещества с приемлемой степенью определенности на соответствующем уровне.
Деградат (деградант, продукт разложения): компонент остатка пестицида, образующийся в продукте в результате абиотической трансформации пестицида (например, при воздействии тепла, света, влаги, pH и т.д.).
Ложноположительный результат: результат, неверно указывающий на присутствие анализируемого вещества или на то, что оно превышает установленную концентрацию (например, CXL/MRL или нижнюю границу определяемых содержаний).
Ложноотрицательный результат: результат, неверно указывающий на отсутствие анализируемого вещества или на то, что оно не превышает установленную концентрацию (например, CXL/MRL или нижнюю границу определяемых содержаний).
Обогащение: добавление анализируемых веществ в целях определения степени извлечения (также известной как «метод добавок»).
Идентификация: процесс однозначного определения химической идентичности всех или любого компонента определения остатка.
Исследуемый остаток: остаток, образующийся в продукте в результате определенного использования пестицида или потребления животным, или загрязнения окружающей среды в производственных условиях, в отличие от остатков, присутствующих вследствие лабораторного обогащения образцов.
Интерференция: внутренний или внешний отклик, не связанный с анализируемым веществом (например, шум) в результате воздействия электронных, химических или иных факторов, относящихся к инструментальным средствам, среде, методу или образцу.
Интерферент: химический или иной фактор, вызывающий интерференцию.
Внутренний стандарт (IS): химическое вещество, добавляемое в известном количестве в образцы и/или стандарты при химическом анализе, включая холостые пробы и калибровочные стандарты. Затем указанная субстанция может быть использована для калибровки путем построения графика соотношения сигнала анализируемого вещества к сигналу внутреннего стандарта в виде функции концентрации. Указанное соотношение для образцов впоследствии используется для получения концентраций анализируемого вещества. Используемый внутренний стандарт должен обеспечивать сигнал, в большинстве случаев сходный с сигналом анализируемого вещества, но существенно отличающийся таким образом, чтобы два сигнала были легко отличимы друг от друга.
Предел обнаружения (LOD): самая низкая концентрация или масса анализируемого вещества, которая может быть обнаружена (количество не определяется) в образце. На практике, это, как правило, концентрация анализируемого вещества, в которой среднее значение сигнала/шума составляет 3.
Предел количественного определения (LOQ): наименьшая концентрация анализируемого вещества, которая может быть выражена количественно. Он обычно определяется как минимальная концентрация анализируемого вещества в исследуемом образце, которая может быть определена с допустимой точностью (повторяемость) и правильностью согласно установленным условиям исследования. В целях применения настоящего документа под пределом количественного определения обычно понимается концентрация анализируемого вещества, в которой среднее значение сигнала/шума составляет 10. [См. также параграф 26].
Линейность: способность метода анализа в определенном диапазоне обеспечить инструментальную реакцию или результаты, пропорциональные количеству анализируемого вещества, которое должно быть определено в лабораторном образце. Руководство по аналитической терминологии (CAC/GL 72-2009).
Минимальный уровень калибровки (LCL): минимальная концентрация или (масса), которую система определения успешно калибрует в партии для анализа.
Минимальный валидированный уровень (LVL): минимальный валидированный уровень метода добавок, соответствующий критериям эффективности метода.
Матрица: материал или компонент (например, пищевой продукт), который был отобран для исследования остатков пестицидов.
Холостая матрица: образец или его часть, не содержащий определяемой концентрации соответствующих анализируемых веществ.
Эффект матрицы: воздействие одного или нескольких неустановленных компонентов образца на измерение концентрации анализируемого вещества или его массы.
Стандарты с согласованной матрицей: стандартизированные растворы, приготовленные в окончательных экстрактах холостых матриц, сходных с образцом.
Метаболит: компонент остатка пестицида, образующийся в продукте в результате биотической трансформации (метаболизма) пестицида в биологической системе (например, растение, животное).
Метод анализа множественных остатков пестицидов (MRM): метод, который позволяет определить большое количество соединений, как правило, относящихся к различным химическим классам.
Точность: степень вариативности измерения вокруг среднего значения.
Количественный метод: метод, позволяющий получить (определяющие) результаты в отношении концентрации анализируемого вещества с точностью и правильностью, которые соответствуют установленным критериям.
Степень извлечения: измеренное в процентах количество анализируемого вещества (анализируемых веществ) (на основании определения остатка), изначально добавленного в образец соответствующей матрицы, которая не содержит обнаруживаемого уровня анализируемого вещества или содержит известный обнаруживаемый уровень. Эксперименты в отношении степени извлечения предоставляют информацию о точности и правильности и, следовательно, о точности метода.
Относительное стандартное отклонение (RSD): стандартное отклонение, поделенное на абсолютное значение среднего арифметического значения, выраженное в процентах. Оно относится к точности метода (также известно как коэффициент вариаций, CV).
Повторяемость: точность, обычно выраженная как RSD, полученная в процессе одной и той же методики измерения или методики проведения исследования одним и тем же оператором, на одном и том же измерительном или испытательном оборудовании, используемом при одинаковых условиях, в одном и том же месте и через короткий промежуток времени. Руководство по аналитической терминологии (CAC/GL 72-2009).
Воспроизводимость: точность (обычно выраженная как RSD), исходя из условий наблюдений, когда результаты независимого исследования/измерений получены с использованием одной и той же методики и идентичных параметров испытания/измерения на различных испытательных или измерительных устройствах разными операторами, использующими разное оборудование. Руководство по аналитической терминологии (CAC/GL 72-2009).
Определение остатка: многообразие подлежащих анализу химических соединений, которое может включать в себя исходное соединение, метаболиты, изомеры, продукты реакции и/или продукты разложения. Определение остатка, как правило, осуществляется регулятивным органом.
Устойчивость: мера способности аналитической процедуры не подвергаться воздействию со стороны незначительных, но преднамеренных рядов в параметрах метода; обеспечивает указание на свою надежность во время обычного использования. Руководство по аналитической терминологии (CAC/GL 72-2009).
Подготовка образца: включает в себя извлечение анализируемого образца из пробы, его очистку и другие этапы получения раствора образца для анализа.
Скрининговый предел обнаружения (SDL): минимальный уровень обогащения, который имеет достоверность на уровне доверительной вероятности в 95%.
Метод скрининга: метод, который соответствует заранее определенным критериям для обнаружения наличия или отсутствия анализируемого вещества или класса анализируемых веществ на минимальном уровне соответствующей концентрации или выше указанного уровня.
Селективность: мера, в которой метод может определять конкретное анализируемое вещество/анализируемые вещества в смеси (смесях) или матрице (матрицах) при отсутствии интерференции с другими компонентами со сходным поведением. Руководство по аналитической терминологии (CAC/GL 72-2009).
Чувствительность: коэффициент изменения показания системы измерения и соответствующее изменение значения измеряемой величины. Руководство по аналитической терминологии (CAC/GL 72-2009).
SIM: контроль заданных ионов, методика масс-спектрометрического обнаружения.
Метод анализа единичного остатка пестицида: метод, который определяет единичное анализируемое вещество или небольшую группу анализируемых веществ со сходными физико-химическими свойствами.
Метод стандартной добавки: метод стандартной добавки является одним из видов количественного анализа, который иногда используется в аналитической химии, когда известное количество анализируемого вещества добавляется непосредственно к аликвотам окончательных экстрактов.
TOF: время пролета, методика обнаружения, используемая в масс-спектрометрии.
Правильность: степень соответствия между средним значением неограниченного числа повторно измеренных значений величины и эталонным значением величины. Руководство по аналитической терминологии (CAC/GL 72-2009).
Неопределенность: параметр, связанный с результатом измерения, который характеризует рассеяние значений, которые обоснованно могли быть приписаны измерению.