ОФС.1.7.1.0013.18. Общая фармакопейная статья. ДНК вакцины

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749)

(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание»)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ДНК вакцины	ОФС.1.7.1.0013.18 Вводится впервые

Биологические фармацевтические субстанции указанных препаратов получают с помощью культур охарактеризованных клеток, которыми могут быть бактерии, клетки млекопитающих (в этом случае их называют субстратом) и др. Требования к конкретной биологической фармацевтической субстанции и лекарственным препаратам на их основе должны быть изложены в соответствующих фармакопейных статьях или нормативной документации.

Должно быть доказано, что ДНК-вакцины обладают специфической активностью и безопасностью для человека, а их производство характеризуется постоянством.

Требования, приведенные в настоящей фармакопейной статье, могут быть дополнены или изменены в конкретной фармакопейной статье или нормативной документации с учетом специфических свойств лекарственного средства и технологии его производства. Необходимость замены или использования дополнительных требований для конкретного лекарственного средства должна быть обоснована. Общая фармакопейная статья не распространяется на вакцины на основе живого вирусного вектора и на препараты для генной терапии.

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Субстанция ДНК вакцин — это биологические лекарственные средства, представляющие собой бактериальные клетки с плазмидой или один вектор, как правило — вирусный вектор.

Рекомбинантный вектор — агент трансмиссии (молекулярно-генетическая конструкция; молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК), переносящий генетическую информацию от клетки одного вида другому, например плазмиды, вирусы.

Плазмида — внехромосомный фактор наследственности бактерий, кольцевая молекула ДНК, которая обладает способностью стабильно существовать в автономном (не связанном с хромосомой) состоянии в цитоплазме.

Плазмидный вектор — бактериальная плазмида, используемая для переноса гена или генов чужеродной ДНК в клетку хозяина (бактерию) и обеспечивающая размножение чужеродных генов в этих клетках.

Вирусный вектор — вектор, произведенный путем модификации вируса с помощью методов молекулярной биологии для удаления определенных и удерживания некоторых, но не всех, материнских генов вируса. При удалении генов, ответственных за способность вируса к репликации, созданный вектор является неспособным к репликации.

Посевной материал — это клетки, прошедшие, по крайней мере, такое же количество пассажей или меньше, что и клетки, использованные для производства препарата, пошедшего на клинические испытания.

ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ПРОИЗВОДСТВУ

Производство ДНК-вакцин должно соответствовать требованиям «ОФС „Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК“ и ОФС „Иммунобиологические лекарственные средства“. Оно должно быть основано на системе серий посевного материала и системе банков клеток для клеточного субстрата (Главный банк клеток (ГБК) и Рабочий банк клеток (РБК) согласно с ОФС „Требования к клеточным культурам — субстратам — производства биологических лекарственных препаратов“ и разделу данной ОФС „Бактериальные клетки, используемые в производстве плазмидных векторов“).»

РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВЕКТОРЫ

Все данные по конструированию вектора, включая происхождение вектора, последующие манипуляции с ним, в частности, удаление или модификацию участков вектора должны документироваться. Если применимо, должна быть описана очистка рекомбинантного вектора.

Оценка экспрессирующей конструкции (плазмидный или вирусный вектор) должна быть проведена в соответствии с требованиями ОФС «Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК» с учетом особенностей ДНК-вакцин. Должны быть указаны все установленные и непредвиденные рамки считывания. Методы, используемые для подтверждения включения гена в вектор или вектора в клетку хозяина, включают использование рестриктазного картирования, полимеразной цепной реакции, секвенирования полной последовательности ДНК, последнее является предпочтительным.

Допустимое количество пассажей вектора в готовом продукте или пересевов из главного посевного материала не должно превышать количества пассажей или пересевов, использованных для препаратов, эффективность и безопасность которых были установлены в клинических исследованиях.

Если в ДНК вакцине используется больше одного вектора, каждый вектор должен быть охарактеризован, как указано выше.

Все манипуляции с банками клеток и полученными культурами клеток должны проводиться в зоне, свободной от одновременной работы с другими клетками или векторами.

Бактериальные клетки, используемые в производстве плазмидных векторов

Получение плазмидных векторов основано на использовании системы банка бактериальных клеток, с получением и характеристикой главного банка клеток, рабочего банка клеток и посевного материала. Анализ проводится один раз для проверки каждого нового РБК, за исключением чистоты, которая проверяется при каждой ферментации. РБК получают путем культивирования клеток из одной или более ампул ГБК. Регистрируются методики и реактивы, использованные для получения банка, и условия хранения. ГБК и РБК должны иметь четко документированную историю их получения. Главные и рабочие банки клеток контролируются путем проведения испытаний на аликвоте хранящегося в банке материала или полученного путем субкультивирования банка клеток. В таблице приведены испытания, обязательные для проведения на определенных этапах производства.

Таблица

Количественное определение	Клетка-хозяин	Главный банк клеток	Рабочий банк клеток	Посевной клеточный материал <*>
Подлинность и чистота
Жизнеспособные клетки	+	+	+	+
Характеристики линии бактериальных клеток	+	+	-	+
Генотипирование/фенотипирование	+	+	-	+
Наличие плазмиды
Последовательность ДНК плазмиды	-	+	-	+
Количество копий	-	+	+	+
Рестрикционная карта	-	+	+	+
% клеток, содержащих плазмиды	+	+	+	+
Посторонние агенты
Посторонняя микрофлора	+	+	+	+
Присутствие бактериофагов	+	+	-	+

Испытания на подлинность и чистоту

Жизнеспособность клеток. Количество жизнеспособных клеток определяется методом серийных разведений аликвоты бактериальных клеток с высевом на адекватную плотную питательную среду (метод Коха) и подсчетом отдельных колоний.

Биологическая и биохимическая характеристики бактериального штамма. В зависимости от используемого в производстве штамма бактерий, проводится соответствующее определение биологических и биохимических свойств штамма для подтверждения его принадлежности к определенному виду.

Последовательность ДНК. Подтверждается полная нуклеотидная последовательность плазмиды.

Количество копий. Плазмидная ДНК выделяется и очищается из определенного количества бактерий, количество копий определяется с помощью пригодного для этого метода количественного ПЦР.

Рестрикционная карта. Рестриктазный анализ проводится с достаточным разрешением, позволяющим подтвердить, что структура плазмиды, находящаяся в бактериальной клетке, не повреждена.

Процент клеток, содержащих плазмиду. Селективные генетические маркеры плазмиды используются для определения процентного количества бактерий, содержащих плазмиду.

Испытания на посторонние агенты и бактериофаги

Посторонняя микрофлора. Посторонняя микрофлора должна отсутствовать. Испытуемый штамм высевают на соответствующую питательную среду методом штрихового посева и термостатируют в условиях, необходимых для обнаружения возможных бактериальных посторонних агентов. Для определения возможности ингибирования роста посторонних микроорганизмов лекарственным средством проводятся испытания в присутствии определенного количества контрольных бактерий (положительный контроль) (ОФС «Микробиологическая чистота»).

Наличие бактериофагов. Для выявления бактериофагов бактериальные клетки высевают на питательную среду, обеспечивающую рост и размножение бактериофагов и термостатируют при необходимой температуре в питательной среде, обеспечивающей рост и размножение бактериофагов. Пригодность испытания подтверждается путем использования референтной линии бактериофагов и чувствительных тест-штаммов бактерий. Посторонняя микрофлора и бактериофаги должны отсутствовать.

Все изменения технологического процесса после проведения доклинических, клинических исследований должны быть указаны в нормативной документации.

ИСПЫТАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ

Биологическую фармацевтическую субстанцию или конечный балк биологической фармацевтической субстанции для хранения, если препарат производится в непрерывном цикле (далее — субстанция или конечный балк) готовят из одной или нескольких партий очищенных векторов (плазмид, вирусов). В процессе приготовления субстанции или конечного балка могут быть внесены стабилизирующие агенты и другие вспомогательные вещества.

Для производства серии готового препарата может быть использована субстанция или конечный балк, удовлетворяющие требованиям спецификации на субстанцию или установленным для конечного балка (внутренняя спецификация). Если после добавления стабилизирующих агентов и вспомогательных веществ какой-либо показатель не может быть определен, его контроль должен проводиться на очищенном рекомбинантном векторе. Если балк и конечный продукт представляют собой один и тот же материал, испытания балка не требуются. При испытаниях балка должны использоваться стандартные методы с адекватной специфичностью и чувствительностью. Должен использоваться стандартный (референтный) образец для установления критериев пригодности методики (доказательства правильности и воспроизводимости методики). Должна быть оценена стабильность балка/конечного продукта.

Если субстанция представляет собой бактериальные генетически модифицированные клетки, проводят испытания, как указано в разделе «Бактериальные клетки, используемые в производстве плазмидных векторов».

Если субстанция представляет собой очищенный рекомбинантный вектор, необходимы следующие испытания:

Описание. Должно быть приведено описание субстанции.

Концентрация вектора (плазмиды, вируса). Должна быть указана концентрация ДНК. Концентрация ДНК выше 500 нг/мл может быть определена спектрофотометрическим методом путем измерения величины поглощения при 260 нм. Величина поглощения раствора двойной кольцевой ДНК в концентрации 50 мкг/мл составляет 1 (удельное поглощение 200). Содержание ДНК в концентрации менее 500 нг/мл определяется после инкубирования с флуоресцентным красителем, который избирательно связывается с двойной кольцевой ДНК и использованием стандартного образца ДНК для построения калибровочной кривой. Для определения плазмидной ДНК также может быть использована жидкостная хроматография с применением стандартного образца. В некоторых случаях используется капиллярный электрофорез.

Должно быть указано допустимое содержание плазмиды в суперскрученной конформации (предпочтительно — более 80%). Для количественного определения суперскрученных форм может быть использована высокоэффективная анионообменная жидкостная хроматография или капиллярный электрофорез. Капиллярный электрофорез также пригоден для количественного определения других форм. Для вирусного вектора должна быть указана концентрация инфекционных частиц. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография» и «Капиллярный электрофорез».

Подлинность. Испытания проводят с использованием стандартных образцов с помощью: рестриктазного анализа (если его возможности позволяют выявить возможные критические модификации в плазмиде и подтвердить ее подлинность), полимеразной цепной реакции, секвенированием нуклеотидной последовательности плазмиды/вектора. Выбор методов оценки подлинности должен быть обоснован и указан в фармакопейной статье или нормативной документации на субстанцию или при установлении требований к конечному балку. Если на одной производственной площадке производят различные ДНК вакцины, метод оценки подлинности должен быть способен однозначно идентифицировать каждую производимую плазмиду/вектор в присутствии остальных.

Специфическая активность. Оценивается эффективность трансфекции in vitro по транскрипции/трансляции кодируемых генов или in vivo по иммуногенности и/или другой целевой биологической активности. По возможности должны быть представлены доказательства того, что выбранный метод коррелирует с иммуногенностью или целевой (протективной) активностью в клинических исследованиях. Для этих целей требуется хорошо охарактеризованный репрезентативный стандартный образец. Обычно используют трансфекцию соответствующей линии клеток in vitro, с последующим измерением экспрессированного генетического материала по какой-либо функции, вместо оценки уровня экспрессии самого генетического материала. Может потребоваться проведение дополнительного определения активности с помощью метода вестерн-блот или твердофазного иммуноферментного анализа для оценки целостности и количества экспрессированного продукта. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Определение подлинности и чистоты иммунобиологических лекарственных препаратов методом вестерн-блот» и ОФС «Метод иммуноферментного анализа».

Микробиологическая чистота. Должны быть предусмотрены требования и испытания микробиологической чистоты субстанции (конечного балка) до стерилизующей фильтрации. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».

Стерильность. Субстанция (конечный балк) должны быть стерильными, если хранятся после стерилизующей фильтрации. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Стерильность».

Пирогенность. Оценивается по наличию/отсутствию пирогенных веществ. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность».

Бактериальные эндотоксины. Содержание должно соответствовать требованиям, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации на субстанцию или установленным требованиям на конкретный препарат, но не более 40 EU на 1 мг плазмиды. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Бактериальные эндотоксины».

Чистота. Проводится оценка посторонних примесей на стадии получения очищенной плазмиды, если анализ не может быть выполнен в субстанции (конечном балке).

Методы испытаний указывают в фармакопейной статье или нормативной документации. Выбор методов должен быть обоснован.

Тесты для определения содержания белков и ДНК/РНК клеток хозяина, а также иных посторонних примесей, связанных с процессом производства (бычий сывороточный альбумин, трансферин, инсулин, белок A, моноклональные антитела и другие примеси) проводятся на достаточном количестве партий очищенной плазмиды или серий субстанции (конечного балка) (не менее 5). Субстанция (конечный балк) должны выдерживать испытания на содержание остаточной ДНК (в расчете не более 10 нг на дозу) и белков штаммов-продуцентов (не более 1% от содержания плазмиды) в соответствии с требованиями, указанными в фармакопейной статье или нормативной документации на субстанцию, или указаниями требований к конечному балку. Должен быть указан способ расчета данных примесей в лекарственном препарате.

Остаточные белки клетки хозяина могут быть определены иммунохимическими методами (например, радиоиммунологическим, иммунохимическим).

Остаточная ДНК клеток хозяина может быть определена методом молекулярной гибридизации с зондами, меченными биотином, дигоксигенином или другой меткой, или методом ПЦР с охарактеризованным пределом обнаружения.

Для оценки посторонних примесей могут использоваться наборы реагентов после валидации методики.

Аномальная токсичность. Должна быть нетоксична. Испытание обязательно для фармацевтической субстанции, произведенной для реализации с целью введения в государственный реестр лекарственных средств и предназначенной для производства биологических лекарственных препаратов (БЛП) для парентерального применения. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность».

Требования к пробоподготовке препарата, тест-дозе в весовых, объемных или других единицах указывают в фармакопейной статье или нормативной документации.

Транспортирование и хранение. Контролируемые условия, обоснованные исследованиями по стабильности субстанции (конечного балка), а также стабильности приготовленного из них лекарственного средства, указывают в фармакопейной статье или нормативной документации на субстанцию или при указании требований к конечному балку в соответствии с ОФС «Фармацевтические субстанции» и ОФС «Хранение лекарственных средств».

ИСПЫТАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА

Методики, используемые для проведения испытаний, должны быть описаны максимально подробно с указанием квалификации реактивов, реагентов, лабораторного оборудования, приборов, требований к животным, штаммам микробов, культур клеток и т.д.

Показатели качества ДНК вакцин («Прозрачность», «Цветность», «Время восстановления препарата», «pH», «Извлекаемый объем», «Потеря в массе при высушивании» или «Вода», «Механические включения») лекарственных форм регламентируют согласно требованиям ОФС «Лекарственные формы» и ОФС на соответствующие лекарственные формы (раствор - ОФС «Растворы»; раствор, суспензия - ОФС «Лиофилизаты»), ОФС «Лекарственные средства для парентерального применения».

Описание. Лекарственные препараты в жидкой или восстановленной лиофилизированной лекарственной форме — прозрачные или слегка опалесцирующие бесцветные или с желтоватым оттенком растворы без видимых частиц, если нет других

Подлинность. Подтверждается с использованием стандартных образцов с помощью рестриктазного анализа (если его возможности позволяют выявить возможные критические модификации в плазмиде и подтвердить ее подлинность), полимеразной цепной реакции, секвенированием нуклеотидной последовательности плазмиды/вектора. Выбор методов оценки подлинности должен быть обоснован и указан в фармакопейной статье или нормативной документации на препарат. Если на одной производственной площадке производят различные ДНК вакцины, метод оценки подлинности должен быть способен однозначно идентифицировать каждую производимую плазмиду/вектор в присутствии остальных.

Концентрация вектора, его форма. Концентрация ДНК должна быть выше 500 нг/мл и может быть определена путем измерения величины поглощения при длине волны 260 нм. Величина поглощения раствора двойной кольцевой ДНК в концентрации 50 мкг/мл составляет 1 (удельное поглощение 200).

Содержание ДНК в концентрации менее 500 нг/мл определяется после инкубирования с флуоресцентным красителем, который избирательно связывается с двойной кольцевой ДНК и использованием стандартного образца ДНК для построения калибровочного графика. Для определения плазмидной ДНК также может быть использована жидкостная хроматография с применением стандартного образца. В некоторых случаях используется капиллярный электрофорез.

Должно быть указано допустимое количественное содержание плазмиды в суперскрученной конформации. Для количественного определения суперскрученных форм может быть использована высокоэффективная анионообменная жидкостная хроматография или капиллярный электрофорез. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография» и «Капиллярный электрофорез».

Капиллярный электрофорез также пригоден для количественного определения других форм. Для вирусного вектора должна быть указана концентрация инфекционных частиц. Могут быть использованы иные критерии, если представлены доказательства того, что они позволяют предсказать иммуногенность или другую биологическую активность.

Чистота. Посторонние примеси оценивают на стадии получения субстанции. В случае, если используемая для производства фармацевтическая субстанция не предназначена для реализации и включения в государственный реестр лекарственных средств РФ, испытания проводятся с использованием балка субстанции для хранения, в нормативной документации на лекарственный препарат приводится указание о гарантии качества ЛС по данному показателю. В спецификации на препарат, представляющий собой рекомбинантный вектор, должно быть указано, что производитель гарантирует, что содержание остаточной ДНК клеток хозяина не более 10 нг на дозу, содержание белков клеток хозяина — не более 1% от содержания плазмиды, содержание других примесей должно быть регламентировано и обеспечивать безопасность препарата. Должен быть указан способ расчета данных примесей в лекарственном препарате.

Специфическая активность. Определяют эффективность трансфекции in vitro по транскрипции/трансляции кодируемых генов или in vivo по иммуногенности и/или другой целевой биологической активности. По возможности должны быть представлены доказательства того, что выбранный метод коррелирует с иммуногенностью или другой целевой активностью в клинических исследованиях. Для этих целей требуется хорошо охарактеризованный репрезентативный стандартный образец, аттестованный в установленном порядке. Обычно используют трансфекцию соответствующей линии клеток in vitro, с последующим измерением экспрессированного генетического материала по какой-либо функции, вместо оценки уровня экспрессии самого генетического материала. Может потребоваться проведение дополнительного определения активности с помощью метода вестерн-блота или твердофазного иммуноферментного анализа для оценки целостности и количества экспрессированного продукта. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Определение подлинности и чистоты биологических лекарственных препаратов методом вестерн-блот» и «Метод иммуноферментного анализа».

Стерильность. Препарат должен быть стерильным. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Стерильность».

Пирогенность или бактериальные эндотоксины. Показатели должны соответствовать требованиям, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации. Определение проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность» или ОФС «Бактериальные эндотоксины». Требования к пробоподготовке препарата, тест-дозе в весовых, объемных или других единицах указывают в фармакопейной статье или нормативной документации.

Аномальная токсичность. Должен быть нетоксичным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность». Требования к пробоподготовке препарата, тест-дозе в весовых, объемных или других единицах указывают в фармакопейной статье или нормативной документации.

Вспомогательные вещества. При наличии в составе препарата вспомогательных веществ (стабилизаторы, консерванты и др.) методики их определения и допустимые пределы содержания указывают в фармакопейной статье или нормативной документации. Каждый определяемый показатель должен быть указан в самостоятельном разделе.

При введении в состав лекарственных препаратов антимикробных консервантов, метод их определения и критерии оценки их эффективности должны соответствовать требованиям ОФС «Определение эффективности антимикробных консервантов».

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты» и ОФС «Лекарственные формы для парентерального применения».

Транспортирование и хранение. В защищенном от света месте при температуре от 2 до 8 °C, не допускается замораживания, в соответствии с ОФС «Лекарственные формы для парентерального применения» и ОФС «Упаковка, маркировка и транспортирование лекарственных средств».

---