ФС.3.3.2.0015.18. Фармакопейная статья. Иммуноглобулин противосибиреязвенный из сыворотки крови лошади
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749)
(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том IV»)
Примечание
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/femb/pharmacopea.php по состоянию на 15.01.2019. В соответствии с Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749 данный документ введен в действие с 01.12.2018. Взамен ФС 42-3770-99.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
| Иммуноглобулин противосибиреязвенный из сыворотки крови лошади | ФС.3.3.2.0015.18 |
| Взамен ФС 42-3770-99 |
Настоящая фармакопейная статья распространяется на иммуноглобулин противосибиреязвенный лошадиный, раствор для внутримышечного введения, применяемый для экстренной профилактики и лечения сибирской язвы у людей.
Действующим началом препарата являются иммуноглобулины класса G лошади, обладающие антибактериальным действием против возбудителя сибирской язвы и антитоксическим действием против сибиреязвенного токсина.
Иммуноглобулин противосибиреязвенный лошадиный выпускается в комплекте с иммуноглобулином противосибиреязвенным лошадиным, разведенным 1:100.
Препараты иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного не содержат консервантов и антибиотиков.
Производство иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного должно осуществляться с соблюдением требований, указанных в ОФС «Иммуноглобулины и сыворотки (антитела) гетерологичные».
Для производства иммуноглобулина противосибиреязвенного используется сыворотка крови лошадей, иммунизированных вегетативными клетками штаммов Bacillus anthracis СТИ-1 и Ихтиман (КСМ-2-4) и сибиреязвенным экзотоксином штамма B. anthracis СТИ-1.
Штаммы должны иметь типичные культуральные, морфологические, биохимические и генетические свойства; обладать определенной остаточной вирулентностью, индексом иммунитета и специфической безопасностью для кроликов.
Описание. Прозрачная или слегка опалесцирующая, бесцветная или светло-желтого цвета жидкость. Определение проводят визуально.
Подлинность. Подтверждается наличием белков только сыворотки крови лошади. Испытание проводят методом иммуноэлектрофореза в геле с использованием сывороток против белков сыворотки крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи в соответствии с ОФС «Иммуноэлектрофорез в агаровом геле». Допустимо проведение испытания методом иммунодиффузии в геле в соответствии с ОФС «Иммунодиффузия в геле». В результате испытания должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против белков сыворотки крови лошади.
Прозрачность. Прозрачный или слегка опалесцирующий раствор с оптической плотностью не более 0,05 (определение проводят в соответствии с ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 540 нм).
Цветность. Бесцветный или светло-желтый раствор с оптической плотностью не более 0,15 (определение проводят в соответствии с ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 400 нм).
Механические включения. Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС «Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах».
Извлекаемый объем. Должен быть не менее номинального (не менее 10 мл). Определение проводят в соответствии с ОФС «Извлекаемый объем»
pH. От 7,0 до 7,4. Испытуемый образец разводят до 1% концентрации 0,9% раствором натрия хлорида. Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».
Белок. От 8% до 10%. Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Количественное определение белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом в препаратах крови человека и животных». Метод А.
Электрофоретическая однородность. Не менее 95% гамма- и бета-глобулинов, из них гамма-глобулинов — не менее 80%, альфа-глобулинов — не более 5%. Наличие альбумина не допускается. Определение проводят в соответствии с ОФС «Определение однородности лекарственных препаратов из сыворотки крови человека и животных методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы».
Молекулярные параметры. Содержание мономеров и димеров иммуноглобулина G должно быть не менее 85%, полимеров и агрегатов — не более 15%, фрагменты должны отсутствовать. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Определение молекулярных параметров иммуноглобулинов методом ВЭЖХ».
Термостабильность. Препарат должен оставаться жидким и не образовывать геля после выдерживания в водяной бане или водяном термостате при температуре (56 +/- 1) °C в течение 4 ч.
Стерильность. Должен быть стерильным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Стерильность».
Пирогенность. Должен быть апирогенным. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность» (тест-доза должна составлять 1,0 мл препарата на кг массы кролика).
Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность». Испытания проводят на 5 здоровых белых мышах массой тела 18 — 20 г и двух морских свинках массой тела 250 — 300 г. Тест-доза для белых мышей составляет 0,5 мл (внутрибрюшинно), для морских свинок — 5,0 мл (подкожно в оба бока по 2,5 мл). Период наблюдения за животными составляет 7 сут.
Специфическая активность. Препарат должен давать положительную реакцию диффузной преципитации (РДП) с сибиреязвенным цитоплазматическим антигеном (ЦПА) в разведении не менее 1:60. Должен защищать от гибели не менее 4 из 6 морских свинок при введении им 50 LD50 штамма B. anthracis 71/12.
1. Активность в РДП с сибиреязвенным ЦПА.
Приготовление сибиреязвенного ЦПА. В бульон Хоттингера pH 7,2 +/- 0,1 высевают споровую культуру штамма B. anthracis СТИ-1 из расчета не менее 20 млн живых спор в 1 мл (определение проводят в соответствии с ОФС «Определение концентрации микробных клеток») и инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч. В бульоне должен наблюдаться рост культуры у дна пробирки в виде ватных хлопьев и взвешенных комков, не должен вызывать помутнения среды. Полученную бульонную культуру по (9 +/- 1) мл высевают на один матрац с 3% агаром Хоттингера pH 7,2 +/- 0,1 с аминным азотом (2,2 +/- 0,2)%. Покачиванием матраца поверхность агара равномерно увлажняют бульонной культурой. Матрацы в вертикальном положении инкубируют в термостате при температуре (35,5 +/- 0,5) °C в течение 24 ч. Затем из матрацев удаляют остатки бульонной культуры и конденсата. Агаровую культуру смывают 50 мл 0,9% раствором натрия хлорида. Надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют стерильным 12% раствором натрия хлорида до концентрации (8,5 +/- 0,5) млрд клеток в 1 мл суспензии. Полученную суспензию выдерживают при температуре (21 +/- 1) °C в течение 10 сут при периодическом перемешивании. Для консервации к суспензии бактерий добавляют тиомерсал в концентрации 1:20000. Через 10 сут суспензию центрифугируют при 1000 g в течение 20 мин и надосадочную жидкость используют в качестве антигена.
Активность ЦПА определяют с иммуноглобулином противосибиреязвенным лошадиным, действующего срока годности. Титр ЦПА должен составлять не менее 1:8.
Приготовление 1/15 М фосфатного буферного раствора pH 7,2 — 7,3.
Приготовление 0,052 М раствора калия фосфорнокислого однозамещенного (KH2PO4). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 9,07 г калия фосфорнокислого однозамещенного, растворяют в воде очищенной, перемешивают, доводят объем раствора водой до метки и вновь перемешивают.
Приготовление 0,084 М раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного двуводного (Na2HPO4·2H2O). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 11,87 г натрия фосфорнокислого двузамещенного двуводного, растворяют в воде очищенной, перемешивают, доводят объем раствора водой до метки и вновь перемешивают.
В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 29,6 мл 0,052 М раствора калия фосфорнокислого однозамещенного, доводят объем раствора 0,084 М раствором натрия фосфорнокислого двузамещенного двуводного до метки и перемешивают.
Приготовление агарового геля. К 1 л фосфатного буферного раствора добавляют 15 г агара микробиологического, автоклавируют при температуре (115 +/- 2) °C в течение 15 мин и в горячем состоянии осветляют центрифугированием при 1000 g в течение 5 мин. Осветленный центрифугированием агар разливают слоем толщиной 6,0 мм в чашки Петри, помещенные на горизонтальную поверхность. После застывания агарового геля чашки Петри помещают в эксикатор, на дно которого наливают 100 мл воды очищенной и хранят при температуре от 2 до 8 °C не более 5 сут.
Определение активности препарата в РДП с сибиреязвенным ЦПА.
В слое агара специальным штампом-пробойником вырезают одну центральную и шесть радиальных лунок, расстояние между центрами которых, составляет 10 мм. Остатки агара из лунок удаляют с помощью вакуума. Готовят разведения испытываемого иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного 1:20, 1:40, 1:60, 1:80 до 1:100 и вносят в периферические лунки при помощи пипетки с тонким капилляром по 0,04 мл, начиная с разведения 1:100, в центральную лунку вносят сибиреязвенный ЦПА. В качестве контроля в шестую радиальную лунку вносят сыворотку лошадиную нормальную.
Чашки Петри выдерживают в эксикаторе, на дно которого наливают 100 мл очищенной воды, при температуре (20 +/- 2) °C в течение 48 ч.
Учет реакции проводят при косом освещении на темном фоне. Реакцию оценивают, как положительную при наличии четко выраженных линий преципитации между лунками с иммуноглобулином и сибиреязвенным ЦПА. Максимальное разведение иммуноглобулина, дающее видимую линию преципитации, считают его титром. С контрольным образцом (нормальной лошадиной сывороткой и сибиреязвенным ЦПА) линии преципитации должны отсутствовать.
2. Определение превентивных свойств на морских свинках.
Шести морским свинкам массой (275 +/- 25) г вводят подкожно в область внутренней поверхности бедра шприцем вместимостью 5,0 мл иммуноглобулин противосибиреязвенный лошадиный в объеме 2,0 мл. Через (23 +/- 1) ч иммунизированных животных, а также 3 контрольных неиммунизированных морских свинок, инфицируют подкожно дозой 50 LD50 тест-штамма B. anthracis 71/12 в 1,0 мл. За животными наблюдают в течение 10 суток. Контрольные животные должны погибнуть в течение 96 ч.
Для определения величины LD50 тест-штамма B. anthracis 71/12 для морских свинок берут животных обоего пола массой (275 +/- 25) г разделяют на пять групп, из расчета не менее четырех животных в каждой. Исходя из общей концентрации спор, определяемой по счету в камере Горяева, культуру тест-штамма B. anthracis 71/12 разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до концентраций 200000, 40000, 8000, 1600, 320 живых спор в 1,0 мл. Животным каждой группы под кожу внутренней поверхности правого бедра шприцем вместимостью 1,0 мл вводят по 0,5 мл соответствующего разведения тест-штамма.
Наблюдение за животными ведут в течение 10 сут. Павших морских свинок вскрывают в асептических условиях и делают мазки-отпечатки кусочков тканей легкого, сердца, печени и селезенки на 2,0% агар Хоттингера pH 7,2 +/- 0,1 в чашках Петри. Чашки помещают в термостат при температуре (36 +/- 1) °C и выдерживают в течение 48 ч.
Специфичность гибели животных подтверждают морфологией колоний штамма B. anthracis на агаре Хоттингера и при микроскопии мазков-отпечатков из органов животных, окрашенных по Граму. Тест-штамм B. anthracis 71/12 на чашках с агаром Хоттингера должен давать рост шероховатых матовых колоний в R- и реже в RO-формах, в мазках-отпечатках должны наблюдаться грамположительные палочки длиной 3 — 10 мкм, шириной 1,0 — 1,5 мкм, расположенные длинными цепочками.
Величину LD50 вычисляют по формуле:
lgLD_{50} = lgD_{N} - \sigma(\Sigma L_{i} - 0,5) ,
где: DN — максимальная из испытываемых величина дозы;
\sigma — логарифм отношения каждой последующей дозы к предыдущей (логарифм кратности разведения испытываемых доз);
Li — отношение числа животных, погибших от введения дозы, к общему числу животных, которым эта доза была введена;
i — индекс соответствует номеру дозы, если считать наименьшую из испытываемых доз первой;
\Sigma L_{i} — сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.
Растворители и реагенты, выпускаемые в комплекте с препаратом
Иммуноглобулин противосибиреязвенный лошадиный, разведенный 0,9% раствором натрия хлорида в соотношении 1:100.
Иммуноглобулин противосибиреязвенный лошадиный в разведении 1:100 предназначен для выявления индивидуальной чувствительности организма человека к лошадиному белку методом внутрикожной пробы.
Описание. Прозрачная бесцветная жидкость. Определение проводят визуально.
Прозрачность. Испытуемый раствор не должен отличаться по своей прозрачности от растворителя, используемого при его приготовлении. Определение проводят визуальным методом в соответствии с ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей».
Цветность. Бесцветный или светло-желтый раствор, не превышающий степень окраски эталона Y7. Определение проводят визуальным методом в соответствии с ОФС «Степень окраски жидкостей».
pH. От 7,0 до 7,4. Определяют потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».
Белок. От 0,08 до 0,10%. Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Количественное определение белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом в препаратах крови человека и животных» Метод Б.
Стерильность. Должен быть стерильным. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации с использованием тиогликолевой среды в соответствии с ОФС «Стерильность».
Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС «Лекарственные препараты из плазмы крови человека».
Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8 °C в соответствии с ОФС «Упаковка, маркировка и транспортирование лекарственных средств» и ОФС «Хранение лекарственных средств». Замораживание не допускается.