ОФС.1.8.2.0006.15. Общая фармакопейная статья. Определение молекулярных параметров иммуноглобулинов методом ВЭЖХ

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749)

(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II»)

Определение молекулярных параметров иммуноглобулинов методом ВЭЖХ	ОФС.1.8.2.0006.15

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), предназначенный для определения молекулярных параметров иммуноглобулинов. Механизм процесса эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии заключается в хроматографическом распределении молекул иммуноглобулинов в соответствии с их размером и молекулярными массами. Основные положения эксклюзионной ВЭЖХ указаны в ОФС «ВЭЖХ».

Метод эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии вводится взамен метода гель-фильтрации.

Метод эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии

Процесс эксклюзионной ВЭЖХ происходит в водной среде и называется гель-фильтрационным, в результате чего происходит распределение молекул иммуноглобулинов по их размеру в широком диапазоне молекулярных масс от 10 до 600 кДа. Особенностью метода эксклюзионной жидкостной ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (размером 3 — 5 мкм). Это позволяет быстро и полно разделять сложные смеси веществ.

Принципиальные основы метода заключаются в объеме эксклюзионной колонки, который можно выразить суммой трех слагаемых:

где: Vo — свободный объем подвижной фазы;

Vi — объем пор, заполненный подвижной фазой (объем неподвижной фазы);

Vd — объем матрицы сорбента без учета пор.

Полный объем подвижной фазы колонки (Vt) представляет собой сумму свободного объема подвижной фазы (Vo) и объема неподвижной фазы Vi.

Удерживание молекул в эксклюзионной колонке определяется вероятностью их диффузии в поры и зависит в основном от соотношения размеров молекул и пор. Коэффициент распределения (Kd) представляет собой отношение концентраций вещества в неподвижной (Ci) и подвижной фазах (Co): Kd = Ci/Co. Время удерживания молекул иммуноглобулинов зависит от силы взаимодействия вещества с подвижной и неподвижной фазами.

Анализ иммуноглобулинов проводят в соответствии с методиками, изложенными в фармакопейных статьях или нормативной документации, с указанием следующих необходимых параметров: пробоподготовки исследуемого образца; приготовления стандартных образцов; приготовления подвижной фазы. При описании требуемых хроматографических условий необходимо указать:

\cdot характеристику хроматографической колонки (ее марку (тип), размеры);

\cdot диапазон разделения молекулярных масс;

\cdot состав и название подвижной фазы;

\cdot наименование носителя (сорбента);

\cdot характеристику детектора;

\cdot длину волны;

\cdot объем вводимой пробы;

\cdot температуру колонки;

\cdot скорость потока подвижной фазы;

\cdot последовательность (порядок) ввода проб;

\cdot время хроматографирования.

В процессе разделения фракций иммуноглобулинов на хроматографической колонке белковые молекулы иммуноглобулина с молекулярной массой более 40 кДа свободно проходят между гранулами носителя (сорбента), не попадая и не задерживаясь в пористых гранулах. Более мелкие молекулы частично попадают и задерживаются в гранулах и медленнее вымываются из них подвижной фазой. Очень мелкие молекулы с молекулярной массой менее 50 кДа попадают в гранулы носителя и медленно вымываются подвижной фазой. Распределение по времени удерживания/выхода компонентов (фракций) иммуноглобулинов, о чем указывается в фармакопейных статьях или нормативной документации, происходит в порядке уменьшения их молекулярных масс: полимеры (агрегаты), димеры, мономеры Ig G (основная фракция сывороточного иммуноглобулина) и фрагменты Ig G.

Количественный анализ иммуноглобулинов состоит из следующих стадий: 1) хроматографическое разделение; 2) измерение площади и/или высоты пиков; 3) расчет количественного состава фракций иммуноглобулинов на основании хроматографических данных; 4) интерпретация полученных результатов (статистическая обработка данных).

Содержание компонентов (фракций) иммуноглобулинов вычисляется автоматически с помощью программного обеспечения счетно-аналитического прибора по площадям пиков и указывается в процентах. Процентное содержание определяемых компонентов иммуноглобулинов должно соответствовать требованиям, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации.

Пригодность хроматографической системы оценивается по стандартным образцам. Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются условия, описанные в фармакопейной статье или нормативной документации: фактор разрешения (R) между пиками, эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику с указанием числа теоретических тарелок, относительное стандартное отклонение площадей пиков.

Примечания

1. Испытуемый раствор. Образцы иммуноглобулина перед анализом разводят, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации.

2. Подвижная фаза. Подвижную фазу готовят в соответствии с методикой, изложенной в фармакопейной статье или нормативной документации.

3. Стандартные образцы:

• раствор для проверки пригодности хроматографической системы;
• маркеры для эксклюзионной ВЭЖХ с молекулярной массой в диапазоне от 10 до 600 кДа. Приготовление маркеров осуществляют в соответствии с инструкцией по применению или как описано в методике, изложенной в фармакопейной статье или нормативной документации.

---