МУК 4.2.3920-23. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Trichoderma harzianum 3/78 ВКПМ F-214, активной субстанции биопрепарата триходермикс в воздухе рабочей зоны. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 29.06.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 29.09.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 июня 2023 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ TRICHODERMA HARZIANUM 3/78 ВКПМ F-214, АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ БИОПРЕПАРАТА ТРИХОДЕРМИКС В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3920-23
Дата введения 29 сентября 2023 года
1. Разработаны ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 июня 2023 г.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации штамма Trichoderma harzianum 3/78 ВКПМ F-214 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА TRICHODERMA HARZIANUM 3/78 ВКПМ F-214
2.1. Штамм Trichoderma harzianum 3/78 <1> (далее — музейный штамм) является активной субстанцией биопрепарата Триходермикс, предназначенным для питания растений и регулирования плодородия почв, продуцируя ряд ферментов — целлюлаз, хитиназ, бета-глюканаз.
<1> Штамм Trichoderma harzianum 3/78 депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика под номером ВКПМ F-214.
2.2. Штамм Trichoderma harzianum 3/78 выделен из плодового тела шампиньона.
2.3. На агаризованной синтетической среде штамм на 3-е сутки образует колонии радиусом 5 — 6,5 см. На 4-е сутки после 12-часового пребывания на свету наблюдается обильный воздушный мицелий, после 48 часов на свету обильное серо-зеленое, затем темно-зеленое спороношение, сконцентрированное в центральной части колонии и концентрических кругах. При плюс 30 °C иногда заметен сладкий запах. Микроскопически конидиеносцы в очертании пирамидальные, с супротивными веточками в узлах, с мутовками 2 — 5 фиалид. Фиалиды фляговидные, 5 — 8,5 (16) x 3 — 4,5 мкм. Конидии бледно-зеленые, затем до темно-зеленых, почти шаровидные до яйцевидных, 2,5 — 4 x 2 — 3,5 мкм, гладкостенные. Телеоморфа неизвестна.
2.4. Оптимальной твердой средой для выращивания и размножения штамма служит агаризованная синтетическая среда (далее — АСС) следующего состава: аммоний фосфорнокислый двузамещенный — 10 г/дм3; калий фосфорнокислый двузамещенный — 10 г/дм3; магний сернокислый — 0,7 г/дм3; железо сернокислое — 12,5 мг/дм3; медь сернокислая — 3 мг/дм3; марганец сернокислый — 12,5 мг/дм3; цинк сернокислый — 3 мг/дм3; глюкоза — 10 г/дм3; pH 7,8 (в готовой среде pH 4,2). Плотную среду готовят, добавляя к указанной среде агар до 30 г/дм3.
2.5. Штамм Trichoderma harzianum 3/78 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека <2>. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.
<2> Согласно классификации микроорганизмов, приведенных в СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021 № 62500) (далее — СанПиН 3.3686-21).
III. ПРЕДЕЛЫ ИЗМЕРЕНИЙ
3.1. Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 КОЕ в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
IV. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЙ
4.1. Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны колониеобразующих клеток микроорганизма и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на агаризованной синтетической среде. При наличии в воздухе высоких концентраций штамма возможно использование седиментационного метода Коха.
V. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы, приведенные в таблицах 1 - 3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799 |
| Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг. | ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения плюс 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003 |
| Аспирационный бактериологический пробоотборник (со скоростью до 40 л/мин, расход регулируется по ротаметру, диаметр чашек Петри 90, 100, 120 мм, определение в диапазоне 25 — 10000 кл/м3) | - |
Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование аппаратуры и материалов | Обозначение и наименование документов |
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру плюс (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру плюс (28 +/- 2) °C и плюс (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060; ГОСТ Р 51935 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | - |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-908 |
| Петля бактериологическая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026 |
| Примечание: допускается применение устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
| Наименование реактивов и питательных сред | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206 |
| Аммоний фосфорнокислый двузамещенный (NH4)2HPO4 | ГОСТ 3772 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
| Глюкоза C6H12O6 | ГОСТ 6038 |
| Железо сернокислое 7-водное FeSO4 x 7H2O | ГОСТ 9485 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный K2HPO4 x 3H2O | ГОСТ 2493 |
| Магний сернокислый 7-водный MgSO4 x 7H2O | ГОСТ 4523 |
| Марганец сернокислый MnSO4 | ГОСТ 435 |
| Медь сернокислая 5-водная CuSO4 x 5H2O | ГОСТ 4165 |
| Цинк сернокислый 7-водный ZnSO4 | ГОСТ 4174 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652 или ГОСТ 18300 |
Примечание: допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.
VI. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
6.1. При выполнении измерений концентрации клеток микроорганизмов в воздухе рабочей зоны соблюдают законодательство в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения <3>.
<3> СанПиН 3.3686-21; ГОСТ 12.1.005 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны», утв. и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 29.09.1988 № 3388.
6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками <4> и инструкции по эксплуатации прибора.
<4> ГОСТ 12.1.019 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты», введен в действие Приказом Росстандарта от 07.11.2018 № 941-ст.
6.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VII. УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
7.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
| - температура воздуха | плюс (20 +/- 5) °C; |
|---|---|
| - атмосферное давление | 760 +/- 20 мм рт. ст.; |
| - влажность воздуха | не более 80%. |
VIII. ПРИГОТОВЛЕНИЕ АСС
8.1. Для приготовления АСС на 1,0 дм3 дистиллированной воды добавляют: аммоний фосфорнокислый двузамещенный — 10 г, калий фосфорнокислый двузамещенный — 10 г, магний сернокислый — 0,7 г, железо сернокислое — 12,5 мг, медь сернокислая — 3 мг, марганец сернокислый — 12,5 мг, цинк сернокислый — 3 мг и глюкозу — 10 г.
8.2. Плотную среду готовят, добавляя к указанной среде агар до 30 г/дм3 и, помешивая, нагревают до полного растворения агара. В готовой среде pH 4,2.
8.3. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 200 — 250 см3 и автоклавируют при плюс 120 °C в течение 15 — 20 мин.
8.4. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше плюс 8 °C в течение 10 дней, не более.
IX. ПРОВЕДЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЯ
9.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с МУК 4.2.1054-01 и ГОСТ 8.563-09.
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Время и скорость отбора проб воздуха
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2 Выполнение анализа.
9.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (АСС) расплавляют, остужают до плюс 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.
9.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методами контроля <5>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре плюс (2 — 8) °C не более 10 дней.
<5> Пункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред», утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008 (далее - МУК 4.2.2316-08).
9.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри культивируют при температуре плюс 28 +/- 2 °C. Через 1 — 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
9.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с ростовыми свойствами питательных сред <6>. Для этого музейный штамм Trichoderma harzianum 3/78 ВКПМ F-214 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
<6> МУК 4.2.2316-08.
9.2.5. Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
X. ВЫЧИСЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ
10.1 Расчет концентрации клеток производят по формуле:
\text{К } = \frac{\text{П } \times 1000}{\text{С } \times T} , (1)
где: К — концентрация штамма в воздухе, КОЕ/м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета дм3 на м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, дм3/мин;
XI. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, приведенным в приложении к настоящим МУК.
ПРИМЕР ОФОРМЛЕНИЯ ПРОТОКОЛА N КОЛИЧЕСТВЕННОГО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА TRICHODERMA HARZIANUM ШТ. 3/78 ВКПМ F-214 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
1. <a id="p100193"></a>Дата проведения анализа ____________________________________________
2. <a id="p100194"></a>Рабочее место (профессия работающего) ______________________________
3. <a id="p100195"></a>Место отбора пробы (название и адрес организации, производство,
технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________
3. <a id="p100196"></a>Вид пробоотборника _________________________________________________
4. <a id="p100197"></a>Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора
проб ______________________________________________________________________
5. <a id="p100198"></a>Питательная среда, время инкубации _________________________________
6. <a id="p100199"></a>Результаты испытания ростовых свойств питательной
среды _____________________________________________________________________
7. <a id="p100200"></a>Количественная и качественная характеристика выросших колоний
(количество типичных колоний) _____________________________________________
8. <a id="p100201"></a>Результаты идентификации микроорганизмов Trichoderma harzianum
шт. 3/78 (морфологические признаки) _______________________________________
9. <a id="p100202"></a>Результаты расчета концентрации штамма _____________________________
11. <a id="p100204"></a>Отбор пробы произведен (ФИО, должность, дата, подпись)
12. <a id="p100205"></a>Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (ФИО,
должность, дата, подпись) _________________________________________________