МУК 4.2.3916-23. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации активной субстанции препарата Ловчий, СП в воздухе рабочей зоны. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 29.06.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 29.09.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 июня 2023 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ ПРЕПАРАТА ЛОВЧИЙ, СП В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3916-23
Дата введения 29 сентября 2023 года
1. Разработаны ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 июня 2023 г.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации препарата Ловчий, СП в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТА ЛОВЧИЙ, СП
2.1. Микробиологический препарат Ловчий, СП характеризуется широким спектром действия в отношении вредных растительноядных насекомых, клещей и нематод и обладает контактным действием на них. Агрегатное состояние препарата — желтый порошок с грибным запахом. Действующее начало: Beauveria bassiana, штамм BBK-1R3 — 10%, Cordyceps farinosa, штамм PCo34-13 — 10%, Akanthomyces muscarius, штамм Hov-S16 — 10%, Metarhizium anisopliae, штамм CMn-S17 — 10% (по массе) <1> (далее — музейные штаммы). Наполнитель: автолизат дрожжей — 60%. Штаммы грибов выделены из тела мертвых растительноядных беспозвоночных животных.
<1> Штаммы грибов депонированы во Всероссийской коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) имени Г.К. Скрябина РАН.
2.2. Колонии Beauveria bassiana, шт. BBK-1R3 на модифицированной среде Чапека агаризованной (агар 2,4%) с сахарозой (3%), пептоном сухим мясным ферментативным (0,5%) и дрожжевым экстрактом (0,5%), pH 6,2 +/- 0,2 при культивировании при плюс 26 °C через 15 суток могут достигать диаметра 70 — 75 мм и высоты 2 — 4 мм, имеют довольно плоскую рельефную поверхность, на которой в разных местах могут встречаться небольшие капли желтоватого или розоватого экссудата. В центре колоний небольшой (5 — 8 мм) более пушистый валик, характерна едва намечающаяся радиальная складчатость, обратная сторона колоний желтоватая, мицелий войлочно-ватный, белый или слегка желтоватый.
2.3. Колонии Cordyceps farinosa шт. PCo34-13 на модифицированной среде Чапека при культивировании при плюс 26 °C через 15 суток достигают диаметра 68 — 75 мм. Мицелий поднимается на высоту от поверхности среды на 3 — 5 мм, белый или слегка желтоватый, ватно-войлочный, по краям колонии шерстистый, в центре слабо-бугристый, со слегка выраженной редкой радиальной складчатостью. Поверх мицелия образуется белый меловидный налет конидиального спороношения. Нижняя сторона колоний в центральной части (25 — 40 мм) окрашена пигментом, выделяемым грибом, в палево-терракотовый цвет.
2.4. Колонии Akanthomyces muscarius, шт. Hov-S16 на модифицированной среде Чапека при культивировании при плюс 26 °C через 15 суток достигают диаметра 43 — 48 мм и высоты 2 — 5 мм. Мицелий белый или слегка желтоватый, ватный, слабо-бугристый, в центре с небольшим валиком, с едва намечающейся радиальной складчатостью, нижняя сторона колоний желтая, наиболее интенсивно окраска выражена в центральной части. В толще агаризованной среды образуются восьмигранные кристаллы. Октаэдрические кристаллы обычно встречаются в культуре.
2.5. Колонии Metarhizium anisopliae, шт. CMn-S17 на модифицированной среде Чапека при культивировании при плюс 26 °C через 15 суток достигают диаметра 62 — 68 мм и высоты 2 — 4 мм. Мицелий белый или слегка желтоватый, ватно-войлочный, слабо-бугристый, с радиальной, но не сильной складчатостью. Поверх мицелия образуется концентрическими кольцами, полукольцами, в виде радиальных пятен или беспорядочно порошащий слой различных оттенков от светло-зеленого до болотного цвета конидиального спороношения. Нижняя сторона колоний имеет радиальную складчатость, окрашена в коричневатые тона, по краю окраска бледно-желтая.
2.4. Штаммы энтомофильных грибов не являются патогенными для животных и человека <2>. Работа с ними не требует специальных мер предосторожности.
<2> Согласно классификации микроорганизмов, приведенных в СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021 № 62500) (далее — СанПиН 3.3686-21).
III. ПРЕДЕЛЫ ИЗМЕРЕНИИ
3.1. Методика обеспечивает выполнения измерений количества спор грибов в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 КОЕ в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
IV. МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЙ
4.1. Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны спор грибов и подсчета общего количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на модифицированной агаризованной среде Чапека. При наличии в воздухе высоких концентраций штаммов возможно использование седиментационного метода Коха.
V. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы, приведенные в таблицах 1 - 3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799 |
| Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения плюс 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003 |
| Аспирационный бактериологический пробоотборник (со скоростью до 40 л/мин, расход регулируется по ротаметру, диаметр чашек Петри 90, 100, 120 мм, определение в диапазоне 25 — 10000 кл/м3) | - |
Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование аппаратуры и материалов | Обозначение и наименование документов |
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру плюс (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру плюс (28 +/- 2) °C и плюс (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060; ГОСТ Р 51935 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | - |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-908 |
| Петля бактериологическая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026 |
| Примечание: допускается применение устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
| Наименование реактивов и питательных сред | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
| Дрожжевой экстракт, сухой | ГОСТ 17206 |
| Железо сернокислое Fe2SO4 | ГОСТ 6981 |
| Калий азотнокислый KNO3 | ГОСТ 4217 |
| Калий фосфорнокислый 1-замещенный KH2PO4 | ГОСТ 4198 |
| Магний сернокислый 7-водный MgSO4·7H2O | ГОСТ 4523 |
| Пептон сухой ферментативный | ГОСТ 13805 |
| Сахароза | ГОСТ 5833 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652 или ГОСТ 18300 |
| Хлорид натрия NaCl | ГОСТ Р 51574 |
Примечание: допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.
VI. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
6.1. При выполнении измерений концентрации клеток микроорганизмов в воздухе рабочей зоны соблюдают законодательство в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения <3>.
<3> СанПиН 3.3686-21; ГОСТ 12.1.005 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны», утв. и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 29.09.1988 № 3388.
6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками <4> и инструкции по эксплуатации прибора.
<4> ГОСТ 12.1.019 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты», введен в действие Приказом Росстандарта от 07.11.2018 № 941-ст.
6.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VII. УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
7.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
| - температура воздуха | плюс (20 +/- 5) °C; |
|---|---|
| - атмосферное давление | 760 +/- 20 мм рт. ст.; |
| - влажность воздуха | не более 80%. |
VIII. ПРИГОТОВЛЕНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОЙ СРЕДЫ ЧАПЕКА
8.1. Для приготовления модифицированной среды Чапека используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1000 см3): KNO3 (калий азотнокислый) — 3 г, KH2PO4 (калий фосфорнокислый 1-замещенный) — 1 г, MgSO4·7H2O (магний сернокислый 7-водный) — 0,7 г, NaCl (натрия хлорид) — 5 г, FeSO4 (железо сернокислое) — 0,01 г, пептон сухой ферментативный — 5 г, дрожжевой экстракт — 5 г, сахароза — 30 г, агар-агар микробиологический порошковый — 24 г, дистиллированная вода — до 1000 см3.
8.2. Сухие компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.
8.3. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 200 — 250 см3 и автоклавируют при плюс 121 °C в течение 15 — 30 мин.
8.4. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше плюс 8 °C в течение 10 дней не более.
IX. ПРОВЕДЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЯ
9.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с МУК 4.2.1054-01 и ГОСТ 8.563-09.
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Время и скорость отбора проб воздуха
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2 Выполнение анализа.
9.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (модифицированная среда Чапека) расплавляют, остужают до плюс 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.
9.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методами контроля <5>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре плюс (2 — 8) °C не более 10 дней.
<5> Пункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред», утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008 (далее - МУК 4.2.2316-08).
9.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой плюс 28 +/- 2 °C. Через 10 — 15 суток производят подсчет общего количества выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
9.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с ростовыми свойствами питательных сред <6>. Для этого музейные штаммы грибов высеваются на 2 — 3 чашки используемой среды.
<6> МУК 4.2.2316-08.
9.2.5. Лиофилизованную культуру музейных штаммов необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери ими заданных ростовых свойств.
X. ВЫЧИСЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ
10.1 Расчет концентрации штаммов грибов производят по формуле:
\text{К } = \frac{\text{П } \times 1000}{\text{С } \times \text{Т}} , (1)
где: К — концентрация штаммов в воздухе, КОЕ/м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета дм3 на м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, дм3/мин;
XI. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, приведенным в приложении к настоящим МУК.
ПРИМЕР ОФОРМЛЕНИЯ ПРОТОКОЛА N КОЛИЧЕСТВЕННОГО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ПРЕПАРАТА ЛОВЧИЙ, СП В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
1. <a id="p100194"></a>Дата проведения анализа ____________________________________________
2. <a id="p100195"></a>Рабочее место (профессия работающего) ______________________________
3. <a id="p100196"></a>Место отбора пробы (название и адрес организации, производство,
технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________
4. <a id="p100197"></a>Вид пробоотборника _________________________________________________
5. <a id="p100198"></a>Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб
6. <a id="p100199"></a>Питательная среда, время инкубации _________________________________
7. <a id="p100200"></a>Результаты испытания ростовых свойств питательной среды
8. <a id="p100201"></a>Количественная и качественная характеристика выросших колоний
(количество типичных колоний) _____________________________________________
9. <a id="p100202"></a>Результаты идентификации штаммов грибов (микроморфологические
признаки) _________________________________________________________________
10. <a id="p100203"></a>Результаты расчета концентрации штаммов ___________________________
12. <a id="p100205"></a>Отбор пробы произведен (ФИО, должность, дата, подпись)
13. <a id="p100206"></a>Идентификация штаммов и расчет концентрации произведены (ФИО,
должность, дата, подпись) _________________________________________________