МУК 4.2.3888-23. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации активной субстанции препарата Фитоспорин ПроБио штамма Bacillus subtilis 3Н ВКПМ B-12758 в воздухе рабочей зоны. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 28.06.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 28.09.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 28 июня 2023 года
Дата введения 28 сентября 2023 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ ПРЕПАРАТА ФИТОСПОРИН ПРОБИО ШТАММА BACILLUS SUBTILIS 3Н ВКПМ B-12758 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3888-23
1. Разработаны ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 июня 2023 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации активной субстанции препарата Фитоспорин ПроБио штамма B. subtilis 3Н ВКПМ B-12758 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 Методические указания носят рекомендательный характер.
II. Биологическая характеристика штамма B. Subtilis ВКПМ B-12758 и его гигиенический норматив в воздухе рабочей зоны
2.1. Штамм B. subtilis 3Н ВКПМ B-12758 <1> (далее — музейный штамм) предполагается использовать в промышленном производстве микробиологического удобрения Фитоспорин ПроБио. Штамм обладает антагонистической активностью в отношении широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: подавляет рост стафилококков, протея, патогенной кишечной палочки, сальмонелл, шигелл, стрептококков, синегнойной палочки и дрожжевых грибов.
<1> Штамм B. subtilis 3Н депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика под номером ВКПМ B-12758.
2.2. Штамм B. subtilis 3Н ВКПМ B-12758 получен в результате селекции из штамма Bacillus subtilis 534 (основа препарата-пробиотика Споробактерин).
2.3. При культивировании на мясо-пептонном агаре (МПА), на солевом отрубном агаре (СОА) и лизогенной среде (англ. lysogeny broth, далее — LB-среде) при температуре плюс 37 °C в течение 24 — 36 часов образуются шероховатые колонии беловато-бежевого цвета. Штамм представляет собой грамположительные аэробные палочки, образующие эндоспоры. Штамм устойчив к антибиотику рифампицину.
2.4. Штамм B. subtilis 3Н ВКПМ B-12758 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека <2>. Работа со штаммом B. subtilis 3Н ВКПМ B-12758 не требует специальных мер предосторожности.
<2> Согласно классификации микроорганизмов, приведенных в СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021 № 62500) (далее — СанПиН 3.3686-21).
III. Пределы измерений
3.1. Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
IV. Методы измерений
4.1. Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток микроорганизма и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на LB-среде с добавлением антибиотика рифампицина в концентрации 20 мкг/мл. При наличии в воздухе высоких концентраций штамма возможно использование седиментационного метода Коха.
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 1 - 3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799 |
| Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003 |
| Аспирационный бактериологический пробоотборник (со скоростью до 40 л/мин, расход регулируется по ротаметру, диаметр чашек Петри 90, 100, 120 мм, определение в диапазоне 25 — 10000 кл/м3) | - |
Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование аппаратуры и материалов | Обозначение и наименование документов |
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060; ГОСТ Р 51935 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | - |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-908 |
| Петля бактериологическая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026 |
| Примечание: допускается использование устройств и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
| Наименование реактивов и питательных сред | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206 |
| Ацетонитрил CH3CN, CAS 75-05-8 | ТУ 6-09-5497 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
| Дрожжевой экстракт, сухой | ГОСТ 17206 |
| Пептон сухой ферментативный | ГОСТ 13805 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652 или ГОСТ 18300 |
| Хлорид натрия NaCl | ГОСТ Р 51574 |
Примечание: допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений концентрации клеток микроорганизма воздухе рабочей зоны соблюдают законодательство в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения <3>.
6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованным бактерицидными лампами.
6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VII. Условия измерений
7.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
| - температура воздуха | плюс (20 +/- 5) °C; |
|---|---|
| - атмосферное давление | 760 +/- 20 мм рт. ст.; |
| - влажность воздуха | не более 80%. |
VIII. Приготовление LB-агара
8.1. Для приготовления LB-агара используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1000 см3): триптон — 10,0 г, хлорид натрия — 10,0 г, дрожжевой экстракт — 5,0 г, агар-агар — 20,0 г, дистиллированная вода — до 1000 см3.
8.2. Сухие компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.
8.3. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при плюс 121 °C в течение 15 мин.
8.4. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше плюс 8 °C в течение 10 дней не более.
IX. Проведение измерения
9.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с МУК 4.2.1054-01 и ГОСТ 8.563 09.
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Время и скорость отбора проб воздуха
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96% этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с Инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2 Выполнение анализа.
9.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (LB-среда) расплавляют, остужают до плюс 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри. Для дифференцировки штамма и устранения посторонней микрофлоры в среду добавляют, тщательно перемешивая, антибиотик рифампицин в дозе 20 мкг/мл (ex tempore 0,2 — 0,3 мл 0,2% раствора антибиотика в ацетонитриле в каждую чашку Петри с агаризованной средой).
9.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре плюс 2 — 8 °C не более 10 дней.
9.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой плюс (37 +/- 2) °C. Через 1 — 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
9.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого музейный штамм Bacillus subtilis 3Н ВКПМ B-12758 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
9.2.5. Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
X. Вычисление результатов измерения
10.1 Расчет концентрации клеток производят по формуле:
\text{К } = \frac{\text{П } \times 1000}{\text{С } \times \text{Т}} ,
где: К — концентрация штамма в воздухе, клеток/м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета дм3 в м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, дм3/мин;
XI. Оформление результатов измерений
11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, приведенным в приложении к МУК.
Пример оформления протокола N ___ количественного микробиологического анализа активной субстанции препарата Фитоспорин ПроБио штамма Bacillus subtilis 3Н ВКПМ B-12758 в воздухе рабочей зоны
1. Дата проведения анализа _____________________________________
2. Рабочее место (профессия работающего) _______________________
3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) ___________
4. Вид пробоотборника _________________________________________
5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб _________________________________________________________________
6. Питательная среда, время инкубации ___________________________
7. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды _______
8. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) _______________________________________
9. Результаты идентификации микроорганизмов Bacillus subtilis 3Н ВКПМ B-12758 (микроморфологические признаки) ________________________
10. Результаты расчета концентрации штамма _____________________
11. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКр.з. _________
12. Отбор пробы произведен (ФИО, должность, дата, подпись) _______
13. Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (ФИО, должность, дата, подпись) _____________________________________
| ББК 51.242 |
|---|