МУК 4.2.3887-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus subtilis 3Н ВКПМ B-12758 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 28.06.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 28.09.2024.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 28 июня 2023 года
Дата введения 28 сентября 2024 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ BACILLUS SUBTILIS 3Н ВКПМ B-12758 В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ ГОРОДСКИХ И СЕЛЬСКИХ ПОСЕЛЕНИЙ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3887-23
1. Разработаны ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 июня 2023 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации B. subtilis 3Н ВКПМ B-12758 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 Методические указания носят рекомендательный характер.
II. Биологическая характеристика штамма Bacillus subtilis 3Н ВКПМ B-12758 и его гигиенический норматив в атмосферном воздухе городских и сельских поселений
2.1. Штамм B. subtilis 3Н ВКПМ B-12758 <1> (далее — музейный штамм) предполагается использовать в промышленном производстве микробиологического удобрения Фитоспорин ПроБио. Штамм обладает антагонистической активностью в отношении широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: подавляет рост стафилококков, протея, патогенной кишечной палочки, сальмонелл, шигелл, стрептококков, синегнойной палочки и дрожжевых грибов.
<1> Штамм B. subtilis 3Н депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика под номером ВКПМ B-12758.
2.2. Штамм B. subtilis 3Н ВКПМ B-12758 получен в результате селекции из штамма Bacillus subtilis 534 (основа препарата-пробиотика Споробактерин).
2.3. При культивировании на мясо-пептонном агаре (МПА), на солевом отрубном агаре (СОА) и лизогенной среде (англ. lysogeny broth, далее — LB-среде) при температуре плюс 37 °C в течение 24 — 36 часов образуются шероховатые колонии беловато-бежевого цвета. Штамм представляет собой грамположительные аэробные палочки, образующие эндоспоры. Штамм устойчив к антибиотику рифампицину.
2.4. Штамм B. subtilis 3Н ВКПМ B-12758 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека <2>. Работа со штаммом B. subtilis 3Н ВКПМ B-12758 не требует специальных мер предосторожности.
<2> Согласно классификации микроорганизмов, приведенных в СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021 № 62500) (далее — СанПиН 3.3686-21).
III. Пределы измерений
3.1. Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
IV. Методы измерений
4.1. Метод основан на аспирации из атмосферного воздуха клеток микроорганизма и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на LB-среде с добавлением антибиотика рифампицина в концентрации 20 мкг/мл.
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 1 - 3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799 |
| Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003 |
| Аспирационный бактериологический пробоотборник (со скоростью до 40 л/мин, расход регулируется по ротаметру, диаметр чашек Петри 90, 100, 120 мм, определение в диапазоне 25 — 10000 кл/м3) | - |
Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование аппаратуры и материалов | Обозначение и наименование документов |
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060; ГОСТ Р 51935 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | - |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-908 |
| Петля бактериологическая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026 |
| Примечание: допускается использование устройств и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
| Наименование реактивов и питательных сред | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206 |
| Ацетонитрил CH3CN, CAS 75-05-8 | ТУ 6-09-5497 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
| Дрожжевой экстракт, сухой | ГОСТ 17206 |
| Пептон сухой ферментативный | ГОСТ 13805 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652 или ГОСТ 18300 |
| Хлорид натрия NaCl | ГОСТ Р 51574 |
Примечание: допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений концентрации клеток микроорганизма в атмосферном воздухе городских и сельских поселений соблюдают законодательство в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения <3>.
6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованным бактерицидными лампами.
6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VII. Условия измерений
7.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
- температура воздуха плюс (20 +/- 5) °C;
- атмосферное давление 760 +/- 20 мм рт. ст.;
- влажность воздуха не более 80%
VIII. Приготовление LB-агара
8.1. Для приготовления LB-агара используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1000 см3): триптон — 10,0 г, хлорид натрия — 10,0 г, дрожжевой экстракт — 5,0 г, агар-агар — 20,0 г, дистиллированная вода — до 1000 см3.
8.2. Сухие компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.
8.3. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при плюс 121 °C в течение 15 мин.
8.4. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше плюс 8 °C в течение 10 дней не более.
IX. Проведение измерения
9.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с МУК 4.2.1054-01 и ГОСТ 8.563 09.
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Время и скорость отбора проб воздуха
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96% этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с Инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2 Выполнение анализа.
9.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (LB-среда) расплавляют, остужают до плюс 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри. Для дифференцировки штамма и устранения посторонней микрофлоры в среду добавляют, тщательно перемешивая, антибиотик рифампицин в дозе 20 мкг/мл (ex tempore 0,2 — 0,3 мл 0,2% раствора антибиотика в ацетонитриле в каждую чашку Петри с агаризованной средой).
9.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре плюс 2 — 8 °C не более 10 дней.
9.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой плюс (37 +/- 2) °C. Через 1 — 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
9.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого музейный штамм Bacillus subtilis 3Н ВКПМ B-12758 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
9.2.5. Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
X. Вычисление результатов измерения
10.1 Расчет концентрации клеток производят по формуле:
\text{К } = \frac{\text{П } \times 1000}{\text{С } \times \text{Т}} ,
где: К — концентрация штамма в воздухе, клеток/м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета дм3 в м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, дм3/мин;
XI. Оформление результатов измерений
11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, приведенным в приложении к МУК.
Пример оформления протокола № количественного микробиологического анализа штамма Bacillus subtilis 3Н ВКПМ B-12758 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений.
1. Дата проведения анализа _____________________________________
2. Рабочее место (профессия работающего) ________________________
3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) ___________
4. Вид пробоотборника _________________________________________
5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб _________________________________________________________________
6. Питательная среда, время инкубации ___________________________
7. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды _______
8. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) _______________________________________
9. Результаты идентификации микроорганизмов Bacillus subtilis 3Н ВКПМ B-12758 (микроморфологические признаки) ________________________
10. Результаты расчета концентрации штамма _____________________
11. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКа.в. ________
12. Отбор пробы произведен (ФИО, должность, дата, подпись) _______
13. Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (ФИО, должность, дата, подпись) _____________________________________
| ББК 51.214+51.242 |
|---|