МУК 4.2.3599-20. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Pichia pastoris (Komagataella kurtzmanii) БРЦ ВКПМ Y-4465 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 03.07.2020)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 3 июля 2020 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ PICHIA PASTORIS (KOMAGATAELLA KURTZMANII) БРЦ ВКПМ Y-4465 В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ ГОРОДСКИХ И СЕЛЬСКИХ ПОСЕЛЕНИЙ
Методические указания МУК 4.2.3599-20
Методические указания разработаны ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).
I. Назначение и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Pichia pastoris (Komagataella kurtzmanii) БРЦ ВКПМ Y-4465 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль микробиологического загрязнения воздушной среды, а также санитарных лабораторий биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий, научно-исследовательских организаций, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на проведение микробиологических исследований.
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. Биологическая характеристика штамма Pichia pastoris БРЦ ВКПМ Y-4465 и его гигиенический норматив в атмосферном воздухе городских и сельских поселений
2.1. Штамм Pichia pastoris БРЦ ВКПМ Y-4465 <1>, который получен трансформацией фрагмента ДНК, включающего ген, кодирующий \beta - \text{глюканазу} , предполагается использовать в промышленном производстве фермента \beta - \text{глюканазы} для кормовых целей.
<1> Штамм Pichia pastoris депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика под номером БРЦ ВКПМ Y-4465.
При культивировании при температуре 28 °C в течение 48 часов на глюкозо-пептон-дрожжевом агаре (далее — YPD) клетки штамма диаметром 3 — 4 мкм имеют овальную форму. Клетки почкуются, истинного мицелия не образуют.
На агаризованной среде YPD — колонии светло-бежевого цвета, с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.
При росте штамма в жидкой среде YPD при 28 °C в течение 24 ч жидкость становится мутной, появляется белый осадок, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок штамм не образует.
Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (г/1000 см3): хлорид калия — 1,0, ацетат натрия — 0,5, глюкоза — 1,0, агар — 2,0, вода — 95,5. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспоры.
Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях. В качестве единственного источника углерода способен использовать метанол, этанол, глюкозу, глицерин, лактат, сукцинат, не способен ассимилировать мальтозу, сахарозу, ацетат, крахмал, лактозу. Штамм не способен к росту при 35 °C. Штамм не способен к ассимиляции трегалозы.
Штамм Pichia pastoris БРЦ ВКПМ Y-4465 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека <2>. Работа со штаммом Pichia pastoris БРЦ ВКПМ Y-4465 не требует специальных мер предосторожности.
<2> Согласно классификации микроорганизмов, приведенной в санитарно-эпидемиологических правилах СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (далее — СП 1.3.2322-08).
III. Пределы измерений
3.1. Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
IV. Методы измерений
4.1. Метод основан на аспирации из атмосферного воздуха городских и сельских поселений клеток псевдомицелия и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в таблицах 1 - 3.
| Наименование средств измерения | Названия документов |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799 |
| Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003 |
| Аспирационный бактериологический пробоотборник (со скоростью до 40 л/мин, расход регулируется по ротаметру, диаметр чашек Петри 90, 100, 120 мм, определение в диапазоне 25 — 10 000 кл./м3) | - |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование аппаратуры и материалов | Названия документов |
|---|---|
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (28 +/- 2) °C и (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060; ГОСТ Р 51935 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | - |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-908 |
| Петля бактериологическая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412 |
| Вата медицинская гигроскопическая | ГОСТ 25556 |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026 |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
| Наименование реактивов и питательных сред | Названия документов |
|---|---|
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
| Глюкоза | ГОСТ 6038 |
| Пептон сухой ферментативный | ГОСТ 13805 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652 или ГОСТ 18300 |
| Дрожжевой экстракт, сухой | ГОСТ 17206 |
Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений концентрации клеток гриба в атмосферном воздухе городских и сельских поселений необходимо соблюдать санитарно-эпидемиологические требования <3> и правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005.
6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VII. Условия измерений
7.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
- <a id="p100118"></a>температура воздуха (20 +/- 5) °C;
- <a id="p100119"></a>атмосферное давление 760 +/- 20 мм рт. ст.;
- <a id="p100120"></a>влажность воздуха не более 80%.
VIII. Приготовление глюкозо-пептон-дрожжевого агара (YPD)
8.1. Для приготовления глюкозо-пептон-дрожжевого агара используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1000 см3): пептон — 20,0 г, глюкоза — 20,0 г, дрожжевой экстракт — 10,0 г, агар-агар — 20,0 г, дистиллированная вода — 1000 см3.
8.2. Сухие компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.
8.3. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.
8.4. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C в течение не более 10 дней.
IX. Проведение измерения
9.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с методическими документами <4>.
<4> МУК 4.2.1054-01 «Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест» и ГОСТ Р 8.563 «Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Методики (методы) измерений».
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Время и скорость отбора проб воздуха
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (YPD) расплавляют, остужают до 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.
Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методами контроля <5>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 — 8) °C не более 10 дней.
<5> Пункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» (далее — МУК 4.2.2316-08).
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой 28 +/- 2 °C. Через 1 — 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с ростовыми свойствами питательных сред <6>. Для этого музейный штамм Pichia pastoris БРЦ ВКПМ Y-4465 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
<6> МУК 4.2.2316-08.
Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
X. Вычисление результатов измерения
10.1 Расчет концентрации клеток производят по формуле:
\text{К } = \frac{\text{П } \times 1000}{\text{С } \times \text{Т}} ,
где К — концентрация штамма в воздухе, клеток/м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета дм3 на м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, дм3/мин;
XI. Оформление результатов измерений
11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, приведенным в приложении к МУК.
Приложение к МУК 4.2.3599-20 (рекомендуемый образец)
Протокол № количественного микробиологического анализа штамма Pichia pastoris БРЦ ВКПМ Y-4465 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений
1. <a id="p100181"></a>Дата проведения анализа ____________________________________________
2. <a id="p100182"></a>Рабочее место (профессия работающего) ______________________________
3. <a id="p100183"></a>Место отбора пробы (название и адрес организации, производство,
технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________
4. <a id="p100184"></a>Вид пробоотборника _________________________________________________
5. <a id="p100185"></a>Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб
6. <a id="p100186"></a>Питательная среда, время инкубации _________________________________
7. <a id="p100187"></a>Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ____________
8. <a id="p100188"></a>Количественная и качественная характеристика выросших колоний
(количество типичных колоний) _____________________________________________
9. <a id="p100189"></a>Результаты идентификации микроорганизмов Pichia pastoris БРЦ ВКПМ
Y-4465 (микроморфологические признаки) ____________________________________
10. <a id="p100190"></a>Результаты расчета концентрации штамма ____________________________
11. <a id="p100191"></a>Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКа.в. ______________
12. <a id="p100192"></a>Отбор пробы произведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________
13. <a id="p100193"></a>Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (Ф.И.О.,
должность, дата, подпись) _________________________________________________